מיים מודלים של הדמיה חיה של תאים 4D גידול: אינטראקציות microenvironment המשפיעים ממאירה התקדמות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבנות מודלים של תרבית משולבת בתלת-ממד, המכונה הנדסת ארכיטקטורה ומיקרו-סביבה של רקמת השד, או MAM, לשימוש בדימות תאים חיים של אינטראקציות בין תאים בזמן אמת. הדבר משיג תחילה על ידי ציפוי של לבישי זכוכית (cover slips) במטריצה של collagen one שקומיקה ב-fibroblast D quenched, או DQ collagen one.

בשלב הבא, קולגן מסוג I שעבר כיבוי (quenched) הוסף. ארבעה. מטריצת קרום בסיס משוחזרת מוספת מעל שכבת ה-DQ collagen one שהתמצקה, מטריצת קולגן אחד עם פיברובלסטים מוטמעים. בשלב השלישי, תרחיף של תאי אפיתל או תאי גידול מונח כשכבה מעל לכיסויי הזכוכית (coverslips), מה שמאפשר לתאים להיקשר ל-DQ collagen, לארבע מטריצות קרום בסיס משוחזרות, ולאחר מכן מתווסף מצע גידול.

לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לביצוע דימוי ארבע-מימדי (4D), המנתח תמונה בשלושה ממדים מרחביים, בתוספת זמן, של תרביות מקו עם ממקים (mam co cultures) חיים. בסופו של דבר, דימוי 4D מאפשר ויזואליזציה וניתוח של האינטראקציה הדינמית בין תאי גידול של השד לתאים אחרים של הסביבה המיקרו-גידולית שעשויים להשפיע על ההתקדמות לפנוטיפ פולשני. יתרון מרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוי תוך-חי (intra vital imaging), הוא שהאינטראקציות הנצפות במודל שלנו הן בין תאים של מין אחד – כלומר בין תאי גידול אנושיים לתאים אנושיים הקשורים לגידול – ולא, למשל, בין תאי גידול אנושיים לתאי סטרומה של עכבר.

בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בתחילה, כיוון שהרכבת תרביות הליבה המרכזיות דורשת תחילה ויזואליזציה, ולאחר מכן מיומנויות בינוניות ותרגול כדי להגיע להצלחה. התחילו בהנחת כיסוי פלסטיק מלבני שעקר באלכוהול. החליקו אותו לתוך צלחת תרבית של 35 מילימטר או השתמשו בצלחת mu של 35 מילימטר מבית IBI tree.

לאחר מכן, ערבבו את מספר הפיברובלסטים הרצוי עם קולגן DQ. לאחר מכן, בעזרת מיקרופיפט של 100 µL, שאיפו והפריסו בזהירות 70 µL של תערובת פיברובלסטים וקולגן DQ, מטריצת קולגן אחת, על פני כל שטח של הלוחית המכסה (coverslip), והניחו את צלחת התרבית באינקובטור לח 37 °C ללא פחמן דו-חמצני למשך 30 דקות. לאחר שהמטריצות התגבשו, המתינו 10 דקות להשגת שיווי משקל באינקובטור 37 °C עם 5% carbon dioxide.

לאחר מכן, הניחו את הצלחת תחת מנדף עד שתגיע לטמפרטורת החדר. הוסיפו 60 µL של DQ collagen, four reconstituted basement membrane matrix מעל ה-DQ collagen שהתגבש, ו-one, collagen one matrix עם פיברובלסטים מוטמעים. לאחר מכן, בעזרת טיפ של פפית, פזרו בזהירות ובאופן שווה את ה-DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix, תוך הימנעות משריטה של הפיברובלסטים ב-DQ collagen one, collagen one matrix.

לאחר מכן, העבירו את הצלחת ואת לבידת הכיסוי לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 10 דקות, בזמן ש-DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix מתמצק. בצעו trypsinization וספרו את התאים עבור התרבית המשותפת (co culture). כעת, הניחו 50 µL של תגלי התאים על לבידת הכיסוי המצופה והכניסו את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 40 עד 60 דקות כדי לאפשר לתאים להיקשר ל-DQ collagen four reconstitute a basement membrane matrix. לאחר שהתאים נקשרו למטריצה, הוסיפו 2 mL של מצע גידול המכיל 2% reconstituted basement membrane לצלחת ה-35 mm.

לאחר שטיפה ב-PBS, הדגרימו את תרביות השילוב (co-cultures) עם 5 µM Cell Tracker Orange בתוך מצע MEGM באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך 45 דקות. לאחר ההדגרה, שטפו שוב את תרביות השילוב ב-PBS והדגרימו אותן עם מצע MEGM שחומם מראש למשך 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2. דגמו תמונות של תרביות השילוב החיות בהגדלה נמוכה, למשל ב-10x עם עדשת טבילה במים (water dipping lens) במיקרוסקופ קונפוקלי, ולכדו חתכים אופטיים במרווחים של 10 micron לאורך כל עומק המבנים.

השתמשו בחתכים האופטיים כדי לשחזר את התמונות בתלת-ממד באמצעות תוכנת Velocity או תוכנה דומה. צרו סרטונים של השחזורי התלת-ממד כדי שניתן יהיה להמחיש את המבנים, את האינטראקציות בין התאים ואת האינטראקציות עם המטריצה הסובבת. בדיאגראמה סכימטית מייצגת זו של תרבית משותפת, צלחית mu שעברה טיפול IBI קוּשייה תחילה בקולגן, אחת הכילה DQ collagen, ואחדת הכילה פיברובלסטים, כפי שרואים כאן בצבע מגנטה.

לאחר מכן, נוספה שכבה שנייה של קרומי בסיס משוחזרים המכילים DQ collagen four. לאחר מכן, תאי גידול בצבע אדום נזרעו מעל שכבת 2% של קרומי בסיס משוחזרים בתרבית.

המדיה, המיוצגת על ידי הנקודות בצבע קרם, הוספה בכל החלפה של המדיה. תוצרי הפיצול הפלואורסצנטיים של DQ collagen one ו-four מיוצגים בירוק. במהלך 23 הימים של תרבית משותפת מייצגת זו של MCF 10 DCIS ו-WS 12 TI, נצפתה פרוליפרציה של התאים המצולמים כאן ובאיורים הבאים, באדום, וכן פירוק של DQ collagen four ו-one שנצפה כאן ובאיורים הבאים, בירוק, ופירוק של מטריצות קולגן כפי שמעידה ההפחתה בנפח של התרביות המשותפות.

אותן תרביות משולבות חיות נ beobserved לאורך 23 הימים, כאשר תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בימים 3, 16 ו-23 של התרבית המשולבת. האינטראקציות בתרביות המשולבות של Mame הן דינמיות ועשויות להשתנות עם הזמן. לדוגמה, כפי שניתן לראות במודל תלת-ממדי זה של תרבית משולבת של תאי mam ביום השלישי, התאים רק מתחילים להתרבות במטריצות בנקודת זמן זו, והם עדיין יציבים למדי, כפי שמעיד ההיעדר של פלואורסצנציה ירוקה.

עם זאת, עד היום ה-16, ככל שהתאים המשיכו להתרבות, הם החלו גם לפרק את מבנה המטריצה כפי שנצפה כאן באמצעות DQ collagen, כאשר תוצרי הפיצול one ו-four מופיעים בירוק, והפירוק הפעיל של המטריצה על ידי התאים נראה במקומות בהם המטריצה והתאים פולטים פלואורסצנציה משותפת בצבע צהוב. עד היום ה-23, כמעט מחצית מהמטריצה פורקה על ידי התאים המתרבים במהירות, בהשוואה ליום השלישי שבו נפח התרבית המשותפת היה 110,000 cubic micrometers. בין היום ה-16 ל-23, הנפח הצטמצם ל-46,250 cubic micrometers בלבד ביום זה.

בתרבית משותפת, ניתן להבחין בפרוטאלולזה של DQ collagen ארבע על פני תאי ה-DCIS באדום, ובפרוטאלולזה מפוזרת של DQ collagen אחת באזורים הסמוכים לפיברובלסטים בלבן. הצביעה הדיפרנציאלית שנעשה בה שימוש בתרבית משותפת זו מאפשרת גם לצפות בדפוסי נדידה ושגשוג נפרדים של שני סוגי התאים לאחר התפתחותם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום סרטן השד לחקור את ההשפעות של המקרו-סביבה הגידולית על התקדמות הסרטן, תוך שימוש בדימות תאים חיים של אינטראקציות דינמיות בין תאי סרטן לתאי סטרומה מקיפים.