מיים מודלים של הדמיה חיה של תאים 4D גידול: אינטראקציות microenvironment המשפיעים ממאירה התקדמות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבנות מודלים של תרביות משולבות בתלת-ממד, המכונים הנדסת ארכיטקטורה ומיקרו-סביבה של בלוטת החלב, או MAM, לשימוש בדימות תאי חיים של אינטראקציות בין תאים בזמן אמת. הדבר מושג תחילה על ידי ציפוי של לביבות זכוכית ב-DQ collagen one, שהן קולגן מסוג one שעבר השתקה של פיברובלסטים.

בשלב הבא, קולגן DQ (quenched collagen).Four. מטריצת קרום בסיס שחוברה מחדש מתווספת מעל שכבת קולגן DQ one שהתגבשה, שהיא מטריצת קולגן one עם פיברובלסטים משובצים. בשלב השלישי, תרחיף תאי אפיתל או תאי גידול מונח כשכבה מעל זכוכיות הכיסוי, מה שמאפשר לתאים להיקשר לקולגן ה-DQ, למטריצת קרום הבסיס המשוחזרת של collagen, four, ולאחר מכן מתווסף מצע גידול.

לבסוף, נעזרים במיקרוסקופיה קונפוקלית לביצוע דימיון ארבע-ממדי (4D), המנתח תמונה בשלושה ממדים מרחביים, בתוספת מימד הזמן של תרביות השיתוף (co-cultures) החיות של mam. בסופו של דבר, דימיון ארבע-ממדי מאפשר ויזואליזציה וניתוח של האינטראקציה הדינמית בין תאי גידול של השד לבין תאים אחרים של הסביבה המיקרו-גידולית העשויים להשפיע על המעבר לפנוטיפ פולשני. יתרון מרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימיון תוך-חי (intra vital imaging), הוא שהאינטראקציות הנצפות במודל שלנו הן בין תאים של מין אחד – תאי גידול אנושיים ותאים אנושיים הקשורים לגידול – ולא, למשל, בין תאי גידול אנושיים לתאי סטרומה של עכבר.

בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בתחילה, כיוון שהרכבת תרביות הליבה המרכזיות דורשת תחילה ויזואליזציה, ולאחר מכן מיומנויות בינוניות ותרגול כדי להצליח. התחילו בהנחת כיסוי פלסטיק מלבני שעקר באלכוהול. החליקו אותו לתוך צלחת תרבית של 35 מילימטר או השתמשו בצלחת mu של 35 מילימטר מבית IBI tree.

לאחר מכן, ערבבו את המספר הרצוי של פיברובלסטים עם DQ collagen. כעת, באמצעות מיקרופיפט של 100 µL, שאיפו ופזרו בזהירות 70 µL של תערובת פיברובלסטים ו-DQ collagen, מטריצת קולגן אחת, על פני כל שטח של לביבת הזכוכית (cover slip), והניחו את צלחת התרבית באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C ללא פחמן דו-חמצני למשך 30 דקות. לאחר שהמטריצות התמצקו, המתינו 10 דקות להגעה לשיווי משקל באינקובטור של 37 °C עם 5% carbon dioxide.

לאחר מכן, הנח את הצלחת תחת מנדף עד שתגיע לטמפרטורת החדר. הוסף 60 µL של DQ collagen, ארבעה reconstituted basement membrane matrix על גבי ה-DQ collagen שהתמצק, ואחד, collagen one matrix עם פיברובלסטים מוטמעים. לאחר מכן, בעזרת טיפ של פיפטה, פרס את ה-DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix בזהירות ובשווה, תוך הימנעות משריטה של הפיברובלסטים ב-DQ collagen one, collagen one matrix.

לאחר מכן, העבירו את הצלחת ואת כיסוי הזכוכית (cover slip) לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 10 דקות, בזמן שמרכיב ה-DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix מתמצק; בצעו trypsinization לתאי העיניים וספרו את התאים עבור התרבית המשולבת (co culture). כעת, טפטפו 50 µL של ת сусפנסיות התאים על כיסוי הזכוכית המצופה והניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 40 עד 60 דקות כדי לאפשר לתאים להיקשר ל-DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix. לאחר שהתאים נקשרו למטריצה, הוסיפו 2 mL של מצע גידול המכיל 2% reconstituted basement membrane לצלחת ה-35 millimeter.

לאחר שטיפה עם PBS, דגרו את התרביות המשולבות (co-cultures) עם 5 µM של CellTracker Orange במצע MEGM באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 45 דקות. לאחר הדגירה, שטפו שוב את התרביות המשולבות עם PBS ודגרו אותן עם מצע MEGM מחומם מראש למשך 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. דגרו למשך פרק הזמן הרצוי לפני הדימות. דמיינו את התרביות המשולבות החיות בהגדלה נמוכה; לדוגמה, בהגדלה של 10x עם עדשת טבילה במים (water dipping lens) במיקרוסקופ קונפוקאלי, צלמו חתכים אופטיים במרווחים של 10 micron לכל אורך עומק המבנים.

השתמשו בחתכים האופטיים כדי לשחזר את התמונות בתלת-ממד באמצעות תוכנת velocity או תוכנה דומה. הפקו סרטונים של השחזורי התלת-ממד כך שניתן יהיה להמחיש את המבנים, את האינטראקציות בין תאים ואת האינטראקציות עם המטריצה הסובבת. בדיאגרמה סכימטית מייצגת זו של תרבית משותפת, צלחון IBI treat קודם כסה בשכבת קולגן, אחד הכיל DQ collagen, ואחד הכיל פיברובלסטים כפי שניתן לראות כאן בצבע מגנטה.

לאחר מכן הוספה שכבה שנייה של קרום בסיס משוחזר הכוללת DQ collagen four. לאחר מכן, תאי גידול המסומנים באדום נזרעו מעל שכבה של 2% קרום בסיס משוחזר בתרבית.

מדיה, המיוצגת על ידי הנקודות בצבע קרם, הוספה בכל החלפת מדיה. תוצרי הפירוק הפלואורסצנטיים של DQ collagen one ו-DQ collagen four מיוצגים בירוק. במהלך 23 הימים של תרבית משותפת מייצגת זו של MCF 10 DCIS ו-WS 12 TI, נצפתה פרוליפרציה של התאים המדגימים כאן ובדמויות הבאות, באדום, וכן פירוק של DQ collagen four ו-DQ collagen one, כפי שנצפה כאן ובדמויות הבאות, בירוק, וכן פירוק של מטריצות קולגן כפי שניתן לראות מהפחתה בנפח של התרביות המשותפות.

אותן תרביות שיתוף חיות נבחנו לאורך 23 הימים, כאשר תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בימים 3, 16 ו-23 של תרבית השיתוף. האינטראקציות בתרביות השיתוף של ה-Mame הן דינמיות ועשויות להשתנות עם הזמן. לדוגמה, כפי שניתן לראות במודל תלת-ממדי זה של תרבית השיתוף של תאי ה-mam ביום השלישי, התאים רק מתחילים להתרבות במטריצות בנקודת זמן זו, והם עדיין יציבים למדי, כפי שמעיד היעדר פלורסצנציה ירוקה.

עם זאת, עד ליום ה-16, ככל שהתאים המשיכו להתרבות, הם החלו גם לפרק את מבנה המטריקס, כפי שנצפה כאן על ידי תוצרי הפיצול one ו-four של DQ collagen בירוק, והפירוק הפעיל של המטריקס על ידי התאים, שבו המטריקס והתאים פולטים פלואורסצנציה משותפת הנראית בצהוב. עד ליום ה-23, כמעט מחצית מהמטריקס פורקה על ידי התאים שתרבו במהירות, בהשוואה ליום השלישי שבו נפח התרבית המשולבת היה 110,000 cubic micrometers. בין יום 16 ל-23, הנפח הצטמצם ל-46,250 cubic micrometers בלבד ביום זה.

בקו-קלטורה 16, ניתן להבחין בפרוטאוליזה של DQ collagen four על פני תאי ה-DCIS באדום, ובפרוטאוליזה דיפוזית של DQ collagen one באזורים הסמוכים לפיברובלסטים בלבן. הצביעה הדיפרנציאלית שנעשה בה שימוש בקו-קלטורה זו מאפשרת גם תצפית על דפוסי נדידה ושגשוג נבדלים של שני סוגי התאים לאחר התפתחותם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום סרטן השד לבחון את השפעות המקרו-סביבה של הגידול על התקדמות הסרטן, תוך שימוש בדימוי של תאים חיים של אינטראקציות דינמיות בין תאי סרטן לתאי הסטרומה הסובבים אותם.