ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות
7 בפברואר 2012
הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשבץ רפסת (explan) של צינור עצבי גבי (dorsal neural tube) מעובר של שליו (quail) לתוך עובר של תרנגולת בשלב התפתחותי תואם, וזאת על מנת לעקוב אחר נדידתם וגורלם של תאי רבב עצבי (neural crest cells). פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי קריעה של חור קטן בממברנת ה-IGN של עובר התרנגולת המארח כדי להגיע לצינור העצבי. לאחר מכן, עובר השליו התורם מוצא מהביצה שלו כדי להכינו לחיתוך השבץ.
בשלב הבא, מוציאים את אזור העניין מהפרוטובוס (neural tube) שלו של העובר המארח. לאחר מכן, מוציאים אזור דומה מהפרוטובוס של התורם לצורך השתלה. לבסוף, משתילים את הפרוטובוס של התורם אל תוך הפרוטובוס של המארח.
לבסוף, העובר הכימרי מדוגר עד לשלב הרצוי לצורך זיהוי תאי רב-עצביים (neural crest) שהגיעו לאיבר הנבחר. בסיכומו של דבר, ניתן להדגים את הנדידה וההבדלה של תאי רב-עצביים מהתורם למיקומים שונים בעובר המארח באמצעות מיקרוסקופיה של פלואורסצנציה עקיפה (immunofluorescence microscopy). הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי המיקרו-דיסקציה וההשתלה דורשים מיומנויות מוטוריות עדינות מאוד, דבר המקשה על למידתם.
התחילו בשטיפת לכלוך מביצי האפרוחים במים פושרים. סדרו את הביצים בצורה אופקית על מגש, ולאחר מכן סמנו בעיפרון את הצד הפונה כלפי מעלה כדי לציין את האזור שבו ימוקם העובר. להכנת עוברים תורמים בשיטת X ovo, דגרו את רגלי השלשול בצד הקהה.
בשלב הבא, הניחו את הביצים באינקובטור לח 38 degrees Celsius והפעילו את פונקציית הנדנוד. לאחר סיום הדגירה, סטרליז करें את החלקים העליונים על ידי ריסוס 70% ethanol ולאחר מכן ניגוב מהיר באמצעות Kim wipe. כדי למנוע ספיגה דרך קליפת הביצה, הניחו כל ביצה שעברה סטריליזציה על מעמד ביצים בודד, בדומה לצלח פטרי המרופד ב-Kim wipes מקופלים כפי שניתן לראות כאן. לאחר מכן, באמצעות פינצטה סטרילית מסוג AA, צרו חור קטן במשטח העליון של קליפת הביצה בקצה המחודד שלה.
ציידו מזרק של 5 mL במחט תת-עורית במידה 18.5. לאחר מכן, כאשר שיפוע המחט פונה לעבר הקצה החד של הביצה, הכניסו את המחט בצורה אנכית אל תוך החור בקליפת הביצה. כדי למנוע פגיעה מקרית בחלמון כתוצאה משאיבה, נקו את החור עם 70% ethanol כפי שנעשה קודם לכן ואטמו את החור באמצעות סרט דביק.
לאחר מכן, בעזרת פינצטת double A, פתחו חור נוסף במשטח העליון המסומן של הרגל האופקית, לא בדיוק בשיא הגובה. בשלב הבא, הכניסו צד אחד של פינצטת iris מעוקלת אל תוך החור במקביל לביצה. לאחר מכן, צבטו את הקליפה כלפי מטה תוך כדי תנועה סיבובית.
צרו חלון בקוטר של שני סנטימטרים בקליפת ביצת התרנגולת, והשליכו את חלק הקליפה שהוסר. העובר אמור להופיע כדסק אטום על גבי החלמון. השליכו ביצים שאינן מופרות, שניתן לזהותן לפי נקודה לבנה קטנה על פני השטח של החלמון או על ידי היעדר ה-blastoderm.
כעת, בעודכם עוטים מיגון עיניים מתאים, כופפו מחט היפודרמית במידה 26.5 בזווית של 45 מעלות, החל מבסיס המחט. לאחר חיבור המחט הכפופה למזרק של 1 ml, כאשר צד הפיה פונה כלפי מעלה, מלאו את המחט בדיו אינדיה מדולל. דקרו את קרום החלמון מחוץ להיקף הבלסטר, והחליקו את קצה המחט מתחת לעובר, קרוב לפני השטח של החלמון, אך לא בתוך השכבות העובריות.
לאחר מכן, הזרקו כמות קטנה של דיו שרק תסמן את קווי המתאר של העובר, תוך הימנעות מהזרקת בועות אוויר. הוציאו את המחט בזהירות. כעת השתמשו במיקרוסקופ סטריאומטרי ובמקור אור עם עומס חום מוגבל, כגון מנורת הסיב האופטי עם הזרוע הגמישה המוצגת כאן.
סווגו את העוברים לפי שיטת Hamburger and Hamilton. רשמו את השלב על קליפות הביצים. לאחר מכן, טפטפו שתיים עד שלוש טיפות של תמיסת Ringer סטרילית וחמימה על פני העוברים כדי למנוע התייבשות וזיהום.
לאחר מכן, מתחו פאראפילם (para film) מעל פני הביצים כדי לאטום את החלונות באופן זמני. בשלב הבא, הכינו את ביצי השלה להשתלה. לפני הוצאת הביצים מהדגירה, מלאו צלחת פטרי בתמיסת רינגר (ringer solution).
לאחר מכן, פתחו את הביצים בצד הקה באמצעות פינצטה מעוקלת כדי לחשוף את העובר. בעזרת מספרי ניתוח, בצעו ארבעה חתכים בצורת ריבוע דרך קרום ה-vili וה-blaster derm מחוץ לעובר, תוך וידוא שכל החתכים נפגשים. לאחר מכן, בעזרת פינצטת איריס מעוקלת, אחזו בעדינות באחד מקצוות החתך, הרימו את העובר מהביצה והעבירו אותו לצחנית הפטרי המוכנה.
לבסוף, הסירו בעדינות את הקרום הוויטליני (vitelline membrane) בעזרת פינצטה מספר 5, ולאחר מכן קבעו את שלב ההתפתחות של העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. הסירו את ה-parafilm מעובר האפרוח המארח. לאחר מכן, באמצעות מחט טונגסטן מחודדת, קרעו חור קטן בקרום הוויטליני באזור הרצוי של צינור העצבים.
הוסיפו טיפה של תמיסת רינגר לעובר. לאחר מכן, עבור השתלות חד-צדדיות, כזו המבוצעת בסרטון זה, השתמשו במחט זכוכית משחזת כדי לבצע בזהירות חתכים רוחביים, רוסטריים וקודאליים, באזור המוח האמצעי של צינור העצבים, ללא חריגה אל תוך הלומן. לאחר מכן, בצעו חיתוך דו-צדדי בין צינור העצבים הגבי למזודרם הפריאקסיאלי.
לבסוף, הפר בעדינות את ה-ex explan החתוך מהצינור העצבי, ולאחר מכן הוצא אותו מהעובר על ידי שאיבה לתוך מיקרו-פיפט מזכוכית. ראשית, השתמש בעובר של סלוקי (quail) תואם גיל. לאחר מכן, חתוך אזור מהצינור העצבי בגודל דומה לזה שהודגם כעת, ושאב את ה-X explan התורם לתוך מיקרו-פיפט מזכוכית המכיל תמיסת רינגר (ringers solution).
העבר את ה-X explan לסמוך לאזור שהוצא מגוף המארח (עוף). לאחר מכן, באמצעות מחט זכוכית דקה (pulled glass needle), כוון את ה-ex explan על ידי הובלה עדינה לתוך האזור שעבר אבלציה. הוסף בזהירות מספר טיפות של תמיסת רינגר לעובר כדי למנוע התייבשות.
לבסוף, אטמו את החלון בעזרת סרט דבק רחב, תוך וידוא שהסרט אוטם את כל אזור החלון בביצה, והחזירו את הביצה למדגרה עד לשלב הרצוי. כבו את פונקציית הנדנוד בזמן דגירת ה-kyira; ניתן לסובב את ה-X בעדינות ביד פעמיים ביום כדי להגביר את סיכויי ההישרדות שלהם. אם המטרה היא שלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות, תמונה מייצגת זו של האזור המורכב בצינור העצבי לאחר שש שעות של דגירה חוזרת לשלב HH 11, מראה את השילוב הצפוי של רקמת התורם של יונה בתוך צינור העצבי של אפרוח המארח. חתך רוחבי זה דרך האזור המורכב בשלב HH 11 מראה תאי רכס עצבי (neural crest cells) המסומנים ב-hnk, כאשר תא אחד נודד לצדדים הרחק מהצינור העצבי.
תאי שלוה התורמים לזרם הנדידה של תאי הרב רב-עצבי (neural crest), ולשפופת העצבים, מסומנים בבירור באמצעות QCPN. בשלבים מאוחרים יותר, ניתן לעקוב אחר תאים שנגזרו מתאי רב-עצבי של שלווה עד לרקמת היעד הסופית שלהם. כפי שניתן לראות בדמות זו, תאים המסומנים ב-QCPN מפוזרים בתוך ה-meen chi של עובר אפרוח בתהליך המקסילרי (maxillary process). ב-E5, ניתן לשלב בקלות את הנוגדן QCPN עם נוגדים אחרים כדי לבחון את הדיפרנציאציה של תאי רב-עצבי שנגזרו משלוה.
בסביבת המארח. כפי שניתן לראות כאן, נוירונים תחושתיים של העצב הטריגמי, שנגזרו מתאי רכס עצבי של שליו, מסומנים על ידי נוגדני QCPN ו-T UJ one. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון אימונוהיסטוכימיה והיברידיזציה באתר (in situ hybridization) על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון מאילו רקמות נוצרים תאי רכס עצבי, ואילו גנים מבטאים תאי רכס עצבי בעת התמיינותם לרקמות שונות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הנדידה וגורלם של תאי רב-עצביים (neural crest cells) של עופות בעוברי כימרה של שליו ותרנגול. הטכניקה מאפשרת מעקב אחר תאים אלה במהלך נדידתם ודיפרנציאצייתם, דבר המהווה אתגר בעוברי תרנגול שלא עברו מניפולציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה
רקע
- תאי רב-עצביים (Neural crest cells) חיוניים להתפתחותן של מבנים שונים בחולייתנים.
- מעקב אחר נדידתם מסייע להבנת תפקידם בהתפתחות העוברית.
- עוברי כימרה מהווים מודל ייחודי לחקר גורל התא.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא להבדיל ביעילות בין תאים אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה פשוטה למעקב אחר תאי רב רבדיים (neural crest cells).
- ניתוח דפוסי הנדידה של תאים אלו בסביבה מבוקרת.
- שיפור ההבנה של תהליכי ההבדלה של תאי רב רבדיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתרה של תרבית (explant) מהצינור העצבי הגבי של עובר שלו בהוואי לתוך עובר של תרנגולת.
- יצירת חור קטן בממברנה של ה-IGN בעובר המארח לצורך גישה.
- חליצה של אזורי עניין הן מעובר המארח והן מעובר התורם.
- השתלה של הצינור העצבי של התורם לתוך הצינור העצבי של המארח.
תוצאות עיקריות
- השיטה עוקבת בהצלחה אחר נדידתם של תאי הרב רשת העצבית (neural crest cells).
- עוברי כימרה מראים דפוסי בידול ברורים.
- התוצאות מעידות על היתכנותה של טכניקה זו למחקרים עתידיים.
- יישומים פוטנציאליים להבנת הפרעות התפתחותיות.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת שיטה מהימנה לחקר הדינמיקה של תאי הרב נרב (neural crest cells).
- היא פותחת אפשרויות למחקרים נוספים בביולוגיה של ההתפתחות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על שיטה זו כדי לחקור תופעות קשורות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השתלה של צינור עצבי בין מינים בעוברים של עופות מאפשרת מעקב מדויק אחר שושלות ומיפוי גורל של תאי רגב עצבי, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מספקת תובנות ברזולוציה גבוהה לגבי נדידת תאים,התמיינות ותבניתיות מוקדמת, המכוונות אסטרטגיות של תיקוף מטרות ומידול מחלות. הסתגלנותה של השיטה ותשומותיה הכמותיות ממצבים אותה כפלטפורמה רב-פעמית עבור ביולוגיה התפתחותית ומסלולי מחקר תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות התפתחותיות באמצעות מעקב אחר נדידה וגורל של תאי רב רכמיים (neural crest cells).
- תומך בהסרת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של שושלת תאים ותוצאות התמיינות.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי חשיפת דפוסי עיצוב מקדימים (pre-patterning) ספציפיים לאזור והשפעות סביבתיות.
- מספק ביטחון חיזוי לצורך תעדוף תיקי פיתוח על ידי הבהרת מנגנוני התפתחות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות כימריות עוברות תיקוף עבור סריקת פנוטיפ ומחקרי הפרעה (perturbation) בהמשך התהליך.
- מסטנדרט את בדיקות מיפוי הגורל באמצעות סימון ספציפי למין ופרוטוקולי השתלה הניתנים לשחזור.
- מאפשר הערכה כמותית של נקודות קצה של נדידה ודיפרנציאציה באמצעות אימונופלורסצנציה וסמני נוגדנים.
- תומך בהתאמה ניתנת להרחבה (scalable) לסריקת תרכובות או הפרעות גנטיות בהקשרים התפתחותיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למודלים רלוונטיים למחלות על ידי מתן אפשרות למניפולציה של סביבות תאי רב השבטים (neural crest) ורקעים גנטיים.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תוצרי מיפוי גורל ומעקב אחר שושלות תאים.
- מפחית סיכונים בקידום תרגומי על ידי הבהרת התרומות של סוגי תאים שונים לאורגנוגנזה ולתבניות התפתחותיות.
- תומך בזיהוי סמנים ביולוגיים על ידי שילוב מעקב אחר תאים עם אימונוהיסטוכימיה ואנליזת ביטוי גנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו להשתלה ומעקב משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת בבדיקת היפותזות, הפחתת סיכונים מכניסטיים והמשכיות תרגומית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקה מונחית-היפותזה של מקור, נדידה וגורל של תאי הרכס העצבי (neural crest) במערכת מבוקרת.
- סריקה: מספקת מודלים כימריים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת הפרעות גנטיות או מולקולריות.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות באמצעות אימונופלואורסצנציה וזיהוי תאים מבוסס נוגדנים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מעקב אחר שושלות התפתחותיות לבין מידול מחלות וגילוי סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה וחסכונית הניתנת להתאמה למספר מינים ולשאלות ניסוייות שונות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות התפתחותיות.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה להשתלה ומעקב.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרה מוקדמת של מנגנוני התפתחות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים וקידום של מטרות ומודלים הרלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של מיקרו-דיסקציה והשתלה עוברית.
- נדרשת גישה לתשתית של סטריאומקרוסקופיה, אימונופלואורסצנציה וסימון בנוגדנים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה למערכות מודל של עופות ומערכות נבחרות של יונקים ליישום רחב יותר.
- מוגבל על ידי דרישות מיומנות טכנית ותאימות מינים עבור השתלת כימרות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Incubate Chick and Quail Eggs to the Desired Stage
1:57
Prepare Eggs for Windowing and Dissection
6:15
Grafting the Tissue
7:21
Immunofluorescent Detection of Quail-specific Nuclear Antigen QCPN in Donor-derived Cells in the Chimeric Embryo
8:35
Conclusion
