Name: בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: למדו לבודד תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מקנה הנשימה של עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות אפיתלית ותיקון נזקי דרכי הנשימה במודל חי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להכיר את FACS הרחב תאי גזע מרכז המחקר ומודה במיוחד לג&#39;סיקה סקולס ופליציה Codrea על עזר במיון תא. העבודה מומנה על ידי CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, אגודה אמריקנית בית חזה / COPD קרן ATS-06-065, קרן הדאגה, נבג Jonsson UCLA המקיף במרכז סרטן חזה אונקולוגיה תכנית / סרטן הריאות, הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה מחקר ועדת תיאום וGwynne הייזן דובדבן זכרון המעבדות (BG).

קווי מתאר של צעדים 1. נתיחה של קנה נשימה 2. ניקוי קנה נשימה וחותך אותו 3. אנזים עיכול ועיבוד לתוך השעית תא בודדה 4. הכתמה לFACS ומיון 5. עיבוד תאים ממוינים לin vivo ו במודלים חוץ גופייה 1. נתיחה של קנה נשימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 0.1 mg/0.2 סמ&quot;ק של פנטוברביטל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לפתוח את דופן הבטן, ולהעביר את המעיים לצד לחשוף את אב העורקים בבטן ולאחר מכן לנתח את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החזה על ידי חיתוך דרך הסרעפת ובית חזה קדמי בשני הצדדים כדי לחשוף את הלב וריאות. תמשיך לחתוך לתוך צוואר הסרת בלוטות שומן ורוק לחשוף את קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התימוס ולחתוך את הריאות מהחיבורים שלו מתחת ומאחורי. Separאכלתי את קנה הנשימה מהוושט על ידי החדרתו מלקחיים ביניהם ואז לחתוך את קנה הנשימה בחלק העליון ביותר שלה מעל החיבור שלה עם הגרון. לאחר מכן החזק את קנה הנשימה עם מלקחיים ולנתח את זה מהדבקות וממשיך כלפי מטה כדי להסיר אותו עם הלב וריאות en-בלוק. לחתוך את הלב וריאות בסמוך לhilum לכלול את רוב הסמפונות העיקרית ימין ושמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קנה הנשימה בצלחת פטרי קטנה המכילה איסוף בינוני על קרח. </li></ol> 2. ניקוי קנה נשימה וחיתוך זה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים עדינים מאוד (נקודת מס &#39;5) ומספרי טובינגן Vannas (15003-08 finescience.com FST) כדי לנקות את קנה נשימה מכל הרקמות האחרות שמחוברות אליו. זה כולל: בלוטות הלימפה, עצב בגרון חוזר ונשנה, שומן, בלוטת תריס וכלי ריאה נותרת. חלק העליון של קנה הנשימה זקוק לתשומת לב מיוחדת, כדי להסיר את סחוסי הגרון הגדולים מבלי להתפשר על החבורה הגדולה של SMGשנטוע בין סחוס cricoid והצלצול הראשון קנה נשימת הסחוסים (C1) 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קנה הנשימה בחלק העליון וחלק התחתון בין C4 וC5 ולאחר מכן לחתוך את שני חלקים פתוחים בלום של קנה הנשימה. </li></ol> 3. אנזים עיכול ועיבוד להשעית תא בודדה (SCS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את החלק התחתון של קנה הנשימה ב1 מ&quot;ל של dispase 16 U בצינור אפנדורף בטמפרטורת חדר (RT) למשך 30 דקות, כפי שתוארו בעבר 5. ואז להוסיף 0.5 מיליליטר DNase אני בDMEM מ&quot;ג / ל20 דקות נוספות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מעוכלת אל קנה הנשימה בינונית איסוף טרי בצלחת פטרי סטרילית, ולהפשיט אפיתל המשטח תחת מיקרוסקופ לנתח. השתמש פיפטה להעביר במדיום המכיל אפיתל הופשט לצינור 50 מיליליטר חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה אפיתל הופשט ב1000 XG ב 4 ° C. הסר את supernatant, ולהוסיף 0.1% טריפסין / EDTA ולדגור בעוד רועד הצינור בדואר 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת (200 סל&quot;ד) למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, באמצעות קצה μl 1000, פיפטה מעלה ומטה כדי לשבור את הגושים ויוצר השעית תא בודדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קנה הנשימה העליון בצינור חרוטים המכיל 1 מ&quot;ל של pronase 0.15%. אז לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את הצינור, ואז למקם את קנה הנשימה למדיום איסוף טרי ולאשר תחת מיקרוסקופ לנתח שיש ניתוק מוחלט של אפיתל פני השטח (SE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר בקנה הנשימה עם מספריים מצוינים לפתוח את מדורי SMG ואז דגירה במשך שעה אחת נוספת בpronase בRT עם רעד בגוף איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספין למטה רקמות קנו נשימה, הסר pronase, מוסיף 0.1% טריפסין / EDTA ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם הרעד כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים מתעכלים, גושים וכל נתחים נותרים של בלוטות באמצעות 20G, 23 ז ו26G מחטים באמצעות מזרק מ&quot;ל 10. חזור מספר פעמי passaging עם כל גודל מחט לפניהתפטרותו. עכשיו, רוב התאים צריכים להיות בSCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה דרך מסננת מיקרומטר 40 לאחר מכן לשטוף את המסננת וספין למטה התאים. ואז לחדש את התאים בנפח המתאים של מדיום, ספירת התאים ולפנות מייד לFACS מכתים ומיון. אל תשאיר את תאים ב4 מעלות צלזיוס או על קרח לכמה שעות כי מצאו כי זה משפיע על הכדאיות וקשה מפחית את הכדור ויצר את היעילות. </li></ol> 4. הכתמה לFACS ומיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מספיק תאים להכנת צינורות הפיצויים המוכתמים בתוליים ואחת אז כתם שאר תאים עם נוגדנים ראשוניים, Trop2 עיזים וחולדות ITGA6, במשך 15 דקות בRT. לאחר מכן לשטוף עם PBS או איסוף בינוני, המסיר supernatant מאוד בזהירות ולשבור את התא הגלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם עם הנוגדן המשני המתאים, דגירה בחושך בRT למשך 10 דקות, לשטוף ולהסיר את supernatant ולאחר מכן לשבור את הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על FACSARIA, לאחר התאמת המתח והפיצוי, שערכם את הפסולת, התאים קטנים מאוד, כפילויות סלולריות ותאים מתים. ואז, רוב התאים מSE צריכים להיות TROP2 חיוביים תוך 20-50% מתאי SMG יהיו TROP2 + 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע שער מיונך לTrop2 + ITGA6 + תאים מSE (תאי בסיס) ולTrop2 + תאים (+ /-ITGA6 תאים חיוביים) מSMG (תאי צינור). </li></ol> 5. עיבוד תאים למיון: בתרבות מבחנה בדגם vivo 5.1 בתחום המבחנה להרכיב 5-9 תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב 100 μl של &quot;גורם גדילה מופחתת Matrigel&quot; עם 100 μl של מדיום שלם 10,11 (ראה טבלה 1) המכיל עד 50,000 תאים ממוינים ואז לשים את התערובת בחדר העליון של טרנס גם 24 גם. ואז לשים 400 μl של מדיום מלא בחדר תחתון ולדגור על 37 ° C. שינוי הבינוני בחדר תחתון בכל יום אחר ולהוסיף 100 μl הנוסף של Matrigelכל שבוע או מוקדם יותר, אם זה הופך להיות רזה. </li></ol> 5.2 במודל vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקם את התא מסודר בגלולה בינונית מלאה מעורבב עם 01:01 matrigel בריכוז של 5,000-10,000 תאים לכל 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את C57/BL6 עכברי נמען. לנהל carprofen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) subcutaenously כמשכך כאבים. לעקר ולגלח את גבם לאחר מכן לבצע חתך בעור אורך מרכזי בגב העליון. החתך צריך להיות גדול מספיק כדי לזהות את אתר שומן משטח ההזרקה כמו גם בועה שיוצרת לאחר הזרקה. השתמש בצד הקהה של המספריים להרחיב שקיות בין העור והאחורי של קיר בית החזה בשני הצדדים על מנת למקסם את הגישה וויזואליזציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הגבול המדיאלי של השכמה על ידי דחיפת forelimb העכבר למעלה ואחורה כדי לראות מרגש שכמה. קח 50 μl של השעית התא לתוך מזרק אינסולין BD μl 300 ולהזריק אותו בכרית השומן פשוט המדיאלי לעצם השכם ורוחב כדיהחוליות. אתה אמור להיות מסוגל לראות בועה אחרת אתה הוא עמוק מדי. חזור על אותו הדבר בצד אז קליפ או לתפור חתך בעור השני. בדקו עכברים ולתת carprofen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג, SC) פעם ביום למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שבועות, להרדים עכברים עם pentobarbatol (0.1 mg/0.2 סמ&quot;ק, ה-IP), לפתוח את העור כאמור לעיל ולנתח את כרית השומן השלמה משני הצדדים עם מרווח ביטחון כדי למנוע חסרים כל מבנה רקמות שיכולים להיוצר והוארך בסביבה. התקן בPFA ולהטביע בפרפין 12. זהירות רבה צריכה להיות מועסקת בזמירה וחיתוך הבלוק לא לעקוף או להתעלם מבנה. התרגול הטוב ביותר הוא לקצץ 40 מיקרומטר פעם אחת ואז לחתוך פרוסת 4 מיקרומטר, הנח אותו על משטח זכוכית ולבחון אותו במיקרוסקופ כדי לאשר אם יש &quot;מבני אפיתל&quot; בחלק זה של הגוש או לא. אם אין שום דבר לראות, ולאחר מכן לקצץ פעם נוספת ולחזור על שלב זה. </li></ol> 6. נציג תוצאות Stripping קנה נשימה של העכבר יגרום לקנה נשימת נכרתים כי הוא גלוי במיקרוסקופ אור, כפי שמוצג באיור 1 א. 1B האיור מציג את נוף brightfield של קנה נשימה לאחר שבזז אפיתל בבלוטות submucosal ששוחררו מהרקמות והאשכולות דומים של ענבים. Pronase מסיר epitope ITGA6 וזו הסיבה שלא ניתן להפריד את תאי TROP2 הצינור לתוך ITGA6 + ו - אוכלוסיות. עם זאת, dispase, המשמר את ITGA6 epitope, מעכל את כל פני שטח האפיתל ותאי הצינור אפילו עם זמני דגירה קצרים מאוד, ולכן לא ניתן להשתמש בו כדי להפריד בין צינור מתאי בסיס, 3. cytometry הזרימה של השעיות התא הבודדות צריך להראות קדימה חלקות פיזור פיזור וצד שמיוצגות באיור 2 א. הפרדה טובה של תאי צינור משאר אם תאי קנה הנשימה יש לראות עם נוגדן Trop2 cytometry זרימה לתא sorti פעיל ניאוןng (FACS) כפי שניתן לראות באיור 2B. Spheres צריך להיות גלוי בmatrigel לאחר כ 1 שבוע בתרבות ובצפוף במראה כפי שמוצג באיור 3. היעילות של התהליך הזה היא בסדר הגודל של 1-2% ותאים בודדים עדיין תהיה נוכח בmatrigel ועשוי לייצג תאים מצינוריות בלוטת submucosal שאין להן את יכולת התחדשות עצמית. הזרקה של תאי גזע לתוך צינור את תוצאות כרית שומן העכבר בהיווצרות של מבני submucosal בלוטה דמוית שמוצגים איור 4. אלה ראו בבלוקים גם ללא צביעת H &amp; E. אלה הם כדוריים ובעלי לום מרכזי. חתכים רבים צריכות להתבצע באמצעות כרית השומן על מנת שלא לפספס את מבני אפיתל אלה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> איור 1. עיכול אנזימתי של האפיתל של קנה נשימה. הסרת תאי אפיתל פני שטח נראית עם blacחיצי k, הסרת תאים בצינוריות בלוטת submucosal מוצגים עם חיצים ירוקים. קנה נשימה ערומה הנראות על ידי מיקרוסקופ אור מוצגת לאחר 30 דקות של עיכול dispase ואחרי 4 שעות של עיכול pronase. <img alt="איור 2 א" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> איור 2 א. אני. cytometry זרימה של השעיות התא הבודדות המראות פיזור קדימה מייצג וחלקות פיזור לוואי מהעכבר קנה נשימה לאחר משטח האפיתל ההפשטה. ii. חלקות FACS נציג לTROP2 ביטוי בתאי צינור קנה נשימה מעכבר. <img alt="התרשים 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> 2B איור.. cytometry זרימה של השעיות תא הבודדות ממשטח אפיתל הופשט משני השליש התחתון של עכבר קנה הנשימה מראה פיזור קדימה מייצג וחלקות פיזור לוואי. ii. עלילת FACS אופייני ITGA6 ביטוי בsurface האפיתל. ג. עוד עלילת FACS נציג של קדימה ופיזור מצד אפיתל פני שטח מראה האחורי gating של אוכלוסיית תאי הבסיס בירוק. ד. ITGA6 טיפוסי וTROP2 להביע אוכלוסיית תא בירוק. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> איור 3. כמובן זמן פיתוח של תחומים. תחומי Duct א. Spheres צריך להיות גלוי בmatrigel לאחר כ 1 שבוע בתרבות וכמעט כולם צפופים במראה. תאים בודדים שאינו מהווים תחומים גם ראו. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). תחומים בסיסיים B. הם גדולים יותר וluminal בהופעה. תאים בודדים שאינו מהווים תחומים גם ראו. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> איור 4. הזרקה של תאי גזע לתוך צינור את תוצאות כרית שומן העכבר בהיווצרות של מבני submucosal בלוטה דמוית. מבנים מייצגיםמוצגים בכרית השומן וחלקם הראה הפקת mucin (כחול בהיר) עם שיף החומצה Alcian הכחול התקופתי הכתם.

<ol><li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Contrib.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li>
<li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li>
<li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Stem%2FProgenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li>
<li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li>
<li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+an+epithelial+stem%2Fprogenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li>
<li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li>
<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li>
<li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li>
<li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טכניקה זו לבודד תאים הבזליים מצינור ודרכי הנשימה היא חשובה לשיפור ההבנה של דרך נשימת תיקון והתחדשות ומחלות של דרך נשימה שלנו. הטכניקות המתוארות כאן כוללות כמה שלבים קריטיים. הראשון הוא תקופת העיכול אנזימטי האופטימלית. השני הוא היצירה של השעית תא בודדה דרך סידורי passaging עם מחטי מד שעלה בהדרגה כדי למנוע הטית תא, אלא כדי לשבור את הגושים סלולריים. השלישי הוא ניתוח FACS, וgating של תאים עם נוגדנים מתאימים. כחלק מאפ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> השלם בינוני 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> Hepes (15 מ&quot;מ) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט (3.6mm או 0.03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין (4 מ&quot;מ) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-Cl </td></tr><tr><td> פניצילין (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ &#39;) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Amphotericin B (0.25 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> בתוךsulin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> סיגמא </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrin (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> סיגמא </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> רעלן הכולרה (0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> סיגמא </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> עוריות Growth Factor (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> תמצית יותרת מוח שור (30 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי (5%) </td><td> דיג </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> חומצה רטינואית (0.05 מיקרומטר) </td><td> סיגמא </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> גורם גדילה מופחתת Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. השלם רכיבי תקשורת. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td&gt; <td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> רוש </td><td> 10165921001 </td><td> השתמש ב 0.15%: -O / n ב 4 ° C עיכול לבודד תאי קנה נשימה של כלל (לתרבות ALI) עיכול -4 שעות 4 ° C כדי לבודד SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> השתמש ב 16 יחידות: 30 דקות ב RT </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> DN25 </td><td> השתמש ב 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל: 20-30 דקות ב RT </td></tr></tbody></table> טבלה 2. אנזימים המשמשים לעיכול האנזימטית של קנה הנשימה.

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת duct submucosal מעכבר קנה נשימה

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

דרכי האוויר הגדולות הן ישירות במגע עם הסביבה ולכן רגישות לפגיעה מרעלים וחומרים מזהמים שאנו נושמים ב1. דרכי האוויר הגדולות ולכן דורשות מנגנון תיקון יעיל כדי להגן על גופנו. תהליך תיקון זה מתרחש מתאי גזע בדרכי אוויר ובידוד תאי גזע מדרך הנשימה הוא חשוב להבנת המנגנונים של תיקון והתחדשות. זה גם חשוב להבנת תיקון חריג שעלול להוביל למחלות דרך נשימת 2. המטרה של שיטה זו היא לבודד את אוכלוסיית תאי גזע רומן מצינוריות בלוטת submucosal קנה הנשימה של העכבר ולמקם את התאים האלה במבחנה במערכות מודל vivo לזהות את המנגנונים של תיקון והתחדשות של בלוטות submucosal 3. ייצור זה מציג שיטות שיכולות לשמש לבידוד ובדיקת תאי הגזע הדביקים ובסיסיים מ3 דרכי האוויר הגדולות. זה יאפשר לנוללמוד מחלות של דרך הנשימה, כגון סיסטיק פיברוזיס, אסתמה ומחלת ריאות חסימתית כרונית. נכון לעכשיו, אין שיטות לבידוד של תאי צינור בלוטה submucosal ואין במודלי vivo ללמוד התחדשות של בלוטות submucosal.

כאן אנו מראים הפרוטוקול שלנו לבידוד של תאי צינור בלוטה הבזליים וקנה נשימת submucosal מעכבר. גם אנחנו מדגימים את השיטה של ​​הזרקת תאי גזע לכרית השומן הגבה עכבר כדי ליצור<em&gt; In vivo</em&gt; מודל של התחדשות הבלוטה submucosal.

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

דרכי הנשימה הגדולות נמצאות במגע ישיר עם הסביבה, ולפיכך הן רגישות לפגיעה מרעלים ומגורמים זיהומיים שאנו שואפים 1. ...

מטרת שיטה זו היא לבודד תאי גזע מתוך תעלות בלוטות התת-רירית של קנה הנשימה בעכבר לצורך מחקר, תיקון והתחדשות. ראשית, קנה הנשימה מופק מעכבר שהורדם והורג (euthanized). קנה הנשימה מנוקה, נחתך ועובר עיכול אנזימטי.לאחר מכן, האפיתל מקולף באופן מכני ועובר עיכול נוסף כדי להפיק תרחיף של תאים בודדים. התאים נצבעים, מומינים ולבסוף מעובדים לשימוש במערכי בדיקה in vivo ו-in vitro. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי מסלולים מרכזיים המווסתים התחדשות עצמית ודיפרנציאציה של תאי גזע אפיתליאליים בדרכי הנשימה.טכניקות אלו חשובות כיוון שהן מספקות לנו מודלים של תיקון והתחדשות של אפיתל דרכי הנשימה in vitro ו-ex vivo. הדבר מאפשר לנו לחקור תיקון תקין של דרכי הנשימה וכן מחלות של דרכי הנשימה, כגון מחלה ריאתית חסימה כרונית (COPD), סיסטיק פיברוזיס ואסתמה. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר לא הצלחנו למצוא סממנים פנישאיים ספציפיים כדי לבודד את התאים הבזאליים מהתאי הגזע של התעלה, ולכן החלטנו להסיר את האפיתל השטחי יחד עם התאים הבזאליים ולהשאיר מאחור את תאי התעלה. הדגמת הליכי הניתוח של הקנה.קילוף של אפיתל דרכי הנשימה, יצירת תרחיף תאים בודדים ומיון תאים יבוצעו על ידי הגה. פוסט-דוקטורנט במעבדתי, המדגים את נהלי העיבוד של תאים ממוינים במודלים in vitro ו-ex vivo, הוא כן, מנהל המעבדה שלנו. התחל את הפרוצדורה על ידי חיתוך ופתי

isolation-basal-cells-submucosal-gland-duct-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד, culturing וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים, כדי ללמוד התגובות מולקולרית רעלן זה סביבתיים.

בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

דרך יעילה לבודד את הלימפוציטים מדרכי מין עכבר מתוארת. שיטה זו מנצלת עיכול אנזים והפרדת השיפוע Percoll לאפשר בידוד יעיל. טכניקה זו היא גם להתאמה לשימוש במינים...

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

תאי מברשת הם נדירים cholinergic האפיתל תאים כימוחושי נמצא בקנה הנשימה של העכבר נאיבי. בשל המספרים המוגבלים שלהם, הערכה לשעבר vivo של תפקידם התפקודי בחסינות דרכי הנשימה ושיפוץ הוא מאתגר. אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה על ידי הזרמת cy, לנסות.

בידוד והערכה כמותית של תאי המברשת מקנה הנשימה של העכבר

בלוטת lacrimal (LG) יש שני סוגי תאים המבטא α-השריר החלקה אקטין (αSMA): מיואפיתל תאים (mecs) ו קרום הלב. MECs הם של מוצא העורי, נמצא ברקמות הבלוטות רבות, בעוד קרום הלב הם תאים שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי. פרוטוקול זה מבודד מנות וכלי קרום.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגישות דיסוציאציה של רקמות ופירוק תאי, המאפשרות העשרה של תאי אפיתל בני קיימא מאזורים פרוקסימליים ודיסטליים של הריאה האנושית. כאן גישות אלה מיושמות לניתוח פונקציונלי של תאי אב אפיתל ריאה באמצעות שימוש במודלים של תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות.

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד mesenchyme המעי murine, כולל telocytes. אלה יכולים לשמש למספר יישומים, כגון תרבות משותפת עם עכבר או אורגנואידים שמקורם בבני אדם, כדי לתמוך בצמיחה ולשקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית.

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

במאמר זה אנו מתארים מודל במבחנה לבידוד והתמיינות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, תוך התמקדות בהתאקלמותם לתמצית עשן סיגריות כרונית (CSE). ניתן להשתמש במודל כדי לאפיין באופן מקיף את ההשפעה הרב-אומית של CSE, מה שעשוי לספק תובנות לגבי התגובות התאיות תחת חשיפה כרונית לעשן.

מודל In Vitro לחקר התמיינות ושינויים של מולטי-אומיקה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של מורין המגורות באמצעות תמצית עשן סיגריות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לכימות ייצור תחמוצת החנקן (NO) בתרביות אפיתל בדרכי האוויר המובחנות בממשק אוויר-נוזל (ALI) על ידי מדידת ניטריט בהפרשות אפיקליות באמצעות בדיקת כימילומינציה מבוססת טריודיד.

מדידת ייצור תחמוצת חנקן בתרביות תאי אפיתל של קנה הנשימה בעכברים הממוינים בממשק נוזל האוויר

למדו לבודד תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מקנה הנשימה של עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות אפיתלית ותיקון נזקי דרכי הנשימה במודל חי.

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

גלה סרטונים נוספים