הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בשיטה יעילה להשגת מידע מקבילי ממספר רקמות עבור ביטוי חלבונים בפרויקט בעל תפוקה גבוהה, כגון ה-human protein atlas. דבר זה מושג תחילה על ידי בחירת אזורים מייצגים של רקמות מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפרפין. לאחר מכן, אזורים מסומנים נדגמים באמצעות מחורר (punch), והליבות שנבחרו מאוגדות לתוך בלוק פרפין יחיד, המכונה מערך רקמות (tissue microarray).

לאחר מכן נחתכים חתכים מה-TMA ומתבצע אימונוהיסטוכימיה. לבסוף, דפוס ביטוי החלבון מנותח והנתונים מפורסמים במאגר החלבונים האנושי (human protein atlas). בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ביטוי חלבונים ברקמות ובתאים באמצעות מערכי רקמה זעירים (tissue microarrays) ואימונוהיסטוכימיה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביצוע אימונוהיסטוכימיה מבלוקים של רקמת פארנכימה בודדים, הוא שניתן לחסוך חומר ביולוגי בעל ערך והניסויים ניתנים לשחזור בצורה טובה יותר. יתרון נוסף של טכניקה זו הוא היכולת להפחית עלויות ENT וכן את זמן העיבוד במעבדה. את הפרוצדורה זו יעגים יאן קול ביי, טכנאי מעבדה מהמעבדה שלי, לצורך השגת אורך סטנדרטי של גלילי הרקמה.

סמנו את הסטיילט (stylet). מומלץ להשאיר שוליים של 2.5 עד 3.0 מילימטרים מכל צד של בלוק הפרפין כדי למנוע סדקים בפרפין בעת התקנת המנקבים המתאימים. שחררו את ברגי ה-hex socket המחזיקים את המנקב במקומו ומקמו את המנקב כך שהחריץ במרכז המנקב יונח בחוזקה כנגד המוט המתכתי בבלוק ה-V הפלסטי.

הדק את הברגים, תוך וידוא שקצה התפס המתכתי נמצא במצב אופקי. הכנס את המחסור של המקבל משמאל ואת המחסור של התורם מימין. השתמש בכפתורי כיוונון ה-XY ובקריאות המיקרומטר הדיגיטליים שלהם כדי להזיז את המחסורים לאורך צירי X ו-Y.

כדי לאפס את המכונה, לחצו על כפתור ה-zero a BS כדי לעבור בין אינצ'ים למילימטרים, לחצו על כפתור ה-inch millimeter. כאשר משתמשים במחורר של 1 mm עבור תבנית של 9 על 8, המרווח בין החורים צריך להיות 2 mm כפי שנמדד בין מרכזי החורים כדי למנוע דחיפה רבה מדי של המחורר המקבל ומניעת נזק למחורר; הגדירו את העומק המקסימלי לדחיפת המחורר על ידי הנחת קסטה ריקה במחזיק ושימוש בבורג הגבלת העומק בפינה השמאלית העליונה של מדריך ה-Z, הגדירו את מיקום התחתון של המחורר המקבל ל-1 mm מעל תחתית הקסטה. לאחר בחירה וסימון של האזור הרלוונטי בחתך רקמה ותכנון תבנית להפקת מערך מיקרו של רקמות (tissue microarray), הניחו את בלוק המקבל במחזיק והשתמשו במברג הקטן ביותר כדי להדק את הברגים.

הימנעו מהדקה מוגברת של הברגים כדי למנוע מהפראפין להשתחרר מהקסטה. דחפו את המנקב המקבל כלפי מטה כ-5 mm אל תוך בלוק המקבל, והשתמשו בידית המנקב כדי לסובב אותו הלוך ושוב. לאחר מכן, שחררו לאט את לחץ הדחיפה כלפי מטה כדי שהקפיצים יוכלו להעלות את המנקב חזרה.

השתמש בסגנון כדי לרוקן את המחורר ולהשליך את גליל הפרפין. לאחר מכן, הזז את הצריח כדי לעבור למחורר התורם. בשלב הבא, מקם את גשר בלוק התורם, כאשר בלוק התורם נמצא מעל למחזיק בלוק המקבל.

השתמשו בנגב צבוע בהמטוקסילין ואוזין תואם, שבו סומן אזור העניין, כדי לאתר את הרקמה שיוצא ממנה הדגימה. החזיקו ידנית את בלוק התורב במקומו בעזרת יד שמאל ודחפו את המחורר (punch) בעזרת יד ימין. אין ללחוץ על המנדרין (stylet). מעצור העומק אינו חוסם את תנועת המחורר במיקום הנכון עבור בלוק התורב, לכן חשוב להפסיק את הדחיפה כאשר הסימון השני נראה על המנדרין.

סובב את הידית של המחורר פעם אחת באיטיות. שחרר את הלחץ כלפי מטה תוךما החזקת בלוק התורם על גשר בלוק התורם. הסר את הגשר ואת בלוק התורם.

וודאו שמיקום מחורר התורם מיושר עם החור שנוצר קודם לכן. כוון את מיקום המחורר באמצעות הברגים המקבעים. אם מחורר התורם והחור בבלוק המקבל אינם מיושרים, דחפו בעדינות את המחורר כלפי מטה עד שקצהו יגיע לראש החור בבלוק המקבל.

תוך שמירה על תנוחה זו, השתמשו במחלול (stylet) כדי לרוקן את גלגול הרקמה אל תוך החור. פני השטח של הגלגול צריכים להיות בקו אחד עם פני השטח של הבלוק. החזירו את הצריח (turret) אל המחורר המקבל.

עברו לעמדה הבאה באמצעות כפתורי כוונון ה-XY וחזרו על הפעולה על ידי דגימת דגימה מבלוק המקבל עד להשלמת המערך. כדי להסיר את בלוק המקבל, שחררו את הברגים במחזיק. הניחו את הבלוק עם הפנים כלפי מטה על למסת זכוכית המונחת על מעמד מתאים, וחממו את הבלוק בטמפרטורה של 42 °C למשך 40 דקות.

הוציאו את השקף ואת הבלוק מהתנור, והחליקו את פני השטח של הבלוק על ידי העברה עדינה של השקף הזכוכית. הניחו את הבלוק יחד עם השקף הזכוכית על פלטת קירור למשך 10 דקות. הסירו את השקף הזכוכית מהבלוק.

הבלוק מוכן כעת לחיתוך. לאחר החיתוך, יש לבצע צביעה ודיגיטציה של מערך הרקמות (tissue microarray) באמצעות נוגדן לחלבון הנחקר. ניתן לחפש את החלבון במאגר החלבונים האנושי (human protein atlas) באמצעות אתר האינטרנט www.proteinatlas.org.

הזינו את שם חלבון העניין, את ה-ensemble id, את מספר הגישה (accession number) ב-UniProt או את שם ה-HGNC, לדוגמה, insulin. לחצו על חלבון העניין וגללו למטה לסעיף סיכום רקמות ואיברים נורמליים (normal tissue and organ summary). הסקירה מציגה את ביטוי החלבון בלבלב.

לחצו על הלשונית. נתונים נוספים על רקמות. תצוגת הרקמות הנורמליות הממוינת לפי איבר תופיע על המסך.

לחצו על הלבלב כדי לצפות בתוצאות ה-IHC עבור שלושה נוגדנים המכוונים לאותו חלבון. לחצו על תמונה כדי לצפות בתמונה ברזולוציה גבוהה של הלבלב. בדמות זו מוצגות דוגמאות לאיכות של מערכים מיקרוסקופיים של רקמות (tissue microarrays), מערך ישר ומיושר כראוי עם מספיק מרווח בין השורות והעמודות לבין שולי הפרפין. כאן, חלק מהליבות קרובות מדי לשוליים, מה שככל הנראה יגרום לבעיות במהלך החיתוך.

מערך רקמה (tissue microarray) זה נאפה זמן רב מדי וקרס ללא התבנית הנכונה. כאן, חיתוך שבוצע כראוי עם עמודות ישרות ומיושרות נצבע ב-hematoxylin ו-eosin. להב גרועה או מלוכלכת עלולה לגרום לפיצול כפי שמוצג כאן או לחיתוכים דחוסים כגון אלו.

תאי מרכז נבטיים בקשרי לימפה מראים נוגדן שסמיכותו כווננה באופן אופטימלי, מה שמוביל לצביעה ציטופלזמית ספציפית ללא רקע, כפי שניתן לראות כאן. צביעה שלילית או חלשה מופיעה כאשר ריכוז הנוגדן הראשוני נמוך מדי או אם חלבון המטרה אינו נוכח ברקמות שנצבעו אימונוהיסטוכימית. נתח רקמה זה נצבע באופן יתר בשל ריכוז גבוה מדי של נוגדן ראשוני.

הצבע הכהה גורם לקשיים בקביעת המיקום התת-תאי עקב זליגה (spillover), תגובת צולבת ותוצאות חיוביות שגויות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן להכנת מערך סימני רקמה (tissue marker array) ואופן השימוש בו בעת ניתוח ביטוי חלבונים באמצעות ביצוע אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הדפדוף באטלס החלבונים האנושי (human protein atlas) כדי לבחון ביטוי חלבונים ברקמות ובתאים אנושיים.