Name: הכלאה באתרו של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: למד את פרוטוקול ההכלאה באתרו לזיהוי תבניות הצטברות RNA בבלוטות הרוק, השחלות ועוברים של יתושים. שיטה זו מאפשרת חקירת ביטוי גנים בפונקציונליות גנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות מריקה וולטרס עצה ב ההכלאה בפיתוח שיטות באתרו של רקמות רכות Goltsev יורי לדיון פרוטוקולים של הכלאה באתרו של עוברים gambiae אנופלס, שהיו מותאמים לאחר מכן ולשנות לפתח פרוטוקול המתואר כאן ההכלאה ב באתרו של Aedes ועוברים Culex. כמו כן, אנו מכירים המלצות מועילות שניתנו על ידי אדם לקלף ודוד קוסמן. אנו מודים אוסוולדו Marinotti לדיון מדעי עריכת טקסט בפרוטוקול.

<ol><li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit.+Vectors%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1(2011).</li>
<li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228(2007).</li>
<li>Benedict, M. Q. Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research%22">Methods in Anopheles Research</a>. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). (2007).</li>
<li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSappington%2C+TW+%22The+Molecular+Biology+of+Insect+Disease+Vectors%3A+A+methods+manual%22">The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual</a>. , Chapman & Hall. London. (1997).</li>
<li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li>
<li>Benedict, M. Q. Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research.+Malaria+Research+and+Reference+Reagent+Resource+Center+%28MR4%29%22">Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</a>. , (2007).</li>
<li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes%2C+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li>
<li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+structure+and+expression+of+nanos+%28nos%29+and+oskar+%28osk%29+orthologues+of+the+vector+mosquito%2C+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+Morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. & Embryol. 4, 517-528 (1975).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. & Embryol. 7, 273-296 (1978).</li>
<li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg%5BTitle%5D)+AND+%22Izv.+Akad.+Nauk+SSSR+ser.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li>
<li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li>
<li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584(2011).</li>
<li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+%28Diptera%3A+Culicidae%29+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29+I.+Description+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li>
</ol>

החוקרים אין גילויים.

ההכלאה בפרוטוקול מכתים באתרו colorimetric הציג כאן כולו הר רקמות היתושים ועוברים היא טכניקה שימושית לוקליזציה של תמלילי בתוך איברים ספציפיים סוגי תאים. נהלים אלה הם שיפור לעומת שיטות שפורסמו בעבר שלנו, הן ייעול צעדים לשטוף נרחבים ומתן פרטים טכניים נוספים ומקורות מגיב. מניסיוננו, איתור colorimetric של אותות הכלאה עדיפה ברגישות ובהירות של אות הכלאה לעומת הקרינה המבוססים על ערכות זיהוי. איתור colorimetric יתר על כן עוקף בעיות הקשורות אפליה האות עוברים, שהם מטבעם אוטומטי ניאון. מגבלות של גילוי אותות הכלאה להתרחש, כאשר נמוכה שפע תמלילי ממוקדות ולא מכתים רקע ניכר. הגדלת הטמפרטורה הכלאה עד 65 ° C נמצא לצמצם חזרההכלאה הקרקע אותות, אך אינו מהווה תחליף הציע לעיצוב ייחודי יעד ספציפיים בדיקות RNA. פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לבצע הכלאה באתרו של שלמה, הר בלוטות הרוק של Aedes aegypti, ושחלות ועוברים של gambiae אנופלס, אנופלס stephensi, AE. aegypti ו Culex quinquefasciatus. שיטה זו ישימה גם לרקמות יתושים אחרים, ומן הסתם אלה של חרקים אחרים. בנוסף, אנו נערך על ההנחיות הפעם הראשונה ההשוואה הזמני של ההתפתחות העוברית ב 3 וקטור יתושים, AE. aegypti,. gambiae ו Cx. fatigans. תוכן דווחו על זנים מסוימים של שלושת המינים, גידול בתנאים דיסקרטיים. חשוב לציין כי במהלך תקופה התפתחותית יכול להשתנות על זנים שונים של מין יתושים ובתנאים גידול שונים. הכלאות במוסף באתרו מתמשך המאמצים לאנהlyze את transcriptomes של יתושים פרוקי רגליים אחרים, עשויה לספק תמונה טובה יותר של רגולציה של ביטוי גנים באורגניזמים אלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> 0.5 מ &#39;EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;ל צינורות microfuge </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> אטום פחות צינורות סטנדרטיים, מסייע לדמיין דגימות </td></tr><tr><td> Deionized לפוראמיד </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC מים </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן 5.25% hypochlorite </td><td> אוסטין של </td><td></td><td> A-1 מותג </td></tr><tr><td> RNA פולימראז T3-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> T7-RNA פולימראז </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% אתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand חד פעמיות העברת פוליאתילן בטפי להחדרת נוזלים </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% פורמלדהיד </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC כיתה מתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית מיקרוסקופ </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-542A </td><td> 18 X18 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> N-heptane </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-קסילן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> פיירקס 9-Spot גם פלייט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן הידרוקסידי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / פלוס מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Davlyn אדום תוחם ברור, פאה קלטת </td><td> ישיר שיער </td><td> RED-75R12 </td><td> פולי / בסיס סקין חומר 0.75 ב 12 רול קלטת x yd </td></tr><tr><td> ערכת TOPOTA שיבוט של Sequening בירייה אחת Top10 כימי המוסמכת א &#39; coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 תגובות 40 תגובות </td></tr><tr><td> סלמון Sonicated הזרע DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> נגד digoxigenin-AP Fab שברים </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 1093274 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG-RNA תיוג תמהיל </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 1277073 </td><td> אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP המניות פתרון </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 1681451 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> מגיב חסימת המערבי </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 11921673001 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene הייטק פוליאסטר רשת (330.130) </td><td> Saati הדפסה </td><td> 330.34 אואו PW </td><td> 330 אשכולות / אינץ, 34 חוט בקוטר מיקרון, כתום צבע </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> סיגמא </td><td> G6279-1 </td><td> 70% PBT </td></tr><tr><td> הפרין מלח </td><td> סיגמא </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> סיגמא </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% פורמלדהיד </td><td> טד פלה </td><td> 18508 </td><td> Aliquots 10 מ&quot;ל ענבר אמפולות </td></tr><tr><td> 16 גר &#39;. נייר סולו מיכלים עם מכסים </td><td> חברת נייר </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> ההתכה של זכוכית בורו scintillatיון בקבוקון עם מכסה בורג פנוי </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 66022-128 </td><td> 20 מ&quot;ל במקרה של 500 </td></tr><tr><td> אטום האוויר Bubble Wrap celluar חומר ריפוד </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 500018-081 </td><td> 10 מטר / גליל 0.188 אינץ&#39; עבה </td></tr><tr><td> עוף סרום </td><td></td><td></td><td> הדם נאסף כולו או מעורק הזרוע או לנקב לב של עוף צעיר. דם הודגר על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עד קרוש והניח לאחר מכן למשך 30 דקות על הקרח. סרום נאסף centrifuged ב XG 3000 עבור 10 דקות. Supernatant וכתוצאה מכך (הבהיר סרום) נאסף ונשמר ב -20 ° C עד השימוש. </td></tr></tbody></table> לוח 4. טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד הכלאה באתרו.

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

יתושים הם וקטורים עבור קבוצה מגוונת של פתוגנים כולל arboviruses, טפילים protozoan ו נמטודות. תמלילי חקירת ורגולטורים גנים באים לידי ביטוי ברקמות שבהן המארח יתושים אינטראקציה הפתוגן, וגם באיברים מעורבים ברבייה הם עניין רב על אסטרטגיות להפחתת יתושים העברת מחלות ולשבש פיתוח ביצה. מספר כלים להיות מועסק ללמוד לאמת את הרגולציה הזמני רקמות מסוים של ביטוי גנים. כאן, נתאר פרוטוקולים שפותחו כדי להשיג מידע מרחבי, אשר משפר את הבנתנו בו גנים מסוימים מתבטאים ומוצריהם לצבור. פרוטוקול המתואר נעשה שימוש כדי לאמת את הביטוי ולקבוע דפוסי הצטברות של תמלילי ברקמות הקשורים שידור יתושים הפתוגן, כגון בלוטות הרוק הנשי, כמו גם תאים subcellular של השחלות של העובר, אשר מחדשמאוחר רבייה התפתחות יתושים. ההליכים הבאים מייצגים המתודולוגיה אופטימיזציה המשפר את היעילות של הפעולות השונות פרוטוקול ללא הפסד של יעד ספציפיים אותות הכלאה. הנחיות להכנת בדיקה RNA, דיסקציה של הרקמות הרכות ואת נוהל כללי של קיבעון ואת ההכלאה מתוארים חלק, ואילו צעדים ספציפיים לאיסוף, קיבעון, הכלאה טרום הכלאה של עוברים יתושים מפורטים חלק ב &#39;

זמן ומרחב ביטוי ניתוח גנטי תפקיד מכריע גנומיקה תפקודית. כל הכלאה-Mount<em&gt; באתרו</em&gt; שימושי לקביעת לוקליזציה של תמלילי בתוך רקמות ותאים subcellular. כאן מתאר הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; פרוטוקול עם שינויים של רקמות יעד ספציפיים יתושים.

יתושים הם וקטורים למגוון רחב של פתוגנים, כולל ארבּו-וירוסים (arboviruses), טפילים פרוטואוזואים ונמטודות. חקירת תמלילי RNA וגנים...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע היברידיזציה in situ לקביעת דפוסי הלוקליזציה וההצטברות של תסכירים (transcripts) ספציפיים בתוך רקמות ועוברי יתוש. דבר זה מושג תחילה על ידי קיבוע של רקמות היתוש או העוברים, כך שמבנה העל של הרקמה ומטרות ה-mRNA יישמרו ויהיו זמינים להיברידיזציה עם גשושים של RNA antisense. לאחר מכן, גשושי ה-RNA antisense עוברים היברידיזציה עם התסכירים המטרה בתוך הרקמות או העוברים המקובעים.לאחר מכן, מבוצעים שיטוני צביעה של נוגדנים כולורמטריים לצחלת כדי לזהות את מיקום ותבאי הצבירה של ה-mRNA המטרה. התוצאות המתקבלות מראות תבאי מרחביים של צבירת RNA המבוססים על היברידיזציה ב-C two ושיטות זיהוי כולורמטריות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגנומיקה התפקודית, כגון בחינת המועד והמיקום שבהם מצטברים תוצרי גנים בתוך היתוש.נוהל זה מאפשר לנו גם להשיג מידע על לוקליזציה מרחבית כדי להבין טוב יותר כיצד מוסדר ביטוי גנים עבור תהליכים ביולוגיים כגון התפתחות הרבייה ואינטראקציות בין פתוגנים ליתושים. כדי להכין את רקמות היתוש להכלאה (hybridization) עם ג probes של RNA המסומנים ב-digoxigenin, התחילו בהוצאת השחלות ובלוטות הרוק. לאחר מכן, קבעו את הרקמה וטפלו בה ב-proteinase K במידת הצורך.לאחר שביצעו קיבוע משני לרקמות, יש להביאן לשיווי משקל במיליליטר אחד של תערובת ביחס של אחד לאחד של תמיסתו היברידיזציה PBT או HIB PBT למשך 30 דקות תוךما ערבוב, להמתין ליישוב הרקמה ולאחר מכן לשפוך החוצה כמה שיותר HI PBT. לאחר מכן, יש להוסיף מיליליטר אחד של HIB לתוך כל מבחנה של דגימה. יש לעטוף את מבחנת הדגימה באריזה אטומה להגנה מהאוויר, כגון פצפצות, ולהניח אותה בתוך בקבוק היברידיזציה.אטמו את הבקבוק באמצעות מכסה לבקבוק היברידיזציה והדגירו אותו בטמפרטורה של 55 degrees Celsius למשך 30 דקות תוך כדי סיבוב. לאחר הוצאת הבקבוק מהאינקובטור והמתנה לשקיעת הרקמה, שפכו בזהירות את בופר טרום-ההיברידיזציה, והשאירו 50 µL מהתמיסה בפסולה למניעת אובדן דגימה. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של בופר Prewarm high לאותה דגימה והניחו אותה בבלוק חימום המוגדר ל-55 degrees Celsius; דנטורו את הגשוש RNA שהוכן מראש בטמפרטורה של 85 degrees Celsius למשך חמש דקות.לאחר מכן, הניחו את המבחנה מיד על קרח למשך חמש דקות. בשלב הבא, העבירו בעזרת פיפט את גשש ה-RNA אל מבחנת הדגימה. גשש ה-RNA יצוף על פני תמיסת ה-HI.ערבבו על ידי נקישה על המבחנה. דגרו בעדינות את הדגימות במעמד מיקרו-צנטריפוגה מקובע בתוך תנור היברידיזציה בטמפרטורה של 55 °C למשך 16 עד 24 שעות. לאחר מכן, בצעו טיפול ב-RNAs וצביעה בנוגדנים כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.בצעו עיגון של דגימות הרקמה על ידי העברה של הדגימות לתוך בארות בודדות בעלות תחתית עגולה של לוחית בדיקה (spot plate) מסוג Pyrex, באמצעות טיפ של פפית של 200 µL. הסירו כמה שיותר מה-PBT וכסו את הדגימה ב-70% glycerol במים. המתינו לספיגת הגליצרול בדגימה בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה.להכנת סמ स्लाइड्स למיקרוסקופ, התחילו בניגוב נקי של פני השקף בעזרת ניגובים מסוג Kim wipes. לאחר מכן, הדביקו שני רצועות של סרט דביק שקוף במקביל זו לזו, כך שיצרו תעלה צרה, באמצעות מברשת ציירים. אספו את הדגימות אחת אחת והניחו אותן לאורך התעלה, תוך מיקום כל דגימה באותו אוריינטציה ביחס לצירים הקדמי (anterior), האחורי (posterior), והגבי-בטני (dorsal ventral).לאחר מיקום כל דגימה, השתמשו בנייר ניגוב מסוג Kim wipe כדי לספוג את תמיסת הגליצרין העודפת שסביב הרקמות. הסרת הגליצרין העודף חשובה כדי למנוע היווצרות בועות בעת איטום הדגימות המורכבות על השקופית תחת זכוכית כיסוי. הניחו בזהירות זכוכית כיסוי מעל התעלה המכילה את הדגימות המסודרות. בעזרת לק שקוף, הצמידו את זכוכית הכיסוי לשקופית באופן חצי-קבוע על ידי דיבוק הפינות. בעזרת פיפטור של 200 µL, טפטפו לאט 70% glycerol לקצה אחד של התעלה כדי למלא את התעלה ואת האזור שמתחת לזכוכית הכיסוי באופן קבוע.אטמו את הדגימות המורכבות על ידי מריחת לק לאורך ארבעת צדדיו של לביש cover slip. המתינו לייבוש מלא של הלק לפני הדמיית הדגימות. לאחר איסוף עובריים מכלוב של 300 נקבות יתושים בוגרות והרשבובות, ולאחר שהם התפתחו לשלבים הרצויים, העבירו אותם ממכל האיסוף לשפופרת לכידה עם רשת tylene עבור שמונית עובריים.הניחו את מבחנת האיסוף בתוך כוס כימית מלאה במים מזוקקים בכמות כזו שנפח מבחנת האיסוף יהיה מלא עד מחציתו. השתמשו במברשת צבע כדי לשחרר את העובריים מרשת ה-tylene ולהעביר אותם אל מבחנת האיסוף המלאה במים. עבור מספר רב של עובריים, נתקו את רשת ה-tylene ממכל האיסוף וקפלו את הרשת בזהירות ליצירת משפך, תוך החזקת משפך הרשת ביד אחת.השתמש ביד השנייה כדי להתיז מים לאורך דפנות המשפך כדי לשטוף את העובריים אל תוך נבובת האיסוף. ניתן להחיל שיטה זו על עובריים עם anomlies מכיוון שחסר להם החומר הדביק הנמצא על פני השטח של עובריים בריאים, המאפשר לביציות להיצמד למצעים סמוכים. הכן 40 milliliters של תמיסת דה-קורונציה ושפוך את התמיסה לתוך צלחת פטרי של 100 millimeter.הוסיפו 50 milliliters של מים מזוקקים לכלי זכוכית (beaker) בנפח 100 milliliters והניחו אותו בצד. לאחר מכן, העבירו את העובריים לפטריה עם תמיסת דקומיסציה (dec decoration solution). השתמשו בפיפטה להעברה מפלתילין חד-פעמית כדי לשטוף את העובריים תוך כדי סיבוב של מבחנת האיסוף, כך שהעובריים יישארו טבולים ומעורבבים בתמיסת הדקומיסציה.הדקורציה (Decoration) היא אחד השלבים הרגישים ביותר בפרוטוקול, וטיפול ממושך מדי בנתרן היפוכ לוריט בעוברי 8-cell ימנע פיצול תקין של ה-endocorion. עבור עוברי 8-cell נדרש זמן של מקסימום 35 שניות, בעוד ש-75 שניות מספיקות לעוברי 16-cell. יש לאמת את הדקורציה תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה. בעוברי 8-cell יחסר ה-exocorion בעל המראה הרשתי, ואילו בעוברי 16-cell תהיה נוכחת רק השכבה החלקה והמלוטשת של ה-endocorion השחור.המבנים של ה-exo chorionic floats וה-ridge ייעלמו ברגע שהעוברים יצופו. המשיכו בקיבוע ובפירוק של ה-endo corion לפי הפרוטוקול המפורט בהוראות הכתובות. כדי לקלף את ה-endo Corion המפורק, הניחו פיסה של סרט דו-צדדי (toupee tape) במרכז של Petri dish בקוטר שלושה סנטימטרים, באמצעות טיפ של פיפט של 200 microliter בעל פיה רחבה.העבירו את העובריים מהמתנול אל הסרט ההדבקה הדו-צדדי. המתינו דקה עד שתי דקות עד שהעובריים ישקעו וידבקו למשטח הסרט, שפכו את עודפי המתנול, והניחו למשטח להתייבש מעט במשך דקה עד שתי דקות. לאחר מכן, הוסיפו אתנול 95% אל צלחת הפטרי כדי לקבע את העובריים עוד יותר על הסרט, העבירו בפיפטה 600 µL של מים מזוקקים אל האתנול וסובבו לערבוב.בשלב הבא, השתמשו במחט 27.5 המחוברת למזרק של 1 מיליליטר כדי לקלף את ה-endo corion הסדוק. לאחר שחרור העוברים הלבנים משאריות ה-endo corion השחורות באמצעות מכחול אמנות בעל חוד דק, העבירו מיד את העוברים מהסרט למאגר האתנול בצלחת הפטרי. לאחר מכן, באמצעות טיפ פטה של 3 מילימטר, העבירו את העוברים לשפרורת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכילה 500 µL של Ethanol 100%. לבסוף, שטפו את העוברים שתיים עד שלוש פעמים ב-Ethanol 100% ואחסנו את העוברים באתנול טהור בטמפרטורה של 20°C-.בדמות זו, ב-C, שתי היברידיזציות של בלוטות רוק של נקבות *Aedes aegypti* (whole mount) עם גששי mRNA המכוונים ל-amylase 1D seven S two ו-D seven L two מראות את הצטברותם של תמלילים אלו באונות הפרוקסימליות-לטרליות, הדיסטליות-לטרליות והדיסטליות-לטרליות-מדיאליות, בהתאמה. בניסוי זה, Cytes (whole mount) של שלושה מיני יתושים עברו היברידיזציה עם גששי mRNA המכוונים ספציפית לתמלילים האוטולוגיים המתאימים של *oscar*. כאן, ב-C, בוצעה היברידיזציה של עוברי *Anopheles gambiae*, *Aedes aegypti* ו-*Culex quinquefasciatus* (whole mount) באמצעות גששי RNA אנטיסנס המכוונים לתמלילי *oscar* האוטולוגיים המתאימים של כל יתוש.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ניסוי של היברידיזציה in situ לקביעת המיקום וההצטברות של תסניכים (transcripts) ברקמות ספציפיות של יתושים או בעוברים.

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטות באמצעות מערכות alphavirus transducing להביע כתבים פלורסנט במבחנה יתושים בוגרים מתוארים. טכניקה זו עשויה להיות מותאם כדי להביע כל חלבון של עניין במקום או בנוסף לכתב.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

בין השלושה סוגי היתושים,...

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה microinjection לנו יש סטנדרטית, ומשמש מזה מספר שנים כדי לספק כמויות מסוימות של חומצות גרעין ישירות hemolymph של יתושים וזבובים הבית. פרוטוקול זה תוצאות בתמותה הזרקת מינימלית ומאפשר במינון בקורלציה מדידות של פוריות.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

מתודולוגיה זו, שכללה הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה, יכולה להעריך ביעילות את ההשפעה של מחסומי המעי התיכון ו / או בלוטת הרוק על זיהום arbovirus.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

בהתחשב באנטומיה הפשוטה שלהם, אשכי אנופלס מציעים מודל ציטולוגי טוב לחקר זרע. פרוטוקול זה מתאר הכלאה פלואורסצנטית באתרה , טכניקה המשמשת לחקר תהליך ביולוגי זה, כמו גם את הפנוטיפ של זנים טרנסגניים בעלי מוטציות בגנים המעורבים בייצור זרע.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

המאמר מתאר את השיטות והריאגנטים הדרושים לביצוע הכלאה של תגובת שרשרת RNA, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (HCR RNA, WM-FISH) כדי לחשוף תובנות לגבי הרזולוציה המרחבית והתאית של גנים קולטנים כימו-סנסוריים באנטנת היתושים ובמישוש המקסילרי.

תגובת שרשרת הכלאה RNA פלואורסצנטיות מלאה באתרה הכלאה של גנים כימו-סנסוריים בתוספות ריח יתושים

קהילות מיקרוביאליות ביתושים טומנות בחובן הבטחה גדולה לאסטרטגיות הדברה ביולוגית וקטורית. רוב הסימביונטים אינם ניתנים לטיפוח, ודורשים ניתוחים מטגנומיים. אנו מתארים שיטה לנתח נקבות יתושים ולהפריד בין השחלות, המעי התיכון ובלוטות הרוק למניעת זיהום צולב, להקל על מחקרי מיקרוביום ברמת האיברים, ולשפר את ההבנה של תפקידי המיקרואורגניזמים בביולוגיה של יתושים.

דיסקציה של שחלות יתושים, מעי האמצע ובלוטות הרוק לצורך ניתוח מיקרוביום ברמת האיברים

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל...

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

למד את פרוטוקול ההכלאה באתרו לזיהוי תבניות הצטברות RNA בבלוטות הרוק, השחלות ועוברים של יתושים. שיטה זו מאפשרת חקירת ביטוי גנים בפונקציונליות גנומית.

הכלאה

גלה סרטונים נוספים