הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit
12 בדצמבר 2011
כאן אנו מדגימים את החדש שפותח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. שני תאים בשלב התפתחות העובר עם זרע קפוא מופשר השתפר באופן עקבי 5 זנים עכבר עם השימוש בערכה זו. במשך 1.5 שנים, 49 קווי עכבר מהונדסים גנטית היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכה ולאחר מכן התאושש בהצלחה על ידי הפריה חוץ גופית.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא שימור בהקפאה (cryopreservation) של זרע עכבר. הדבר מבוצע תחילה על ידי איסוף זרע מ-EPIs של עכבר באמצעות קשים לשימור בהקפאה. לאחר מכן, הקשים מוקפאים בחנקן נוזלי, שם הם נשמרים עד לשליפתם באמצעות הפשרה במים חמימים.
זרע העכברים שהוחזר משמש בסופו של דבר להפריה חוץ גופית (in vitro fertilization). היתרון המרכזי של ערכה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מכילה את כל החומרים הדרושים להקפאה ולהחזרה של זרע עכברים. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להתקשות בטיפול ובטעינה של קשים. התחל בהכנת 15 קשים להקפאת זרע עבור כל קו של עכברים המיועד להקפאה.
ראשית, חברו כל קש בנפח 0.25 milliliter למזרק של one milliliter, כאשר פקק הכותנה קרוב למזרק. שנית, טענו שמונה סנטימטרים של מצע IVF לתוך כל קש, ולאחריהם סנטימטר אחד של אוויר. שלישית, סמנו כל אחד מ-15 הקשים בשם השורה שברצונכם לשמר עבור כל שורה המיועדת להקפאה.
מלאו באר של צלחת בעלת ארבעה בארות ב-240 µL של חומר הגנה לקריו-שימור. חברו פיפט של 1 mL לידית של מכל ההקפאה כדי להאריך את הידית. לבסוף, מלאו את הקופסה מבודדת הספוג המצורפת לערכה ב-15 cm של חנקן נוזלי וסגרו את המכסה.
שני עכברי זכר בוגרים ופוריים. עבור כל שורה המיועדת להקפאה ולניתוח, הסר את ה-EPIs הזנביים שלהם. הנח את העכבר במצב שכיבה גבית ופתח את דופן הגוף הבטנית.
משכו בעדינות את ה-vast deference והסירו כל שומן עודף. לאחר מכן, אתרו את ה-epididymus והסירו אותו בשלמותו יחד עם פיסה קטנה של fast deference. הניחו את ה-EPIs לתוך באער של צלחת ארבעה באערים שהוכנה מראש והוטענה ב-CPA תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
בצעו חמישה עד שבעה חתכים לאורכיים בכל epididymis. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, לחצו בעדינות על כל חיתוך. כדי לדחוף החוצה את הזרע, דגרו את תערובת ה-CPA וה-epididymis בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד חמש דקות.
נער את הצלחת בעדינות ביד פעמיים עד שלוש פעמים במהלך הדגירה. פעולה זו תאפשר לזרע לשחות החוצה על ידי שאיבה. טען כל קש שהוכן עם 5 mm של תרחיף הזרע, ולאחר מכן עם 1 cm של אוויר.
חשוב לתהליך ההקפאה שכל הקשים יוטענו באופן שווה. לאחר טעינת כל 15 הקשים, יש לאטום בזהירות בעזרת חום את שני קצותיו של כל קש. כדי להבטיח את הישרדות הזרע, השלימו את התהליך עבור כל 15 הקשים בתוך 10 דקות.
לאחר שכל הקשים מוכנים, טענו אותם לעמוד הזרע שבמיכל ההקפאה. ראשית, הניחו את המיכל בתוך קופסת הספוג ואפשרו לו לצוף אנכית בחנקן נוזלי. על המיכל לצוף אנכית במשך 10 דקות, אחרת קצב הקפאת הזרע ייפגע.
לאחר מכן, טבל את המיכל בחנקן נוזלי. בכך הזרע עובר קריו-שימור והוא מוכן לאחסון ארוך טווח בחנקן נוזלי. כ-60 שעות לפני תאריך השחזור המתוכנן של הזרע.
יש לפעול לפי הפרוטוקול הכתוב לביצוע סופר-אוביולציה בנקבות לפני IVF. עבור כל קש להפשרה, יש להכין ולהאזן את כל התמימות למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. חומרים אלו כוללים צלחת פטרי בקוטר 35 millimeter עם טיפה של 90 µL של תמיסת טיפול בזרע המכוסה בשמן.
הכינו צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר עם שלושה מיליליטר של מצע IVF שתשמש כצלחת חיתוך, ובגישה של צלחת IVF אחת עבור כל חמש נקבות שעברו גירוי להבשלת מספר רב של ביציות (super ovulated), כאשר צלחת IVF היא באר אחת בתוך צלחת בעלת ארבע בארות המכילה 500 microliters של מצע IVF. עבור כל צלחת IVF, הכינו צלחת שטיפה, שהיא צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר עם שלושה מיליליטר של KSOM, וצלחת תרבית לעוברים, שהיא צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר עם טיפות של 50 microliter של מצע KSOM המכוסות בשמן. לאחר הכנת כל החומרים הדרושים, הוציאו במהירות קש מהאחסון והניחו אותו באמבט מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך שתי עד שלוש דקות.
ייבשו את הקש. לאחר מכן, בצעו חיתוך אלכסוני בעמוד האוויר שמתחת לפקק הצמר. בקצה השני של הקש, בצעו חיתוך אלכסוני נוסף מעל עמוד אוויר אחר.
הימנעו מחיתוך עמוד הזרע. כעת, שאבו את תמיסת הזרע מקצה הקש, באמצעות פיפטה של 200 microliter, והעבירו אותה למרכז טיפת תוצר הטיפול בזרע. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך 45 עד 60 דקות.
במהלך דגירת הזרע, בודדו את ה-ucs של הנקבות שעברו גירוי להפקת ביצים מרובה והעבירו אותם לצלוחית חיתוך. השתמשו במחט בכיול 30 (gauge) או בפינצטה כדי לקרוע כל צינור ביצים ושחררו את קומפלקסי ה-cumulus cyte. העבירו C Cs מחמש נקבות לכל IVF.
השתמשו בכמות מינימלית של מדיום. הימנעו מהעברת שומן ודם, שכן מדיום מזוהם מעכב את יעילות ההפריה. לאחר האינקובציה, אספו 10 עד 15 µL של תרחיף הזרע מהיקף טיפת ה-STM והעבירו את התרחיף לתוך טיפת IVF אחת.
כעת בצעו תרבית משותפת (co-culture) של התאים למשך ארבע עד שש שעות לצורך הפריה. לאחר ההפריה, העבירו את העוברים דרך לפחות 2K שטיפות SOM בתוך כלי השטיפה. לאחר מכן, העבירו לתרבית.
את העוברים ב-KSOM עד להגעה לשלב ההתפתחות הרצוי. הזרע מחמש זני עכברים פנימיים (inbred) של Charles River הוקפא. יחסי ההגנה של ניידות הזרע ושל ניידות פרוגרסיבית מהירה נעו בין 81% ל-47% בחמישה זנים של זרע זה.
שיעורי ה-IVF עם זרע שהופשר לאחר הקפאה השתנו במאמנים שונים ונעו בין 26% ל-88% לאורך שנה וחצי. סך של 49 קווי עכברים GM נשמרו באמצעות הקפאת זרע ושוחזרו מאוחר יותר ב-IVF בארבעה מאמנים נקביים שונים: C 57 black six, BC DBA one ו-1 29 SV. ברגע ששולטת בטכניקה של הקפאת זרע, ניתן לבצע אותה תוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
עבור הליך זה, חשוב להזרים למכל בצורה אנכית ובחנקן נוזלי.
סקירה כללית
מחקר זה מציג את ערכת ה-I•Cryo להקפאה יעילה של זרע עכברים, המדגימה שיפור בהתפתחות העוברים במספר זני עכברים. הערכה מקלה על ארכוב של שורות עכברים שעברו שינוי גנטי באמצעות הקפאת זרע ושחזור מאוחר יותר באמצעות IVF.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של הרבייה
- טכניקות של שימור בהקפאה (Cryopreservation)
- הפריה חוץ-גופית (IVF)
רקע
- הקפאה של זרע עכברים היא חיונית למחקר גנטי.
- ייתכן ששיטות קיימות חסרות יעילות וקלות שימוש.
- ערכת I•Cryo נועדה לייעל את תהליך ההקפאה.
- השגה מוצלחת של זרע חיונית לתוצאות IVF.
מטרת המחקר
- להערכת יעילות ערכת ה-I•Cryo בהקפאה של זרע עכברים.
- לבחינת ההשפעה של זרע שהוקפא על התפתחות העוברים.
- לארכוב של זני עכברים שעברו שינוי גנטי למחקרים עתידיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף זרע מהאפידידימיס של עכבר באמצעות קשים להקפאה.
- הקפאת זרע בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
- הפשרת זרע לשימוש בהליכי IVF.
- הערכת ניידות הזרע ושיעורי ההצלחה של IVF במא時から שונים.
תוצאות עיקריות
- השגת שיפור בהתפתחות עוברית ב-5 זני עכברים תוך שימוש בערכת I•Cryo.
- ארכיב ושחזור מוצלח של 49 קווי עכברים מושנים גנטית.
- שיעורי ניידות תאי זרע נעו בין 81% ל-47% בין הזנים השונים.
- שיעורי IVF נעו בין 26% ל-88% בשימוש בזרע שהופשר לאחר הקפאה.
מסקנות
- ערכה של I•Cryo משפרת באופן משמעותי את יעילות ההקפאה של תאי זרע.
- התאוששות מוצלחת של שושים שעברו שינוי גנטי תומכת בתועלתה של הערכה למטרות מחקר.
- אופטימיזציה נוספת של השיטה עשויה להפחית את זמן העיבוד.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
קריו-שימור של זרע עכברים מספק פתרון חסכוני וניתן להרחבה לארכוב של זנים שעברו שינוי גנטי, ובכך מפחית את ההסתמכות על מושבות של חיות חיות וממזער את הסיכונים לאובדן של קווי תאיים. ערכת I•Cryo מגבירה את הביטחון בחיזוי של שימור הזנים על ידי שיפור ניידות הזרע לאחר הפשרה ושיפור התפתחות עוברים שהופקו ב-IVF על פני מספר רקעים גנטיים של זנים בעבודות פנים (inbred). דבר זה תומך בניהול אסטרטגי של פורטפוליו במחקר פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לאחסון ארוך טווח אמין ושחזור לפי דרישה של מודלים בעלי ערך למחקר מחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף תפקודי של מודלים גנטיים על ידי הבטחת יכולת השבה של זרע לצורך סריקה פנוטיפית מבוססת IVF.
- ערך תפעולי: מפחית את נטל גידול בעלי החיים ואת העלויות הכרוכות בתחזוקה של מושבות חיות של מודלים בעלי תפוקה נמוכה או מודלים הניתנים להשראה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מקור זרע סטנדרטי לבדיקות IVF עקביות, התומך בהערכה הדירה של השפעת תרכובות על הפריה והתפתחות עוברית מוקדמת.
- ערך תפעולי: מקל על מוכנות הבדיקה באמצעות זרע מאוחסן בקריובנק, ובכך מבטל שונות הנובעת מהבדלים בין תורמים זכרים או בין סדרות דגימות טריות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על השלמות הגנטית של מודלים למחלות לאורך זמן, מה שמאפשר מחקרים אורך והמשכיות ניסוינית בין דורות.
- ערך תפעולי: תומך בשיתופי פעולה בין מספר אתרים על ידי היתרה של הפצה של זרע קריו-משומר במקום בעלי חיים חיים, ובכך מפחית את מורכבות ההובלה ואת החשש לבטיחות ביולוגית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליך הגילוי, החל מיצירת מודלים ראשונית ועד לאישור פרה-קליני, ומשמשת כגשר בין הנדסה גנטית לפנוטיפ פונקציונלי באמצעות IVF.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי אפשור השבה של זרע קפוא ל-IVF, מה שמאפשר הערכה של השפעות שינויים גנטיים על פריון ואמבריולוגיה מוקדמת.
- סריקה: מאפשרת בדיקות סטנדרטיות מבוססות IVF באמצעות זרע מופשר, ובכך משפרת את ההשחזור בבדיקת תפקוד זרע, קבלה (capacitation) ויכולת הפריה.
- אנליטיקה: מייצרת מדדים כמותיים כגון תנועתיות זרע (% פרוגרסיבית), תנועתיות פרוגרסיבית מהירה ושיעורי התפתחות עובריים, המנחים החלטות לגבי יציבות המודל.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשרת בין שינוי גנטי לתוצאות התפתחותיות על ידי אפשור IVF עם זרע קפוא, ובכך תומכת בסריקה פנוטיפית המקושרת לסמנים ביולוגיים בעוברי טרום-השתלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מקריבה פלטפורמת בנק קריו גנרי לשימוש חוזר לצורך ארכוב והשבה שוטפת של קווי GM, ובכך מפחיתה מאמצים כפולים של גזירה מחדש (rederivation) בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בשימור המודל על ידי הדגמת שיפור בניידות ובהתפתחות העוברים לעומת שיטות CPA בסיסיות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זרימת העבודה בקריו-שימור באמצעות רכיבים מבוססי ערכה, ובכך מפחית את השונות בין המשתמשים ואת זמן ההכשרה.
- ערך אסטרטגי: מפחית עלויות ארוכות טווח של תחזוקת זנים ומקטין את הסיכון לאובדן בלתי הפיך של קוים עקב כשל ברבייה, סחף גנטי או התפרצות פתוגנים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של קווי GM לארכיב בהתבסס על ערך אסטרטגי, תוך ביטחון ביכולת השחזור העתידית.
שיקולי יישום
- דורש מיומנות טכנית באיסוף זרע, טיפול בקשים ואיטום תרמי כדי להבטיח את שלמות הדגימה.
- תלוי בגישה לאחסון בחנקן נוזלי ובציוד הפשרה מבוקר (אמבט מים ב-37°C) לצורך ביצועים עקביים לאחר ההפשרה.
- מצריך מצעי IVF סטנדרטיים ופרוטוקולי סופראובולציה להשגת תוצאות מהימנות של הפריה ותרבית עוברים.
- הביצועים עשויים להשתנות בין רקעים גנטיים שונים, מה שמחייב אופטימיזציה של שלבי האינקובציה והשטיפה בהתאם לזן.
- מוגבל בשל הצורך בנקבות פוריות ובמומחיות ב-IVF לצורך השבת זרע, דבר המגביל את היישום הישיר לבדיקות המבוססות על הזדווגות טבעית.
