ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתיל רבב (explant) של צינור עצבי גבי (dorsal neural tube) מעובר של סלוקי (quail) לתוך עובר של תרנגולת בשלב התפתחותי תואם, וזאת כדי לעקוב אחר נדידתן וגורלן של תאי הרכס העצבי (neural crest cells). דבר זה מושג תחילה על ידי קרע חור קטן בממברנה של ה-IGN של עובר התרנגולת המארח כדי להגיע לצינור העצבי. לאחר מכן, עובר הסלוקי התורם מוצא מהביצה שלו כדי להכינו לחיתוך השתל.

בשלב הבא, מוציאים את אזור העניין מהצינור העצבי של עובר המארח. לאחר מכן, מוציאים אזור דומה מהצינור העצבי של התורם לצורך השתלה. לבסוף, משבחים את הצינור העצבי של התורם אל תוך הצינור העצבי של המארח.

לבסוף, העובר הכימרי מדגיר עד לשלב הרצוי לצורך זיהוי תאי רב-עצב (neural crest) שהגיעו לאיבר הנבחר. בסופו של דבר, ניתן להוות ויזואליזציה של נדירה והבידלות של תאי רב-עצב מהתורם למיקומים שונים בעובר המארח באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלורסצנציה. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי המיקרו-דיסקציה וההשתלה דורשים מיומנויות מוטוריות עדינות מאוד, מה שהופך אותם לקשים ללמידה.

התחילו בשטיפת שאריות לכלוך מביצי האפרוחים במים פושרים. סדרו את הביצים בצורה אופקית על מגש, ולאחר מכן סמנו בעפרון את הצדדים הפונים כלפי מעלה כדי לציין את האזור שבו ימוקם העובר. לצורך הכנת עוברים תורמים בשיטת X ovo, דגרו את רגלי הבבקים כאשר הצד הקה פונה כלפי מטה.

בשלב הבא, הניחו את הביצים באינקובטור לח עם טמפרטורה של 38 degrees Celsius והפעילו את פונקציית הנדנוד (rocking). לאחר סיום הדגירה, סטריליזו את החלקים העליונים על ידי רסס של 70% ethanol ולאחר מכן ניגוב מהיר בעזרת Kim wipe. כדי למנוע ספיגה דרך קליפת הביצה, הניחו כל ביצה שעברה סטריליזציה על תושבת ביצים נפרדת, בדומה לפטריית ה-Petri המרופדת ב-Kim wipes מקופלים כפי שניתן לראות כאן. לאחר מכן, באמצעות פינצטה סטרילית מסוג AA, צרו חור קטן במשטח העליון של קליפת הביצה בקצה החד של הביצה.

ציידו מזרק של 5 ml במחט תת-עורית במידה 18.5. לאחר מכן, כאשר השיפוע פונה לקצה החד של הביצה, הכניסו את המחט בצורה אנכית לתוך החור בקליפת הביצה. כדי למנוע פגיעה מקרית בחלמון עקב יניקה, נקו את החור עם 70% ethanol כפי שנעשה קודם לכן, ואטמו את החור בסרט דביק.

לאחר מכן, באמצעות פינצטה כפולה A, הקשו חור נוסף במשטח העליון המסומן של הרגל האופקית, לא בדיוק בנקודת השיא. בשלב הבא, הכניסו צד אחד של פינצטת איריס מעוקלת לתוך החור במקביל לביצה. לחצו על הקליפה תוך כדי תנועה סיבובית.

צרו חלון בקוטר של שני סנטימטרים בקליפת ביצת העוף, והשליכו את חלק הקליפה שהוסר. העובר אמור להופיע כסמיך ועמום על גבי החלמון. השליכו ביצים שאינן מאובחנות כפוריות, המזוהות על ידי נקודה לבנה קטנה על פני החלמון או בהיעדר ה-blastoderm.

כעת, תוך כדי הגנה מתאימה על העיניים, כופפו מחט היפודרמית במידה של 26.5 בזווית של 45 מעלות, החל מבסיס המחט. לאחר חיבור המחט הכפופה למזרק של 1 מיליליטר, כאשר הצד השחז (bevel) פונה כלפי מעלה, מלאו את המחט בדיו אינדיה (India ink) מדולל. נקבו את קרום החלמון מחוץ להיקף הבלסטר (blaster), והחליקו את קצה המחט מתחת לעובר, קרוב לפני השטח של החלמון, אך לא בתוך השכבות העובריות.

לאחר מכן, הזרים כמות קטנה של דיו כדי להקיף את העובר, תוך הימנעות מהזרקת בועות. הוצא את המחט בזהירות. כעת, השתמש במיקרוסקופ סטריאומטרי ובמקור אור בעל עומס חום נמוך, כגון מנורת הסיב האופטי בעלת זרוע גמישה המוצגת כאן.

סווגו את העוברים לפי שיטת hamburger and Hamilton. רשמו את השלב על קליפות הביצים. לאחר מכן, טפטפו שתיים עד שלוש טיפות של תמיסת ringer סטרילית וחמה על פני העוברים כדי למנוע התייבשות וזיהום.

לאחר מכן, מתחו פארא-פילם (para film) מעל פני הביצים כדי לאטום את החלונות באופן זמני. בשלב הבא, הכינו את ביצי השלוא להשתלה. לפני הוצאת הביצים מהדגירה, מלאו צלחת פטרי בתמיסת רינגר.

לאחר מכן, פתחו את הביצים בצד הקה באמצעות פינצטה מעוקלת כדי לחשוף את העובר. בעזרת מספרי ניתוח, בצעו ארבעה חתכים בצורת ריבוע דרך קרום ה-vili וה-blaster derm מחוץ לעובר, תוך וידוא שכל החתכים נפגשים. לאחר מכן, בעזרת פינצטת איריס מעוקלת, אחזו בעדינות באחד מקצות החתך, הרימו את העובר מהביצה והעבירו אותו לפטריית ה-petri המוכנה.

לבסוף, הסירו בעדינות את הקרומי הויטליני (vitelline membrane) באמצעות פינצטה מספר 5, ולאחר מכן הניחו את העוברים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הסירו את ה-parafilm מעובר האפרוח המארח. לאחר מכן, בעזרת מחט טונגסטן מחודדת, פתחו חור קטן בקרומי ה-VII באזור הרצוי של הפורה העצבית (neural tube).

הוסיפו טיפה של תמיסת רינגר לעובר. לאחר מכן, עבור השתלות חד-צדדיות, כפי שמתבצע בסרטון זה, השתמשו במחט זכוכית משוחששת כדי לבצע בזהירות חתכים רוחביים רוסטרליים וקודאליים באזור המוח האמצעי של צינור העצב, ללא חריגה מעבר ללומן. לאחר מכן, בצעו חיתוך דו-צדדי בין צינור העצב הגבי לבין המזודרמה הפריאטלית.

לבסוף, הפר בעדינות את ה-ex explan שנכרת מהצינור העצבי, ולאחר מכן הוצא אותו מהעובר על ידי שאיבה לתוך מיקרו-פיפט מזכוכית. ראשית, השתמש בעובר של שליו (quail) תואם בשלב ההתפתחותי. לאחר מכן, כרט אזור בצינור העצבי בגודל דומה לזה שהודגם זה עתה, ושאב את ה-X explan התורם לתוך מיקרו-פיפט מזכוכית המכיל תמיסת רינגר (ringers solution).

העבר את ה-X explan לסמוך לאזור שהוצא מהאפרוח המארח. לאחר מכן, באמצעות מחט זכוכית דקה, כוון את ה-ex explan על ידי הובלה עדינה שלו אל תוך האזור שעבר אבלציה. הוסף בזהירות מספר טיפות של תמיסת רינגר לעובר כדי למנוע התייבשות.

לבסוף, אטמו את החלון באמצעות סרט דביק, תוך הבטחה שהסרט אוטם את כל אזור החלון בביצה, והחזירו את הביצה לדגירה עד לשלב הרצוי; כבו את פונקציית הנדנוד בזמן דגירת הקיורות (kyira), כאשר ניתן לסובב את ה-X בעדינות ביד פעמיים ביום כדי להגביר את סיכויי ההישרדות שלהם. אם המטרה היא שלבים מאוחרים יותר של התפתחות, תמונה מייצגת זו של האזור המוטשת בצינור העצבי לאחר שש שעות של דגירה חוזרת עד לשלב HH 11, מראה את השילוב הצפוי של רקמת התורם של השלוקית לתוך צינור העצבי של אפרוח המארח. חתך רוחבי זה דרך האזור המוטשת בשלב HH 11 מראה תאי רשת עצבית (neural crest) המסומנים ב-hnk, כאשר תא אחד נודד לצדדים הרחק מהצינור העצבי.

תאי סלוקי התורמים לזרם הנדידה של תאי הרבב העצבי (neural crest) ולצינור העצבי מסומנים בבירור באמצעות QCPN. בשלבים מאוחרים יותר, ניתן לעקוב אחר תאים שמקורם בתאי הרבב העצבי של הסלוק עד לרקמת היעד הסופית שלהם. כפי שניתן לראות בדמות זו, תאים המסומנים ב-QCPN מפוזרים בתוך תהליך הלסת העליונה (maxillary process) של עובר האפרוח ביום 5 (E5). ניתן לשלב בקלות את הנוגדן QCPN עם נוגדיים אחרים כדי לבחון את התמיינותם של תאי הרבב העצבי שמקורם בסלוק.

בסביבת המאכסן. כפי שניתן לראות כאן, נוירונים תחושתיים של עצב הטריגמינג, שנגזרו מתאי רכס עצבי של שליו, מסומנים על ידי נוגדני QCPN ו-T UJ one. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה והיברידיזציה באתר (in situ hybridization) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מאילו רקמות נוצרים תאי רכס עצבי, ואילו גנים מבטאים תאי רכס עצבי בעודם מבדילים לרקמות שונות.