ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות
7 בפברואר 2012
הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתיל תצוגה עצבית גבית מעובר שליו לעובר עוף תואם בשלבים, כדי להתחקות אחר הנדידה והגורל של תאי הפסגה העצבית. זה מושג על ידי קריעת חור קטן בקרום ה-IGN של עובר התרנגולת המארח כדי לגשת לצינור העצבי. לאחר מכן מוציאים את עובר השליו התורם מהביצית שלו כדי להכין אותו לכריתת השתל.
בשלב הבא, אזור העניין נכרת מהצינור העצבי של העובר המארח. לאחר מכן נכרת אזור דומה מהצינור העצבי של התורם להשתלה. לאחר מכן, הצינור העצבי של התורם מושתל בצינור העצבי המארח.
לבסוף, העובר הכימרי מודגר לשלב הרצוי לזיהוי תאים שהגיעו לפסגה העצבית באיבר הנבחר. בסופו של דבר, ניתן לדמיין את הנדידה וההתמיינות של תאי פסגה עצבית שמקורם בתורם למיקומים שונים בעובר המארח באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי המיקרו-דיסקציה וההשתלה דורשים מיומנויות מוטוריות עדינות מאוד, מה שמקשה על למידת המיומנויות הללו.
התחל בשטיפת כל פסולת מביצי הגוזל במים פושרים. מסדרים את הביצים בצורה אופקית על מגש ואז מסמנים את הצדדים כלפי מעלה בעיפרון כדי לציין את האזור בו העובר ימוקם. להכנת X ovo של עוברים תורמים, דגרו על רגלי השליו בצד הקהה.
לאחר מכן, הניחו את הביצים באינקובטור לח של 38 מעלות צלזיוס והפעילו את פונקציית הנדנדה. לאחר סיום הביצים, הדגירה מעקרת את החלקים על ידי ריסוס באתנול 70% ולאחר מכן ניגוב במהירות עם מגבון קים כדי למנוע ספיגה דרך הביצה, הקליפה מניחה כל ביצה מעוקרת על מחזיק ביצים בודד, בדומה לצלחת הפטרי מרופדת במגבוני קים מקופלים שנראית כאן. לאחר מכן בעזרת מלקחיים מעוקרים של AA, הקש חור קטן על המשטח העליון של קליפת הביצה בקצה המחודד של הביצה.
הצטיידו במזרק של חמישה מיליליטר במחט היפודרמית בגודל 18 וחצי. לאחר מכן, כשהשיפוע פונה לקצה המחודד של הביצה, הכנס את המחט אנכית לתוך החור בקליפת הביצה. כדי למנוע פגיעה בטעות בחלמון באמצעות יניקה, נקו את החור עם אתנול 70% כמו קודם ואטמו את החור עם סקוטש.
ואז בעזרת מלקחיים A כפולים, הקש חור נוסף על המשטח העליון המסומן של הרגל האופקית, לא ממש בקודקוד. לאחר מכן, הכנס צד אחד של מלקחיים הקשתית המעוקלת לתוך החור המקביל לביצה. לאחר מכן פגז צובט את הקליפה ועובד בתנועה סיבובית.
שוברים חלון בקוטר שני סנטימטרים בביצת העוף, הקליפה זורקים את קליפת הביצה שהוסרה. העובר צריך להופיע כדיסק אטום על גבי החלמון. השליכו ביצים לא מופרות שזוהו על ידי כתם לבן קטן על פני החלמון או היעדר עור הפיצוץ.
כעת, תוך כדי לבישת מגן עיניים מתאים, כופפו מחט היפודרמית בגודל 26 וחצי בזווית של 45 מעלות החל מבסיס המחט. לאחר חיבור הצד המשופע של המחט הכפופה כלפי מעלה למזרק של מיליליטר אחד, מלאו את המחט בדיו הודי מדולל. נקבו את קרום החלמון מחוץ להיקף הפיצוץ, והחליקו את קצה המחט מתחת לעובר, קרוב לפני השטח של החלמון, אך לא בשכבות העובריות.
לאחר מכן הזריק מספיק דיו כדי לתאר את העובר והימנע מהזרקת בועות כלשהן. משוך בזהירות את המחט. כעת באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ומקור אור עם עומס חום מוגבל, כמו מנורת צוואר האווז של סיבים אופטיים המוצגת כאן.
שלב את העוברים לפי המבורגר והמילטון. הקליטו את הבמה על קליפות הביצים. לאחר מכן מרחו שתיים עד שלוש טיפות של תמיסת רינגר סטרילית חמה על פני העוברים כדי למנוע התייבשות וזיהום.
לאחר מכן מתחו את סרט הפרה על פני הביצים כדי לאטום זמנית את החלונות. לאחר מכן, הכינו את ביצי השליו להשתלה. לפני שמוציאים את הביצים מהחממה, מלאו צלחת פטרי בתמיסת צלצול.
לאחר מכן פתח את הביצים בצד הבוטה בעזרת מלקחיים מעוקלים כדי לחשוף את העובר. בעזרת מספריים מנתחים מבצעים ארבעה חתכים בצורת ריבוע דרך קרום הווילי ועורם הפיצוץ מחוץ לעובר, ומוודאים שכל החתכים נפגשים. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים מעוקלים, אחזו בעדינות בקצה חתוך אחד והרימו את העובר מהביצה והעבירו אותו לצלחת הפטרי המוכנה.
לבסוף, הסר בעדינות את קרום הוויטלין בעזרת מלקחיים מספר חמש, ולאחר מכן ביים את העוברים תחת מיקרוסקופ מנתח. הסר את סרט הפרה מעובר האפרוח המארח. לאחר מכן בעזרת מחט טונגסטן מושחזת, קרעו חור קטן בקרום VII באזור הרצוי של הצינור העצבי.
הוסף טיפה של תמיסת צלצול לעובר. לאחר מכן, עבור השתלות חד צדדיות, כמו זו המבוצעת בסרטון זה, השתמש במחט זכוכית יצוקה כדי לבצע בזהירות חתכים רוחביים וקורדליים לאזור המוח התיכון של הצינור העצבי, ולא להתרחב מעבר ללומן. לאחר מכן חותכים דו-צדדית בין הצינור העצבי הגבי למזודרם הפריאלי.
לבסוף, הפרד בזהירות את האקס אקספלן שנכרת מהצינור העצבי, ולאחר מכן הסר אותו מהעובר על ידי שאיבתו למיקרו פיפטה מזכוכית. ראשית, השתמש בעובר שליו תואם שלב. לאחר מכן כרתו אזור בגודל דומה של צינור עצבי כפי שהוצג זה עתה ושאבו את ה-X של התורם לתוך מיקרו-פיפטה מזכוכית המכילה תמיסת צלצולים.
העבירו את תצוגה ה-X הסמוכה לאזור הכריתה של מארח הגוזל. לאחר מכן, בעזרת מחט זכוכית משוכה, כוון את האקס-אקספליש בעדינות והנח אותו לאזור המכוסה. הוסף בזהירות כמה טיפות של תמיסת רינגר לעובר כדי למנוע התייבשות.
לבסוף, אטמו את החלון בנייר דבק, וודאו שהסרט אוטם את כל אזור הביצה עם החלון, החזירו את הביצה לאינקובטור עד לשלב הרצוי, כבו את פונקציית הנדנדה בזמן הדגירה של הקירה, ניתן לסובב את ה-X בעדינות ביד פעמיים ביום כדי להגביר את כדאיותם. אם ממוקדים שלבים מאוחרים יותר של התפתחות, תמונה מייצגת זו של האזור המושתל של הצינור העצבי לאחר שש שעות של דגירה מחדש ל-HH 11, מראה את השילוב הצפוי של רקמת תורם השליו המושתלת בצינור העצבי של אפרוח המארח. חתך רוחב זה דרך האזור המושתל ב-HH 11 מראה תאי פסגה עצבית המסומנים ב-hnk, אחד נודד לרוחב הרחק מהצינור העצבי.
תאי שליו התורמים לזרם הנדידה של תאי הפסגה העצבית ולצינור העצבי מסומנים בבירור ב-QCPN. בשלבים מאוחרים יותר, ניתן לאתר תאים שמקורם בתאי פסגה עצבית של שליו לרקמת המטרה הסופית שלהם. כפי שניתן לראות באיור זה, תאים המסומנים ב-QCPN שזורים בתוך עובר הגוזל מין צ'י של התהליך המקסילרי ב-E חמש, ניתן לשלב בקלות את נוגדן ה-QCPN עם נוגדנים אחרים כדי לבחון את ההתמיינות של תאי פסגה עצבית שמקורם בשליו.
בסביבה המארחת. כפי שניתן לראות כאן, נוירונים חושיים טריגמינליים שמקורם בתאי פסגה עצבית של שליו מסומנים על ידי נוגדנים QCPN ו-T UJ one. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה והכלאה באתרה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו רקמות מולידים תאי נוירו-קרסט, ואילו גנים מבטאים תאי נוירו-קרסט כשהם מתמיינים לרקמות שונות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הנדידה וגורלם של תאי רב-עצביים (neural crest cells) של עופות בעוברי כימרה של שליו ותרנגול. הטכניקה מאפשרת מעקב אחר תאים אלה במהלך נדידתם ודיפרנציאצייתם, דבר המהווה אתגר בעוברי תרנגול שלא עברו מניפולציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה
רקע
- תאי רב-עצביים (Neural crest cells) חיוניים להתפתחותן של מבנים שונים בחולייתנים.
- מעקב אחר נדידתם מסייע להבנת תפקידם בהתפתחות העוברית.
- עוברי כימרה מהווים מודל ייחודי לחקר גורל התא.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא להבדיל ביעילות בין תאים אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה פשוטה למעקב אחר תאי רב רבדיים (neural crest cells).
- ניתוח דפוסי הנדידה של תאים אלו בסביבה מבוקרת.
- שיפור ההבנה של תהליכי ההבדלה של תאי רב רבדיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתרה של תרבית (explant) מהצינור העצבי הגבי של עובר שלו בהוואי לתוך עובר של תרנגולת.
- יצירת חור קטן בממברנה של ה-IGN בעובר המארח לצורך גישה.
- חליצה של אזורי עניין הן מעובר המארח והן מעובר התורם.
- השתלה של הצינור העצבי של התורם לתוך הצינור העצבי של המארח.
תוצאות עיקריות
- השיטה עוקבת בהצלחה אחר נדידתם של תאי הרב רשת העצבית (neural crest cells).
- עוברי כימרה מראים דפוסי בידול ברורים.
- התוצאות מעידות על היתכנותה של טכניקה זו למחקרים עתידיים.
- יישומים פוטנציאליים להבנת הפרעות התפתחותיות.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת שיטה מהימנה לחקר הדינמיקה של תאי הרב נרב (neural crest cells).
- היא פותחת אפשרויות למחקרים נוספים בביולוגיה של ההתפתחות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על שיטה זו כדי לחקור תופעות קשורות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השתלה של צינור עצבי בין מינים בעוברים של עופות מאפשרת מעקב מדויק אחר שושלות ומיפוי גורל של תאי רגב עצבי, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מספקת תובנות ברזולוציה גבוהה לגבי נדידת תאים,התמיינות ותבניתיות מוקדמת, המכוונות אסטרטגיות של תיקוף מטרות ומידול מחלות. הסתגלנותה של השיטה ותשומותיה הכמותיות ממצבים אותה כפלטפורמה רב-פעמית עבור ביולוגיה התפתחותית ומסלולי מחקר תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות התפתחותיות באמצעות מעקב אחר נדידה וגורל של תאי רב רכמיים (neural crest cells).
- תומך בהסרת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של שושלת תאים ותוצאות התמיינות.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי חשיפת דפוסי עיצוב מקדימים (pre-patterning) ספציפיים לאזור והשפעות סביבתיות.
- מספק ביטחון חיזוי לצורך תעדוף תיקי פיתוח על ידי הבהרת מנגנוני התפתחות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות כימריות עוברות תיקוף עבור סריקת פנוטיפ ומחקרי הפרעה (perturbation) בהמשך התהליך.
- מסטנדרט את בדיקות מיפוי הגורל באמצעות סימון ספציפי למין ופרוטוקולי השתלה הניתנים לשחזור.
- מאפשר הערכה כמותית של נקודות קצה של נדידה ודיפרנציאציה באמצעות אימונופלורסצנציה וסמני נוגדנים.
- תומך בהתאמה ניתנת להרחבה (scalable) לסריקת תרכובות או הפרעות גנטיות בהקשרים התפתחותיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למודלים רלוונטיים למחלות על ידי מתן אפשרות למניפולציה של סביבות תאי רב השבטים (neural crest) ורקעים גנטיים.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תוצרי מיפוי גורל ומעקב אחר שושלות תאים.
- מפחית סיכונים בקידום תרגומי על ידי הבהרת התרומות של סוגי תאים שונים לאורגנוגנזה ולתבניות התפתחותיות.
- תומך בזיהוי סמנים ביולוגיים על ידי שילוב מעקב אחר תאים עם אימונוהיסטוכימיה ואנליזת ביטוי גנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו להשתלה ומעקב משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת בבדיקת היפותזות, הפחתת סיכונים מכניסטיים והמשכיות תרגומית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקה מונחית-היפותזה של מקור, נדידה וגורל של תאי הרכס העצבי (neural crest) במערכת מבוקרת.
- סריקה: מספקת מודלים כימריים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת הפרעות גנטיות או מולקולריות.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות באמצעות אימונופלואורסצנציה וזיהוי תאים מבוסס נוגדנים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מעקב אחר שושלות התפתחותיות לבין מידול מחלות וגילוי סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה וחסכונית הניתנת להתאמה למספר מינים ולשאלות ניסוייות שונות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות התפתחותיות.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה להשתלה ומעקב.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרה מוקדמת של מנגנוני התפתחות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים וקידום של מטרות ומודלים הרלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של מיקרו-דיסקציה והשתלה עוברית.
- נדרשת גישה לתשתית של סטריאומקרוסקופיה, אימונופלואורסצנציה וסימון בנוגדנים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה למערכות מודל של עופות ומערכות נבחרות של יונקים ליישום רחב יותר.
- מוגבל על ידי דרישות מיומנות טכנית ותאימות מינים עבור השתלת כימרות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Incubate Chick and Quail Eggs to the Desired Stage
1:57
Prepare Eggs for Windowing and Dissection
6:15
Grafting the Tissue
7:21
Immunofluorescent Detection of Quail-specific Nuclear Antigen QCPN in Donor-derived Cells in the Chimeric Embryo
8:35
Conclusion
