זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בשיטה המכונה Tandem affinity purification כדי לבודד שותפים לקשירה של חלבונים. שלום, אני dLAN Bailey מהמחלקה לווירולוגיה ב-Imperial College London. במעבדה שלנו, אנו חוקרים אינטראקציות בין נגיפים למאכסן עבור חברים שונים ממשפחת הנגיפים.

זיהוי חלבונים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים תאיים או ויראליים אחרים מהווה נקודת מוצא מצוינת לחקירת הגומלין בין הנגיף למארחו במהלך הזיהום. בסרטון זה, אסביר גישה אחת שבה אנו משתמשים במעבדה שלנו, טיהור טנדמי (tandem purification) או סימון TAP. תג ה-TAP המשמש במחקר זה הוא תג קצאי-N המורכב משתי יחידות של חלבון G ומפפטיד קושר ל-streptavidin.

אלה מופרדים על ידי רצף עיקר של פרוטאז TEV המאפשר אלוציה ספציפית של חלבון הפיתיון. בדוגמה זו, EIF four E עכברי נמצא בקצה ה-C של מבנה היתוך זה. פרוטוקול תיוג ה-tap הוא הליך בן שישה שלבים.

לאחר הטרנספקציה ויצירת קווי התאים, התאים מונחים להביע את חלבון התג (tag) לפני שהם מולסים בבופר ליסיס עדין. שני שלבי טיהור באפיניות ושני תמיסות ספציפיות משמשים לטיהור הפיתיון (bait) וכל שותף אינטראקציה פוטנציאלי לצורך יצירת קווי התאים. יש לבצע טרנספקציה של תאי HEC 2 93 עם וקטור הביטוי P met four המקודד.

תאי חלבוני הפיתיון המסומנים ב-tap נבחרים לאחר מכן באמצעות 100 µg/ml של hygromycin B. מכיוון שהפלסמיד נשמר כאפיסומלי, אין צורך בבידוד של שיבטים ספציפיים. 10 בקבוקרי תאים שהגיעו למצב של התמזגות (confluence) עוברים השראה על ידי טיפול ב-10 µM של cadmium chloride למשך 16 שעות לפני שנגרפים אל תוך המצע. התאים התלויים מועברים לאחר מכן לאנבוקרות של 15 mL והתאים משוקעים על ידי סבב צנטריפוגה.

תאים אלו נשטפים לאחר מכן שלוש פעמים ב-PBS קר מאוד לפני שהם מרוכזים לסמיכון (pelleted). בשלב השני, ליזיס של התאים, התאים עוברים ליזיס ב-5 ml של בופר ליזיס קר באמצעות פיפטינג חוזר, ולאחר מכן נשארים על קרח למשך חמש דקות. כדי להבטיח ליזיס יעיל, התאים מועברים במזריק דרך מחט קהה בעלת קוטר צר ועוברים מחזור של הקפאה והפשרה (freeze thaw).

את התוצאה מחלקים למבחנות של 1.5 mil ומסירים תאים לא מלוסים ושאריות באמצעות צנטריפוגה. שים לב שגודל המשקע קטן משמעותית לאחר שלב צנטריפוגה זה. את העל-משקעים של הליסאט מאחדים במבחנה מסוג Falcon של 15 mil ומעבירים דרך פילטר של 0.45 micrometer כדי להסיר שאריות נוספות.

יש לקחת מנות של 50 µL מליזט זה לצורך ניתוח המשך. דגימה זו תיכנה דגימה אחת. שלב שלוש, קישור ל-rabbit IgG Aeros.

בשלב זה של הפרוטוקול, תגי ה-protein G עוברים שיקוע חיסוני באמצעות חרוזי rabbit IgG. כדי להעביר את חרוזי ה-aros, הסר את הקצה של טיפ הפ pipette. פעולה זו מסייעת במניעת נזק לחרוזים.

יש להחזיר בעדינות את ה-rabbit IgG aro לתמיסות על ידי סחרור של הבקבוק לפני העברת ה-aros למבחנה של 15 mil. יש לשטוף את ה-aros שלוש פעמים בבופר ליזיס קר, תוך שימוש בצנטריפוגציה במהירות נמוכה כדי להמריא את החרוזיים בכל שלב. החרוזיים של ה-rabbit IgG שהשקעו אמורים להיות גלויים לאחר הצנטריפוגציה.

לאחר כל שלב, יש להסיר בזהירות את הבאפר מבלי להפריע לחרוזים. לאחר סיום השטיפה האחרונה, יש להוסיף את הליזאט המסונן והמזוקק לחרוזים הדחוסים ולהדגיר למשך שלוש שעות או למשך לילה. מומלץ לבצע זאת בטמפרטורה של 4 °C באמצעות מערבל מסובב.

לאחר האימונו-פרסיפיטציה, סובבו את חרוזי ה-agros בנפח נמוך והסירו את העלייה (supernatant) לצורך אנליזה בהמשך. במידת הצורך, ניתן להשתמש בקצה של פיפט עם פיה דקה כדי להסיר כל שארית נוזל משפופית זו. עלייה זו היא דגימה שתיים שלב ארבע: פיצול על ידי פרוטאז TEV.

בשלב זה, הפיתיון מנותק מתגי ה-protein G. שלב זה מאפשר ניתוק ספציפי של חלבון הפיתיון, המהווה למעשה שלב אלוציה מה-immunoprecipitation של ה-IgG של הארנב. הכינו את תערובת הניתוק של TEV והוסיפו אותה לחרוזי ה-aros באמצעות טיפ עם קצה מוסר; העבירו תערובת זו לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה סיליקונית והפכו אותה כדי להביא את ה-aros לסספנסיה לפני דגירה לילה במקום בטמפרטורה של 4°C. הוציאו אליקוות מתגובת ניתוק ה-TEV זו לצורך אנליזה.

זוהי דגימה שלוש. דגירה למשך לילה על מערבל מסתובב אמורה לאפשר לתגובת ה-TEV להתקדם לכמעט השלמה. שלב חמישה, קישור להצמדה של חרוזי strept adin.

בשלב זה, פיתי ה-Cleve וכל שותפי קישור פוטנציאליים מטוהרים באמצעות זיקה (affinity purification) מהתמיסה. ראשית, סבבב את תגובת השחרור של TEV המכילה את חרוזי ה-aros של rabbit IgG. כדי להשקיע את ה-aros, הסר OTT מהעל-נוזל המזוקק לצורך אנליזה.

זוהי דגימה ארבע. הסר בזהירות את כל supernatant שנותר, המכיל את חלבון הפיתיון שלך, למבחנה נקייה. שוב, השתמש ב...

בנו טיפים של פפטה כדי להסיר את כל העלייה האפשרית. שמרו את חרוזי ה-rabbit IgG aros לצורך אנליזה מאוחרת יותר. זהו דגימה חמש.

כדי למנוע נזק לחרוזי ה-strep adin, הסר את הקצה מטיפ pet. השהה בעדינות את החרוזים והעבר אליקו למבחנה סיליקונית. שטוף את חרוזי ה-strep בעזרת S buffer, והרقیق באמצעות סרכוז במהירות נמוכה.

לאחר כל שטיפה. לאחר כל שטיפה, הסירו בזהירות את הבאפר. חרוזי Strept adin קטנים מאוד ועלולים ל displaced בקלות, גם כאשר משתמשים בפיפטה מדויקת.

הכנת טיפים לפיפט. לאחר שטיפת חרוזי ה-strept adin, הוסף את העליון (supernatant) מתגובת הפיצול של TEV לחרוזים אלו, והדגר את התגובה למשך שלוש שעות או למשך לילה בטמפרטורה של 4°C, תוך שימוש במערבל מסובב.

לאחר הדגירה, סבב את התמיסה בצנטריפוגה כדי לשקע את חרוזי ה-streptavidin והסר את הנוזל העליון (supernatant). זוהי דגימה שש. יש לשים לב.

חלבון הפית (Beit) קשור כעת לחרוזי השערים שנותרו במבחנה. שטפו את חרוזי הסטראפתווידין המכילים את חלבון הפית שלכם באמצעות תמיסת ליזיס (lysis buffer). כדי להסיר חלבונים מזוהמים נוספים, הסירו את תמיסת השטיפה שנותרה מהחרוזים והשאירו אותם על קרח.

שלב שש, אלוציה של ביוטין. בשלב זה, מוסיפים ביוטין לחרוזי הסטראפטאבידין. האינטראקציה בין הביוטין לחרוזי הסטראפטאבידין דוחקת את הפיתיון, אשר חוזר לתמיסה.

הוסיפו את תמיסת הביוטין ישירות לחרוזים והפכו את המבחנה לערבוב. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 4°C למשך שלוש שעות או למשך לילה באמצעות צנטריפוגה עם מערבל מסובב, ערבבו את תערובת הביוטין-אירוז ואספו בזהירות את התערובת למבחנה נקייה. זהו ה-EIT הסופי שלכם, המכונה דגימה שבע.

חרוזי ה-strept havein הנותרים הם דגימה שמונה. בשל ריכוז החלבון הנמוך שבה, יש לרכז אלואט סופי זה לפני הניתוח. דבר זה מושג באמצעות עמודי ספין בעלי סף משקל מולקולרי נמוך (cut off), להפחתת הנפח באמצעות סרכזגציה תוך ניטור שוטף של התהליך.

ניתן לפצל דגימה רכזת זו ולנתח אותה בג'לים של SDS page באמצעות צביעת kumasi וכסף. אם הדגימות מיועדות לניתוח באמצעות מספקטורומטריית מסות, אנו ממליצים להשתמש בג'לים מסחריים מוכנים מראש. ניתן לאחר מכן לחלץ פסים בודדים ולזהות את החלבונים באמצעות מספקטורומטריית מסות.

במקרה זה, הפיתיון היה עכברי, EIF עבור חלבון E. היתרון של מערכת ה-tap הוא היכולת לבטא את החלבון המבוקש בשורת תאים ספציפית, ובהתאם לשורת התאים שמעניינת אתכם, היא מאפשרת גם לבטא את החלבון ברמות נמוכות יחסית, כפי שתחליטו. מכיוון שכל המודיפיקציות הפוסט-טרנסלציוניות והלוקליזציה נשמרות, ניתן לעיתים קרובות לנקות את הקומפלקס הטבעי.