Name: זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: למדו לבודד שותפי קשר חלבוניים באמצעות טיהור זיקה טנדם בקווי תאים HEC 293. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין נגיפים לתאים מארחים ולזהות גורמי תרגום מעורבים באתחול התרגום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי עמיתי הקרן Wellcome בכיר הוענק לד&quot;ר איאן גודפלו.

1. דור של שורות תאים: pMEP4 transfection / ביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect תאים עם וקטור pMEP4 ביטוי ובחר עם 100 מיקרוגרם של hygromycin B / מ&quot;ל ​​(Roche) עד שכל התאים transfected מדומים נהרגו מעל. PMEP4 פלסמיד נשמר episomally כך שאין צורך לבודד שיבוטים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים המכילים את הווקטור pMEP4 יכול להיגרם על ידי טיפול עם 10 מיקרומטר CdCl 2 במשך 16 שעות. הביטוי inducibility חייבת להיות מאושרת על בקנה מידה קטן לפני הגברה של שורות תאים. חלבון סטפס מתויג ניתן לאתר בקלות כמו חלבון תחומים ז לאגד נוגדנים מ כמעט כל המינים. עבור בקנה מידה גדול purifications בדרך כלל 10 confluent 175 ס&quot;מ 2 צלוחיות של תאים נדרשים. זה משווה ל כ 2 X10 8 תאים המבטאים. </li></ol> 2. Lysate תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרדים תאים לתוך PBS ולשלב לתוך צינור אחד 50 מ&quot;ל. ספין 1200X GFאו 5 דקות (זה אמור להוביל 2-3 מ&quot;ל של תאים דחוסים בתור התחלה, אשר מפחית עד כ - 1.5 מ&quot;ל לאחר שטיפה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים שלוש פעמים קרה כקרח PBS (50 MLS בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים במאגר 5 מ&quot;ל תמוגה (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 125 מ&quot;מ NaCl, גליצרול 5%, 0.2% NP-40, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ NAF, 1 mM Na 3 VO 4 ו מעכב פרוטאז ). הערה: NAF, Na 3 VO 4 ו מעכבי פרוטאז יש להוסיף טרי. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים לפני היציאה במשך 5 דקות על קרח. מזרק מעלה מטה 5-10 פעמים באמצעות מחט קהה לפני שעזב שוב על קרח למשך 5 דקות על קרח. חזור על syringing ולהשאיר במשך 5 דקות נוספות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא להפשיר lysate פעמיים (קרח נוזלי N 2 / או יבש אתנול). אל תאפשר מדגם להגיע יותר מ 4 ° C. הערה: ניתן לאחסן את המדגם ב -80 ° C עד שיש לך זמן לעבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot מדגם לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל ולהסיר תאים unlysed ו-Debris על ידי צנטריפוגה (10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, 16,000 X ז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור supernatant, לשלב צינור 15 פלקון מ&quot;ל ו (אופציונלי) לעבור כמה 0.45 מיקרומטר סינון לפני נטילת דגימה של 20 μl כימות תשואה חלבון. הסר aliquot עוד 50 μl לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 1). </li></ol> 3. קשירה הארנב IgG-agarose (הערה: כל הספינים צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° C למשך דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend IgG-agarose ארנב פתרון (Sigma-Aldrich) על ידי מתערבל בבקבוק. קח 380 μl של IgG agarose (באמצעות קצה לחתוך 1ml פיפטה) ולהסיר משלוח / פתרון משמר ידי צנטריפוגה דקה 1. לשטוף שלוש פעמים agarose במאגר תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. התשואה הסופית של agarose צריך להיות בערך 250 μl של חרוזים ארוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף lysate תא פינה מ -2.6 (ב אמבט 15 מ&quot;ל הבזה) כדי שטוף הארנב-IgG agarose ו דגירה במשך 3 שעות (או לילה) בשעה 4 ° C בעזרת מערבל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את החרוזים agarose במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 2). הערה: TAP מתויג חלבון אמור להיות מזוהה עם החרוזים. </li></ol> 4. TeV מחשוף פרוטאז (הערה: ספינים כל צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4oC דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הארנב IgG חרוזים agarose שלוש פעמים חיץ תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר (הערה: מאגר תמוגה לא יכילו מעכבי פרוטאז). יש להיזהר שלא להסיר או לאבד את כל החרוזים במהלך השלבים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים כמה עוד פעמיים עם חיץ TeV-פרוטאז המחשוף (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 מ&quot;מ NaCl, ו -0.2% NP-40) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. לאחר שטיפת האחרון בזהירות להסיר את כל liפאונד מן החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת TeV מחשוף פרוטאז, עבור מדגם זה כולל 467.5 μl H 2 O, 25 μl 20x TeV חוצץ (Invitrogen), 5 μl 0.1M DTT ו -2.5 μl (25 U) TeV פרוטאז (Invitrogen). הוסף 500 μl של תערובת זו מחשוף TeV מדגם זה של חרוזים ארז ולהעביר את התערובת כולה צינור 1.7 מראש משומנים מ&quot;ל (שחקן המשנה). לפני הדגירה להסיר aliquot μl 30 לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה פרוטאז TeV לילה ב 4 ° C בעזרת מערבל מסתובב. שים לב קצרים יותר פעמים incubations ניתן להשתמש בהתאם לאופי של חלבון הפיתיון את הנגישות של האתר מחשוף TeV פרוטאז אבל הפעם הדגירה מינימלית יש לקבוע באופן אמפירי. </li></ol> 5. קשירה Ultralink streptavidin ללא יכולת לזוז פלוס חרוזים (הערה: כל הספינים צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° C למשך דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת) </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה התגובה מחשוף TeV המכיל את IgG ארנב חרוזים agarose במשך 5 דקות בכל 1200X גרם (4 ° C). הסר aliquot 20 μl של supernatant הבהיר לניתוח (לדוגמא 4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant הנותרים (בערך 480 μl) כדי מ&quot;ל 1.5 טרי מראש משומנים צינור (שחקן המשנה) ולהשאיר את זה על הקרח. אל תזרקו את supernatant - זה מכיל חלבון הפיתיון ביקע TeV שלך כל החלבונים הקשורים מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ תמוגה צונן (סעיף 2.3) את הארנב חרוזים הנותרים IgG agarose ו resuspend. סרכזת את התערובת כדי להבהיר את החרוזים לפני הסרת supernatant ושילוב זה עם זה משלב 5.2. לעזוב את הצינור על קרח (יש עכשיו מכילים ~ 980 μl של המדגם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על IgG ארנב חרוזים agarose לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 5). הערה: אם אתה מפעיל את המדגם על ג&#39;ל SDS-PAGE (או כתם המערבי) זה ייתן הרבה רקע בשל נוכחותם של הכבד IgG ואוררשתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים בעדינות resuspend Ultralink ללא יכולת לזוז streptavidin פלוס חרוזים agarose (פירס) על ידי מתערבל את הבקבוק. באמצעות טיפ 200 פיפטה μl עם חתך בסוף, aliquot 70 μl של חרוזים streptavidin לפי המדגם לתוך מראש משומנים 1.5 צינורות מ&quot;ל ולהסיר משלוח / פתרון משמר על ידי צנטריפוגה. הערה: חרוזים אלו הם קטנים מאוד ולכן &quot;ברווז החיוב&quot; או שטוח / צרי חוד טיפים ניתן להשתמש כדי להקטין את איבוד חרוז במהלך הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים streptavidin שלוש פעמים חיץ תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. זה אמור לצאת כ 45-50 μl של חרוזים ארוזים בכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant פרוטאז TeV-המחשוף (כלומר μl 980 המדגם משלב 5.3) כדי צינור המכיל את החרוזים streptavidin שטף ו דגירה במשך 3 שעות (או לילה) בשעה 4 ° C בעזרת מערבל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את החרוזים streptavidin במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant לניתוח שלאחר מכן (סםple 6). לשטוף את החרוזים streptavidin שלוש פעמים חיץ תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. לאחר שטיפה של דבר, להסיר בזהירות את כל המאגר הכביסה הנותר. </li></ol> 6. ביוטין elution של פפטיד מחייב streptavidin וחלבון הפיתיון (הערה: כל הספינים צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° C למשך דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבונים המתויגים מן חרוזים streptavidin על ידי הוספת 500 μl של PBS: ביוטין (1 mM D-ביוטין) ו דוגרים על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (או לילה) בעזרת מערבל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את החרוזים streptavidin במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant לצינור מ&quot;ל 1.5 מראש משומנים (הערה: מדובר במדגם הסופי / elution (דוגמה 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עוד 500 ביוטין μl: PBS על חרוזים streptavidin הנותרות דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות (או לילה) בעזרת מערבל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדשכבול לשלב 6.2 ולשלב שני elutions (דוגמה 7). Elution זו הסופי ניתן לאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את היעילות של elution ביוטין, להקפיא את החרוזים streptavidin הנותרים ומרתיחים לאחר מכן במאגר מדגם SDS (לדוגמא 8) (המלצות: LaneMarker מדגם 5x חיץ בין הפחתת פישר). </li></ol> 7. ריכוז החלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Eluate הסופי (לדוגמא 7) צריך להיות מרוכזים לקראת ניתוח בשל ריכוז החלבון נמוכה בנפח גבוה יחסית. זה יכול להשיג באמצעות משקל מולקולרי נמוך (פחות מ 5 KDA) עמודות Vivaspin ספין (Vivascience). במטרה לרכז את עוצמת הקול כדי μl פחות מ 100. מדגם זה האחרון ניתן להרתיח ומאוחסנים במאגר מדגם חלבון (המלצות: 5x LaneMarker צמצום מדגם חיץ בין פישר). </li></ol> 8. אנליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות 1-8 יכול להיות מנותח על ידי כתם המערבי כדי לקבוע את היעילות של לנתץ. הערה: נוגדנים משני ביותר יהיהצולבות להגיב עם חלבון ה-G תחומים של חלבון איחוי אבל זה הוסר לאחר המחשוף פרוטאז TeV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא 7 ניתן לנתח על ידי 1D או 2D SDS-PAGE. צביעה ניתן לבצע באמצעות כסף או Coomassie (המלצות: מכתים SilverQuest כסף קולואידיות ערכות כחול Coomassie צביעה של Invitrogen). זיהוי החלבון ניתן לבצע באמצעות ספקטרומטר מסה. </li></ol> 9. נציג תוצאות דוגמה של ניתוח SDS-PAGE 1D של elution הסופי (לדוגמא 7) מ פרוטוקול זה לזהות שותפים מחייב של eIF4E TAP מתויג מסופק באיור 2. זה ג&#39;ל נציג משקף את האופי המורכב ורב של אינטראקציות eIF4E עם חלבונים אחרים בתא. השוואה עם שליטה שלילי הראו גם באיור 2, שנוצר מקו תא להביע רק את תג ברז, ממחישה את הייחודיות של eIF4E זה התגרה הנפתח. ב 15% זה המופע של elution הסופי מרוכז (לדוגמא7) נותח על ידי SDS-1D באמצעות זמינים מסחרית מראש יצוק ג&#39;ל הדרגתיים לפני מוכתמים באמצעות מכתים כסף Silverquest ערכת מן Invitrogen. בדרך כלל 50-85% הנותרים של elution הסופי מרוכז (לדוגמא 7) הוא ניתח עם Coomassie Colloidal כתם (Invitrogen). דוגמאות (פרוסות ג&#39;ל / להקות) מהנתיב כל חולצו ואז ונותחו על ידי ספקטרומטר מסה. החלבונים שזוהו eIF4E הנפתח סוננו נגד השותפים מחייב משליטת שלילית לזהות שאינם ספציפיים שותפים מחייב. החלבונים הסופיים זוהו באמצעות תהליך של תיוג eIF4E TAP ניתן לראות באיור 2, שהוא נציג של חלבונים רגילים שזוהו באמצעות טכניקה זו. כמו כן, מספר יחידות משנה את eIF3 זוהו גם (מידע לא מוצג). <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי שלבמקביל הליך זיקה טיהור. צעד 6 טנדם זיקה טיהור (TAP) פרוטוקול כרוך קו תא הדור, תמוגה התא, שפן IgG agarose חיסונית רטיבות, מחשוף TeV פרוטאז, streptavidin טיהור חרוז זיקה ו elution ביוטין לבסוף. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. טנדם טיהור הזיקה של חלבון eIF4E Murine. אינטראקציה שותפים של N סופני הקשה על מתויג eIF4E טוהרו מ HEK293 התאים האיקריוטים באמצעות פרוטוקול המצורף. חלק 20% elution הסופי (לדוגמא 7) נותח על ידי-SDS על הג&#39;ל יצוקה שיפוע 4-12% (TAP-eIF4E נתיב). ניתוח דומה בוצע עבור תג בלבד (מסלול TAP). חלבונים זוהו באמצעות צביעת כסף. החלבונים שזוהו לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה של מדגם זהה מודגשים על ג&#39;ל זה. קיצורים: eIF4G; אוקריוטים התחלת התרגום פריץ4 גמא שחקן, PABP, חלבון פולה מחייב, eIF4A: תרגום אוקריוטים ייזום גורם 4 אלפא, SBP-eIF4e: TAP הנותרים הפיתיון חלבון המכיל את פפטיד מחייב streptavidin התמזגו כדי 4E תרגום אוקריוטים ייזום גורם, 4EBPs, תרגום אוקריוטים ייזום 4E גורם מחייב חלבונים, ייזום eIF4eNiF1l אוקריוטים התרגום גורם 4E גרעינית יבוא גורם 1, SBP, פפטיד streptavidin שנותר מחייב מ פפטיד TAP TeV unfused.

<ol><li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li>
<li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein%2C+NAP1%2C+affects+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li>
<li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li>
<li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep%2FFLAG+%28SF%29-TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li>
<li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP%2FUSP7%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li>
<li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li>
<li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+initiation+factor+4E%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תיוג TAP אייר הטכניקה כאן מדגים שיטה ספציפית מאוד מחמירים של בידוד השותפים מחייב של חלבונים בתאים האיקריוטים הפיתיון. גישה זו ניתן ליישם גם חלבונים תאיים ווירוסים. למיטב ידיעתנו, זוהי הפעם הראשונה כגון טכניקת הוחל eIF4E התחלת התרגום גורם. זיהוי eIF4G ידוע eIF4E חלבונים מחייב את 4EBPs באמצעות טכניקה זו מאשרת את תקפותה של גישה כזאת. בנוסף, זיהוי של הרכיב הנותר של המתחם eIF4F, כלומר eIF4A, ו PABP מאשר כי האינטראקציה עקיפה מתחמי שלישוני נותרו על כנן במהלך תהליך טיהור. זיהוי isoforms מרובות של החלבונים קנוניים מחייב eIF4e ניכרה גם. אלה מתוארים בפירוט רב יותר באיור 2. לגבי המגבלות של הגישה, טיפול מסוים יש לנקוט לגבי הבחירהשל חלבון הפיתיון ואם לא למקם את תג TAG ב-N-C או הסופית. זה יכול להיות מומלץ לבצע assay תפקודית או לבחון את הלוקליזציה של החלבון היתוך על ידי מיקרוסקופ לפני טיהור בהיקף מלא כדי להבטיח את הנגזרת מתויג הוא פונקציונלי. קרום נפרד או חלבונים גרעיני לא בהכרח שפורסמו על ידי התנאים חומר ניקוי עדין יחסית המתוארים בשלב תמוגה. כמו בכל immunoprecipitations ו דומים הנפתח מבחני, שינוי יכול להתבצע לטבע ריכוזים של חומר ניקוי במאגר תמוגה כדי להגביר את היעילות של תמוגה. ריכוז יוני של מאגרים תמוגה ולהתרחץ גם להיות שונה כדי להגדיל או להקטין את ההחמרה של טיהור. כמו כן ניתן לבצע טיהור ראשוני בתנאים קלים רגילים (כמתואר לעיל), אך לאחר מכן מחלקים את החרוזים streptavidin (סעיף 5.8) לתוך aliquots 4-5, שיכולים לאחר מכן להיות שטופים תחת קון יונית הגדלתditions. זה עשוי לאפשר למשתמש לזהות את התנאים האופטימליים, כי להסיר שאינם ספציפיים חלבונים אינטראקציה. התהליך כולו עשוי גם להתבצע באמצעות transfection חולף שבו השותפים באינטראקציה ידועים ונוכחותם או היעדרם נקבע על ידי כתם המערבי לאחר מכן בלבד. במקרה זה הייתי מציע שתי מנות של 100 ס&quot;מ 2 תאים כל transfected עם מיקרוגרם 8 הביטוי פלסמיד. הליך זה שונה הוא השימוש בפרט כאשר בוחנים את היכולת של נגזרים מוטציה של חלבון TAP-Fusion לתקשר עם בני זוג ידועים מחייב. ניתוח הדגימות 1 עד 8 על מוכתמים כסף SDS-עמוד ג&#39;ל (או על ידי כתם המערבי אם נוגדן זמין) היא דרך מצוינת של פתרון בעיות, טכניקה לא תצליח להפיק תוצאות מתקבלות על הדעת. היעילות של משקעים כל זיקה מבוסס elution ספציפי ניתן לנתח שימוש בגישה זו דגימה שיטתית. דוגמאות אחד עד שמונה יש לנקוט במהלך optimשנפלו על הקרקע הפורייה של פרוטוקול לפיתיון כל חדש. הטכניקה תיוג TAP מספק אלטרנטיבה חזקה ויציבה לגישות אחרות כגון GST למשוך ומורדות, שמרים שני מבחני היברידיות וכו &#39;טיהור זיקה כפולה צעדים elution ספציפיים (מחשוף TeV ו elution ביוטין) לספק הספציפיות להחמיר כדי להישמר רמה גבוהה לאורך כל תהליך טיהור. קשה טכניקה זו ניתן להחיל על כל חלבון ולכן מייצג שיטה מצוינת לזיהוי שותפים מחייב עבור היעד חלבון של עניין.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> רוש </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> הארנב IgG agarose </td><td> סיגמא </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TeV פרוטאז </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז קוקטייל </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> Ultralink ללא יכולת לזוז streptavidin חרוזים פלוס </td><td> לנקב </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 concentrator צנטריפוגלי (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest כסף ערכת צביעה </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex Colloidal כחול Coomassie ערכת צביעה </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> צינורות prelubricated 1.7ml</td><td> שחקן המשנה </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Microcapillary טיפים פיפטה </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12% Bis-טריס צבע ג&#39;ל </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> מאגר 5x SDS לדוגמא </td><td> דיג </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

שלב קריטי ולעיתים קרובות הגבלת בהבנת תפקידו של המארח חלבונים נגיפיים הוא זיהוי של אינטראקציה שותפים חלבונים תאיים או ויראלי. ישנן גישות רבות המאפשרות את הזיהוי של בני הזוג אינטראקציה, כולל מערכת שמרים 2 היברידית, כמו גם למשוך את מבחני באמצעות חלבונים רקומביננטי ו immunoprecipitation של חלבונים אנדוגניים ואחריו זיהוי ספקטרומטריית מסה 1. מחקרים שנעשו לאחרונה הדגיש את התועלת של טיהור פעמיים זיקה בתיווך תג, יחד עם שני צעדים elution ספציפיים זיהוי של חלבונים אינטראקציה. גישה זו, כינה טנדם טיהור זיקה (TAP), שימש בתחילה בשמרים 2,3 אך לאחרונה הותאם לשימוש בתאי יונקים 4-8. כהוכחה מושג של הקמנו טיהור זיקה טנדם (TAP) שיטה באמצעות היטב מאופיין אוקריוטים תרגום ייזום FACטור eIF4E 9,10. eIF4E הסלולרי גורם התרגום הוא מרכיב קריטי של המתחם eIF4F הסלולר מעורב בייזום יתר תלויה התרגום 10. תג TAP השתמשו במחקר הנוכחי מורכב משני יחידות ז חלבון פפטיד מחייב streptavidin מופרדים על ידי וירוס Etch טבק (TeV) מחשוף רצף פרוטאז. תג TAP השתמשו במחקר הנוכחי מורכב משני יחידות ז חלבון פפטיד מחייב streptavidin מופרדים על ידי וירוס טבק Etch (TeV) מחשוף פרוטאז רצף 8. לוותר על הצורך של הדור של שורות תאים משובטים, פיתחנו שיטה מהירה שמסתמכת על הביטוי של החלבון-TAP מתויג הפיתיון מן הפלסמיד שמרו episomally מבוסס על pMEP4 (Invitrogen). ביטוי eIF4E Murine מתויג מזה פלסמיד נשלט באמצעות קדמיום כלוריד מושרה האמרגן metallothionein. תמוגה של התאים המבטאים וטיהור זיקה לאחר מכן באמצעות קשירה Rabbit IgG agarose, מחשוף TeV פרוטאז, קשירה streptavidin agarose צמודות elution ביוטין לאחר מכן זיהו חלבונים ספציפיים רבים, ככל הנראה, eIF4E הנפתח (בהשוואה לשלוט שורות תאים המבטאים את תג TAP לבד). זהותם של חלבונים התקבלו על ידי כריתה של להקות מ 1D ספקטרומטריית SDS-PAGE ובעקבות המוני במקביל. המרכיבים שזוהו כללו את החלבונים eIF4E ידועים מחייבים eIF4G ו 4EBP-1. בנוסף, רכיבים אחרים של המתחם eIF4F, מתוכם eIF4E הוא מרכיב זוהו, כלומר eIF4A פולי ו-חלבון מחייב. היכולת לזהות לא רק בני זוג ידועים מחייבים ישיר, כמו גם חלבונים אינטראקציה משניים, מדגישה עוד יותר את התועלת של גישה זו באפיון של חלבונים של תפקוד לא ידוע.

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

שלב קריטי, ולעיתים קרובות מגביל, בהבנת התפקוד של חלבונים של המארח ושל נגיפים הוא זיהוי חלבונים תאיים או נגיפיים המקיימים אינטראקציה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש בשיטה הידועה כטיהור זיקה טנדמי (Tandem affinity purification) כדי לבודד שותפים קושרים של חלבונים. שלום, אני dLAN Bailey מהמחלקה לוירולוגיה ב-Imperial College London. במעבדה שלנו, אנו חוקרים אינטראקציות בין וירוסים למארחים עבור חברים שונים ממשפחת הווירוסים.זיהוי חלבונים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים תאיים או ויראליים אחרים הוא נקודת התחלה מצוינת לחקירת הגומלין בין הווירוס למארחו במהלך זיהום. בסרטון זה, אסביר גישה אחת שבה אנו משתמשים במעבדה שלנו, טיהור טנדמי ואפיני (tandem and affinity purification) או סימון TAP. תג ה-TAP המשמש במחקר זה הוא תג N-טרמינלי המורכב משתי יחידות של חלבון G ופפטיד קושר strep-avidin.אלה מופרדים על ידי רצף קיטוע של פרוטאז TEV המאפשר אלוציה ספציפית של חלבון הפיתיון. בדוגמה זו, eIF4E עכברי נמצא בקצה ה-C של מבנה היתוך זה. פרוטוקול תיוג ה-TAP הוא הליך בן שישה שלבים.לאחר טרנספקציה ויצירת שורות תאים, התאים עוברים השראה לביטוי חלבון ה-tag לפני שהם מולתים בבופר ליזיס עדין. שני שלבים של טיהור זיקה ושני תמיסות ספציפיות משמשים לטיהור הפיתיון (bait) וכל שותף פוטנציאלי לאינטראקציה לצורך יצירת שורות תאים. יש לבצע טרנספקציה לתאי HEC 2 93 באמצעות וקטור הביטוי P met four המקודד.תאי חלבון הפיתיון המסומנים ב-tap נבחרים לאחר מכן באמצעות 100 µg/ml של hygromycin B. מכיוון שהפלסמיד נשמר כ-episome, אין צורך בבידוד של שיבוטים ספציפיים. 10 בקבוקונים של תאים בצפיפות מלאה (confluent) עוברים אינדוקציה על ידי טיפול ב-10 µM של cadmium chloride למשך 16 שעות, לפני שנגרדים אל תוך המצע. התאים התלויים מועברים לאחר מכן לצינורות 15 M, והתאים מרוכזים למשקע באמצעות סנטריפוגציה.תאים אלו נשטפים לאחר מכן שלוש פעמים ב-PBS קר בקרח לפני שהם מרוכזים בסוף לתהליך סבסבציה (pelleting). בשלב השני, ליזיס של התאים, התאים עוברים ליזיס ב-5 mL של חוצץ ליזיס (lysis buffer) קר באמצעות פיפטאות חוזרות, ולאחר מכן נשארים על קרח למשך חמש דקות. כדי להבטיח ליזיס יעיל, התאים מועברים באמצעות מזרק דרך מחט קהה בעלת קוטר צר ועוברים מחזור של הקפאה והפשרה (freeze thaw).את התוצאה מחלקים למבחנות של 1.5 mil ומסירים תאים לא מומסים ושיירי רקמה באמצעות צנטריפוגציה. יצוין כי גודל המשקע פוחת באופן ניכר לאחר שלב צנטריפוגציה זה. את העלייה של התמיסות המומסות מאחדים לאחר מכן במבחנת Falcon של 15 mil ומעבירים דרך מסנן של 0.45 micrometer להסרת שיירי רקמה נוספים.יש לקחת מנות (aliquots) של 50 µL מליזאט זה לצורך ניתוח עוקב. דגימה זו תיקרא דגימה אחת. שלב שלוש, קישור ל-rabbit IgG Aeros.בשלב זה של הפרוטוקול, תגי protein G משוקקעים חיסונית באמצעות חרוזי rabbit IgG. כדי להקצות את חרוזי ה-aros, הסר את הקצה של טיפ הפ pipette. פעולה זו מסייעת במניעת נזק לחרוזים.שחזר בעדינות את תמיסת ה-rabbit IgG aro על ידי סיבוב של הבקבוק לפני העברת ה-aros למבחנה של 15 mil. שטוף את ה-aros שלוש פעמים בבופר ליזיס מקורר, תוך שימוש בצנטריפוגה במהירות נמוכה כדי להשקיע את החרוזיים בכל שלב. חרוזי ה-rabbit IgG שהשקיעו צריכים להיות גלויים לאחר הצנטריפוגה.לאחר כל שלב, יש להסיר בזהירות את הבאפר מבלי להפריע לחרוזים. לאחר השלמת השטיפה האחרונה, יש להוסיף את הליזאט המסונן והמזוקק לחרוזים הדחוסים ולהדגיר למשך שלוש שעות או למשך הלילה. מומלץ לבצע זאת בטמפרטורה של 4 °C באמצעות מערבל מסובב.לאחר האימונו-פרסיפיטציה (immunoprecipitation), סובבו במהירות (spin down) את כדוריות האגרוז והסירו את supernatant לצורך ניתוח בהמשך. במידת הצורך, ניתן להשתמש בקצה טיפ דק כדי להסיר כל שארית נוזל מהמבחנה. supernatant זה הוא דגימה שתיים שלב ארבע: שסוע פרוטאז TEV.בשלב זה, הפיתיון מנותק מתגיโปรטאין G. שלב זה מאפשר ניתוק ספציפי של חלבון הפיתיון, המהווה למעשה שלב אלוטיה (elution) מתוך שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של IgG של ארנב. הכינו את תערובת הניתוק של TEV והוסיפו אותה לחרוזי ה-aros באמצעות קצה של טיפ שהוסר, העבירו תערובת זו למבחנה מיקרו-צנטריפוגה סיליקונית והפכו אותה כדי להביא את ה-aros לסuspended לפני דגירה למשך לילה בטמפרטורה של 4°C, הסירו אליקוט מתגובת הניתוק של TEV זו לצורך אנליזה.זוהי דוגמה שלוש. דגירה לילה על מערבל מסובב אמורה לאפשר לתגובת ה-TEV להתקדם עד להשלמה כמעט מלאה. שלב חמישה, קישור להסרטה של חרוזי strept avidin.בשלב זה, פיתי ה-Cleve וכל שותפי קישור פוטנציאליים עוברים טיהור באמצעות זיקה (affinity purification) מהתמיסה. ראשית, סבבו בצנטריפוגה את תגובת השחרור של TEV המכילה את חרוזי ה-aros rabbit IgG. כדי לשקע את ה-aros, הסירו נפח קטן של העלייה המזוכלת לצורך אנליזה.זוהי דוגמה ארבע. הסר בזהירות את כל supernatant שנותר, המכיל את חלבון הפיתיון שלך, אל מבחנה נקייה. שוב, השתמש בעדין.יש להשתמש בטיפים של פפיתה (peppe tips) כדי להסיר את כל העלייה (supernatant) האפשרית. יש לשמור את חרוזי ה-rabbit IgG aros לצורך ניתוח עוקב. זהו דגימה חמש.כדי למנוע נזק לחרוזי ה-strep adin, הסר את הקצה מטיפ pet. השהה בעדינות את החרוזים והעבר aliquote למבחנה סיליקונית. שטוף את חרוזי ה-strep בעזרת S buffer, והשגהו שליות באמצעות סרכוז במהירות נמוכה.לאחר כל שטיפה. לאחר כל שטיפה, הסירו בזהירות את התמי समाधान (buffer). חרוזי Streptavidin הם קטנים מאוד ועלולים לזוז בקלות, גם כאשר משתמשים בפיפט קטן.הכינו את טיפולי ה-pet. לאחר שטיפת חרוזי ה-strept adin, הוסיפו את הנוזל העליון (supernatant) מתגובת השחרור של ה-TEV לחרוזים אלו, והדגירו את התגובה למשך שלוש שעות או למשך לילה בטמפרטורה של 4°C, באמצעות מערבל מסתובב.לאחר הדגירה, סבב במ centri-fuge את חרוזי ה-streptavidin והסר את העל-נוזל (supernatant). זהו דגימה שש. לתשומת לבכם.חלבון הפיתי (bait protein) קשור כעת לחרוזי השארית שבמבחנה. שטפו את חרוזי הסטריפטאבידין המכילים את חלבון הפיתי שלכם בעזרת תמיסת ליזיס. כדי להסיר חלבונים מזוהמים נוספים, הסירו את תמיסת השטיפה שנותרה מהחרוזים והשאירו אותם על קרח.שלב שש, אלוציה של ביוטין. בשלב זה, מוסיפים ביוטין לחרוזי הסטראפטיווידין. האינטראקציה בין הביוטין לחרוזי הסטראפטיווידין דוחפת את הפיתיון, אשר חוזר לתמיסה.הוסיפו את תמיסת הביוטין ישירות לחרוזים והפכו את המבחנה כדי לערבב. דגרו את התגובה בטמפרטורה של ארבעה °C למשך שלוש שעות או למשך הלילה באמצעות צנטריפוגת ערבוב מסתובבת, ערבבו את תערובת הביוטין ואספו בזהירות את התערובת למבחנה נקייה. זהו ה-EIT הסופי שלכם, המכונה דגימה שבע.חרוזי ה-strept havein הנותרים הם עבור דגימה שמונה. בשל ריכוז החלבון הנמוך שבה, יש לרכז את האלוציות הסופית זו לפני הניתוח. פעולה זו מתבצעת באמצעות עמודי ספין עם סף חיתוך למשקל מולקולרי נמוך, תוך הפחתת הנפח על ידי צנטריפוגציה ומעקב קבוע אחר התהליך.ניתן לפצל דגימה רכזת זו ולנתח אותה בג'לי SDS-PAGE באמצעות צביעת kumasi וכסף. אם הדגימות מיועדות לניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסה, אנו ממליצים להשתמש בג'לים מסחריים מוכנים מראש. לאחר מכן ניתן לחלץ פסים בודדים ולזהות את החלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסה.במקרה זה, הפיתיון היה עכברי, EIF עבור חלבון E. היתרון במערכת ה-tap הוא היכולת לבטא את החלבון המבוקש בקו תאים ספציפי, ותלוי בקו התאים שבו אתם מעוניינים, היא מאפשרת גם לבטא את החלבון ברמות נמוכות יחסית, לפי בחירתכם, כאשר כל המודיפיקציות הפוסט-טרנסלציוניות והמיקום התאי נשמרים, כך שניתן לרוב לנקות את הקומפלקס הטבעי.

identification-protein-interacting-partners-using-tandem-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת...

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

סרטון זה מדגים טיהור זיקה טנדם – טכניקה לטיהור קומפלקסים חלבוניים מתאים איקריוטים כדי לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון. הקומפלקס מכיל שני חלבונים המסומנים בתגי אפיטופ שונים. עם טיהור המתחם באמצעות שני שרפים בעלי זיקה לשני התגים השונים באופן רציף, נוכחותם של שני החלבונים באלוטה מאשרת את האינטראקציה בין השניים.

בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

שיטת טיהור הזיקה הטנדם (TAP) שימשה רבות לבידוד קומפלקסים מקומיים מתמצית תאית, בעיקר איקריוטית, עבור פרוטאומיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיטת TAP המותאם לטיהור קומפלקסים מקומיים למחקרים מבניים.

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

אנו מתארים כאן שיטה חדשנית, חזקה ויעילה לטיהור זיקה טנדם (TAP) לביטוי, בידוד ואפיון של קומפלקסים של חלבונים מתאים אוקריוטיים. פרוטוקול זה יכול לשמש לאפיון ביוכימי של קומפלקסים בדידים כמו גם לזיהוי אינטראקטורים חדשים ושינויים לאחר תרגום המווסתים את תפקודם.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

למדו לבודד שותפי קשר חלבוניים באמצעות טיהור זיקה טנדם בקווי תאים HEC 293. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין נגיפים לתאים מארחים ולזהות גורמי תרגום מעורבים באתחול התרגום.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

גלה סרטונים נוספים