זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה
February 25th, 2012
טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בשיטה המכונה טיהור זיקה טנדם כדי לבודד שותפים לקשירת חלבון. שלום, אני dLAN ביילי מהמחלקה לווירולוגיה באימפריאל קולג' לונדון. במעבדה שלנו אנו עובדים על אינטראקציות עם מארחי וירוסים עבור חברים שונים במשפחת הווירוסים.
זיהוי חלבונים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים תאיים או נגיפיים אחרים הוא נקודת התחלה מצוינת לחקירת יחסי הגומלין בין הנגיף למארחו במהלך ההדבקה. בסרטון זה, אסביר גישה אחת שאנו משתמשים בה במעבדה שלנו, טיהור טנדם ו-e או תיוג ברזים. תג הברז ששימש במחקר זה הוא תג מסוף N המורכב משתי יחידות של חלבון G ופפטיד קושר אדין סטרפטוק
.אלה מופרדים על ידי רצף מחשוף פרוטאז TEV המאפשר פליטה ספציפית של חלבון הפיתיון. בדוגמה זו, מורין, EIF ארבע E נמצא בקצה C של מבנה היתוך זה. פרוטוקול תיוג הברז הוא הליך בן שישה שלבים.
לאחר טרנספקציה ויצירת קווי תאים, התאים מושרים לבטא את חלבון הפחתת התגים לפני שהם שוכבים במאגר ליזה קל. שני שלבי טיהור זיקה ושני פתרונות ספציפיים משמשים לטיהור הפיתיון וכל שותף פוטנציאלי המקיים אינטראקציה ליצירת קווי תאים. יש להעביר תאי HEC 2 93 עם קידוד וקטור הביטוי P פגש ארבעה ביטויים.
לאחר מכן נבחרים תאי חלבון הפיתיון המתויגים בברז עם מאה מיקרוגרם למיל היגרומיצין B.מכיוון שהפלסמיד נשמר אפיזו, אין צורך לבודד שיבוטים ספציפיים. 10 התפרצות של תאים מושרים על ידי טיפול ב-10 קדיום כלוריד מיקרו-מולרי למשך 16 שעות לפני שהם מגרדים למדיה. התאים התלויים מועברים לאחר מכן לצינורות 15 M והתאים מגולגלים על ידי צנטריפוגה.
תאים אלה נשטפים שלוש פעמים ב-PBS קר כקרח לפני שהם נזרקים לבסוף. שלב שני תאי ליזה של תאים שוכבים בחמישה מיל של מאגר ליזה קר על ידי פיפטינג חוזר ונשנה לפני שהם נשארים על קרח למשך חמש דקות. כדי להבטיח ליזה יעילה, התאים מוזרקים לאחר מכן דרך מד צר, מחט קהה ומפשירים בהקפאה.
הסאט שנוצר מוקצה לצינורות של 1.5 מיל ותאי אונלי ופסולת מוסרים על ידי צנטריפוגה. יש לציין כי גודל הגלולה מצטמצם באופן ניכר לאחר שלב צנטריפוגה זה. לאחר מכן משולבים הסופרנטנטים של הליזאט בשפופרת פלקון של 15 מיל ומועברים דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר כל פסולת נוספת.
יש לקחת 50 מיקרוליטר של ליזאט זה לניתוח לאחר מכן. מדגם זה מכונה מדגם אחד. שלב שלישי, קשירה לארנב IgG Aeros.
בשלב זה של הפרוטוקול, תגי החלבון G הם חיסונים המופעלים על ידי ארנב IgG aros. כדי להקצות חרוזי ארוס, הסר את קצה קצה הקוף. זה עוזר למנוע פגיעה בחרוזים.
השעו בעדינות את תמיסת ה-IgG aro של הארנב על ידי סיבוב הבקבוק לפני הוצאת הארוס לצינור של 15 מיל. שטפו את הארוס שלוש פעמים במאגר ליזה צונן באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה כדי להבהיר את החרוזים בכל שלב. חרוזי ה-IgG של הארנב הגלולי צריכים להיות גלויים לאחר צנטריפוגה.
לאחר כל שלב, הסר בזהירות את המאגר מבלי להפריע לחרוזים. לאחר השלמת הכביסה הסופית, מוסיפים את הליזאט המסונן והמובהר לחרוזים הארוזים ודוגרים למשך שלוש שעות או למשך הלילה. הוא העדיף בארבע מעלות צלזיוס באמצעות מערבל מסתובב.
לאחר המשקעים החיסוניים, סובב את חרוזי האגרוס והסר את הסופרנטנט לניתוח שלאחר מכן. במידת הצורך, אתה יכול להשתמש בקצה בנייה עדין כדי להסיר את כל הנוזלים שנותרו מהצינור הזה. סופרנטנט זה הוא מדגם שני שלב רביעי של מחשוף פרוטאז TEV.
בשלב זה, הפיתיון נחתך מתגי החלבון G. שלב זה מאפשר פיצול ספציפי של חלבון הפיתיון ביעילות שלב פליטה מהארנבים IgG aros immunoprecipitation. הכינו את תערובת המחשוף TEV והוסיפו אותה לחרוזי הארוס באמצעות קצה קוף כשקצהו הוסר, העבירו את התערובת הזו לצינור מיקרו צנטריפוגה סיליקון והפכו כדי לערבב את הארוס לתרחיף לפני הדגירה של הלילה בארבע מעלות צלזיוס, הסירו אליקו של תגובת מחשוף TEV זו לניתוח.
זוהי דוגמה שלישית. דגירה של לילה על המיקסר המסתובב אמורה לאפשר לתגובת TEV להתקדם כמעט לסיום. שלב חמישי, קשירה לשיתוק חרוזי עדין סטרפט.
בשלב זה, פיתיון Cleve וכל שותפים מחייבים פוטנציאליים מטוהרים מהתמיסה. ראשית, צנטריפוגה את תגובת המחשוף TEV המכילה את חרוזי IgG aros של הארנב. כדי לגלול את הארוס, הסר OTT של הסופרנטנט המובהר לניתוח.
זוהי דוגמה רביעית. הסר בזהירות את כל הסופרנטנט שנותר, המכיל את חלבון הפיתיון שלך לצינור טרי. שוב, השתמש בסדר.
בנה טיפים של פפה כדי להסיר את כל הסופרנטנטים האפשריים. שמור את חרוזי הארנב IgG aros לניתוח שלאחר מכן. זוהי דוגמה חמישית.
כדי למנוע נזק לחרוזי האדין, הסר את הקצה מקצה חיית מחמד. השעו בעדינות את החרוזים והוציאו אליקו לצינור סיליקון. שטפו את הסטרפטוקוקוס שיש בחרוזים עם מאגר S, והבהירו על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה.
לאחר כל שטיפה. לאחר כל שטיפה, הסר בזהירות את המאגר. חרוזי אדין סטרפט קטנים מאוד וניתן לעקור אותם בקלות גם בשימוש עדין.
בנו טיפים לחיות מחמד. לאחר שטיפת חרוזי האדין. הוסף את הסופרנטנט מתגובת מחשוף TEV לחרוזים אלה ודגר את התגובה במשך שלוש שעות או לילה בארבע מעלות צלזיוס, באמצעות מערבל מסתובב.
לאחר הדגירה יש לצנטריפוגה סטרפט חרוזים ומסירה את ה-sup natum. זוהי דוגמה שש. יש לציין.
חלבון בית קשור כעת לחרוזים שנותרו בשפופרת. שטפו את חרוזי הסטרפטווידין המכילים את חלבון הפיתיון שלכם עם מאגר ליזה. כדי להסיר חלבונים מזהמים נוספים, הסר את תמיסת הכביסה שנותרה מהחרוזים והשאיר אותם על קרח.
שלב שישי, פליטת ביוטין. בשלב זה מוסיפים ביוטין לחרוזי הסטרפטווידין. האינטראקציה בין ביוטין לחרוזי הסטרפטווידין עוקרת את הפיתיון, שחוזר לתמיסה.
מוסיפים את תמיסת הביוטין ישירות לחרוזים והופכים לתערובת. דגרו את התגובה בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות או למשך הלילה באמצעות צנטריפוגת מערבל מסתובבת, תערובת הביוטין אירוס ואספו בזהירות את התערובת לתוך צינור טרי. זהו ה-EIT האחרון שלך המכונה מדגם שבע.
שאר חרוזי הסטרפט הם מדגם שמונה. בגלל ריכוז החלבון הנמוך שלו, יש לרכז את הפליטה הסופית הזו לפני הניתוח. זה מושג באמצעות משקלים מולקולריים נמוכים, ניתוק עמודות ספין, הפחתת הנפח על ידי צנטריפוגה הניטור של התהליך באופן קבוע.
ניתן לפצל את הדגימה המרוכזת הזו ולנתח אותה על ג'ל דף SDS על ידי קומאסי וכתם כסף. אם יש לנתח את הדגימות לפי מפרט המוני, אנו ממליצים להשתמש בג'לים מסחריים טרומיים. לאחר מכן ניתן לחלץ רצועות בודדות ולזהות את החלבונים לפי מפרט מסה.
במקרה זה, הפיתיון היה מורין, EIF לחלבון E. היתרון של מערכת הברז הוא שיש לך את היכולת לבטא את החלבון המעניין שלך בקו תאים מסוים, ובהתאם לקו התאים שאתה מעוניין בו, היא גם נותנת לך את היכולת לבטא את החלבון ברמות נמוכות יחסית. אתה מחליט לעשות זאת, וכל השינויים והלוקליזציה שלאחר התרגום נשמרים, כך שלעתים קרובות תוכל לטהר את הקומפלקס המקורי.
סקירה כללית
טיהור זיקה כפול הוא טכניקה חזקה לזיהוי שותפי קישור חלבון. שיטה זו יושמה על גורם תחילת התרגום eIF4E למשקע משותף של גורמי תא מארח המעורבים בתחילת התרגום.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- וירולוגיה
- מחקרי אינטראקציה של חלבונים
- ביולוגיה תאית
רקע
- טיהור זיקה כפול (TAP) היא שיטה המשמשת לבידוד קומפלקסים של חלבונים.
- תג ה-TAP מורכב מחלבון G ופפטיד הקישור לסטרפטאווידין.
- טכניקה זו מאפשרת אלוסיה ספציפית של חלבוני פיתיון.
- הבנת אינטראקציות חלבונים היא קריטית לחקר הדינמיקה בין נגיף למארח.
מטרת המחקר
- לבודד ולזהות חלבונים המתקשרים עם גורם תחילת התרגום eIF4E.
- לחקור את האינטראקציה בין חלבוני וירוס ומאירח במהלך זיהום.
- להדגים את התאמת שיטת ה-TAP לחלבונים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של תאי HEC 293 עם וקטור ביטוי מתויג TAP.
- ליזה תאית וטיהור באמצעות IgG של ארנבת וחרוזי סטרפטאווידין.
- פיצול חלבון TEV לאלוסיה ספציפית של חלבוני פיתיון.
- צעדי שטיפה וצנטריפוגה מרובים להבטחת טוהר הדגימות.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של eIF4E ושותפיו המשתקעים.
- הוכחת יעילותה של שיטת ה-TAP בזיהוי קומפלקסים של חלבונים.
- זיהוי גורמי מאירח פוטנציאליים המעורבים בתחילת התרגום.
- אימות התאמת השיטה לחלבונים אחרים.
מסקנות
- טיהור זיקה כפול היא גישה יעילה לחקר אינטראקציות חלבונים.
- ניתן ליישם את השיטה על חלבונים תאיים וויראליים שונים.
- הבנת האינטראקציות הללו מספקת תובנות על הפתוגנזה הנגיפית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Identifying protein-protein interactions is a foundational step in target validation and mechanistic de-risking for biopharma discovery programs. Tandem affinity purification (TAP) enables the isolation of native protein complexes under near-physiological conditions, supporting confident target engagement and pathway mapping. This approach reduces false positives in early screening and improves predictive confidence for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating direct and indirect binding partners of bait proteins like eIF4E.
- Operational Value: Supports functional target validation through identification of known complex members such as eIF4G, 4EBP-1, eIF4A, and Poly-A binding protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by distinguishing specific interactors from background using TAP-tag alone controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by capturing endogenous complexes with preserved post-translational modifications.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through defined elution steps (TEV protease and biotin) and stringent washing protocols.
- Scalability: Supports platform reuse across cell lines via episomal plasmid expression, avoiding clonal line generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by studying eIF4E in cap-dependent translation initiation, a pathway dysregulated in cancer and viral infection.
- Preclinical Alignment: Connects discovery findings to mechanistic de-risking by identifying secondary interactors that inform pathway context.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying target mechanism and complex integrity before lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
TAP fits within the discovery continuum from target engagement assays to preclinical validation, particularly for targets where native complex integrity is critical for function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating eIF4E-associated complexes under inducible expression.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative outputs via mass spectrometry-identifiable bands following SDS-PAGE separation.
- Analytics: Enables comparative condition analysis through specific elution steps that reduce non-specific binding.
- Translational Research: Connects to biomarker alignment by identifying translation initiation factors relevant to oncogenic signaling.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple bait proteins due to modular TAP tag design and episomal expression system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and native complex preservation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cell lines and bait proteins.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early complex characterization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated interactome data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, transient transfection, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation, rotating mixers, protease inhibitors, and mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tag design, induction protocols, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for different bait proteins, expression levels, and subcellular localization.
- Includes practical limitations such as potential tag interference and the need for optimization of induction timing and lysis conditions.
