בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

מטרת שיטה זו היא לבודד תאי גזע מתוך תעלות בלוטות התת-רירית של קנה הנשימה בעכבר לצורך מחקר, תיקון והתחדשות. ראשית, קנה הנשימה מופק מעכבר שהורדם והורג (euthanized). קנה הנשימה מנוקה, נחתך ועובר עיכול אנזימטי.

לאחר מכן, האפיתל מקולף באופן מכני ועובר עיכול נוסף כדי להפיק תרחיף של תאים בודדים. התאים נצבעים, מומינים ולבסוף מעובדים לשימוש במערכי בדיקה in vivo ו-in vitro. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי מסלולים מרכזיים המווסתים התחדשות עצמית ודיפרנציאציה של תאי גזע אפיתליאליים בדרכי הנשימה.

טכניקות אלו חשובות כיוון שהן מספקות לנו מודלים של תיקון והתחדשות של אפיתל דרכי הנשימה in vitro ו-ex vivo. הדבר מאפשר לנו לחקור תיקון תקין של דרכי הנשימה וכן מחלות של דרכי הנשימה, כגון מחלה ריאתית חסימה כרונית (COPD), סיסטיק פיברוזיס ואסתמה. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר לא הצלחנו למצוא סממנים פנישאיים ספציפיים כדי לבודד את התאים הבזאליים מהתאי הגזע של התעלה, ולכן החלטנו להסיר את האפיתל השטחי יחד עם התאים הבזאליים ולהשאיר מאחור את תאי התעלה. הדגמת הליכי הניתוח של הקנה.

קילוף של אפיתל דרכי הנשימה, יצירת תרחיף תאים בודדים ומיון תאים יבוצעו על ידי הגה. פוסט-דוקטורנט במעבדתי, המדגים את נהלי העיבוד של תאים ממוינים במודלים in vitro ו-ex vivo, הוא כן, מנהל המעבדה שלנו. התחל את הפרוצדורה על ידי חיתוך ופתיחה של דופן הבטן של עכבר שהורדם.

הזיזו את המעיים הצידה כדי לחשוף את אבי העורקים הבטני (abdominal aorta) ולאחר מכן בצעו דיסקציה. פתחו את בית החזה על ידי חיתוך דרך הסרעפת ודופן החזה הפנימית משני הצדדים כדי לחשוף את הלב והריאות. המשיכו לחתוך כלפי מעלה לכיוון הצוואר, והסירו את השומן ואת בלוטות הרוק כדי לחשוף את הקנה (trachea) באמצעות מספריים עדינים.

הסר את התימוס ונתק את הריאה מהרקמה החיבורית שמתחתיה ומאחוריה. לאחר מכן, הכנס את הפינצטה בין הקנה לוושט כדי להפריד ביניהם. חתוך את הקנה בחלקו העליון ביותר, מעל חיבורו לגרון.

בשלב הבא, החזיקו את הקנה בעזרת פינצטה והבדילו אותו מנקודות החיבור שלו. כדי להמשיך כלפי מטה ולהסירה יחד עם הלב והריאות כבלוק אחד, חתכו את הלב והריאות סמוך להילום (hilum) כך שעיקר הברונכיים הראשיים הימני והשמאלי ייכללו. מקמו את הקנה בצלחת פטרי קטנה המכילה תוצר איסוף על קרח תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

השתמשו בפינצטה מספר חמש בעלת חוד דק מאוד, בפינצטה נוספת, בצינור ורידי ובמספריים כדי להסיר כל רקמה הצמודה לקנה הנשימה. זה כולל קשרי לימפה, שומן של העצב הלרינגיאלי החוזר, את בלוטת התריס וכלי דם ריאתיים שנותרו. החלק העליון של קנה הנשימה דורש תשומת לב מיוחדת כדי להסיר את חלקי הסחוס הלרינגיאלי הגדולים מבלי לפגוע בצבר הגדול ביותר של בלוטות סוב-מוקוזליות שנמצא בין סחוס ה-CRICO לבין טבעת הסחוס הראשונה של קנה הנשימה C one.

בשלב הבא, חתכו את הקנה לחלק עליון ולחלק תחתון בין C four ל-C five, ולאחר מכן בצעו את החיתוך. פתחו את שני החלקים דרך חלל הקנה. העבירו את החלק התחתון של הקנה למבובות מיקרו-צנטריפוגה של 1 ml ואת החלק העליון של הקנה למבובת קונוס של 15 ml לצורך עיכול אנזימטי ועיבוד לתליות של תאים בודדים.

בחלק הבא של הפרוצדורה, החלקים התחתון והעליון של הקנה מעובדים כדי להפיק תרחיפי תאים בודדים. למרות שיש לעבד אותם במקביל, שתי השיטות יודגמו ברצף. כדי לעבד את החלק התחתון של הקנה, העבירו אותו לתוך מיליליטר אחד של 16 unit dis space בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן, העבירו את הקנה למבחנה חדשה המכילה 0.5 milligrams per milliliter, DNA one ב-DMM למשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר לאחר העיכול; השתמשו בפינצטה עדינה כדי להעביר את הרקמה לצלחת פטרי סטרילית המכילה מדיום איסוף טרי. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסירו את אפיתל השטח על ידי משיכה עדינה של שכבות האפיתל כדי להפרידן ממעטפת הבסיס שמתחתיהן. לבסוף, השתמשו בפיפטה כדי להעביר את המדיום המכיל את האפיתל שהוסר למבחנה קונית של 50 milliliter וסבבו במערך צנטריפוגה במהירות 1000 G בטמפרטורה של four degrees Celsius.

לאחר הסבוב, הוצא את ה-SNAT והוסף 0.1%tripsin EDTA, דגירה של המבחנה באינקובטור רועש בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך 30 דקות; לאחר הדגירה, השתמש בפיפט עם טיפ של 1000 microliter בתנועות מעלה ומטה באופן חוזר כדי לפרק גושי תאים ולהבטיח שהתאים יהפכו לתליה של תאים בודדים. העבר את הקנה העליון למבחנה קונית המכילה מיליליטר אחד של 0.15%Pronase, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius למשך ארבע שעות. העבר את החלק התחתון של הקנה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של מיליליטר אחד המכילה מיליליטר אחד של מצע המכיל 16 units של disc base.

לאחר הדגירה, ערבבו בעדינות את המבחנה באמצעות וורטקס ולאחר מכן העבירו את הקנה לתוך תווך איסוף טרי. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, ודאו כי התרחש ניתוק מלא של אפיתל השטח. השתמשו במספריים עדינים כדי לקצוץ את הקנה ולפתוח את מדורי בלוטות תת הרירית.

דגרו למשך שעה נוספת ב-0.15% pronase בטמפרטורת החדר תוך써 ניעור איטי. סובבו במ centrifuge להשקעה את רקמת הקנה לאחר הסרת ה-pronase. הוסיפו 0.1% trypsin EDTA ודגרו ב-37 degrees Celsius למשך 30 דקות תוך ניעור.

בשלב הבא, סננו את הגושים הגדולים באמצעות מסננת של 70 micron. לאחר מכן, שטפו את המסננת עם מדיום. העבירו את גושי התאים שעברו עיכול וכל שארית של גושי בלוטות דרך מחטים בכיול 20 gauge, 23 gauge ו-26 gauge באמצעות מזרק של 10 milliliter.

חזור על תהליך הפירוק מספר פעמים עם כל גודל מחט לפני המעבר לגודל הבא. כעת, מרבית התאים אמורים להיות בתליה של תאים בודדים (single cell suspension). סנן את התליה דרך מסננת של 40 micron, לאחר מכן שטוף את המסננת עם מצע וסבב את התאים במערך צנטריפוגה (spin down).

לאחר מכן, השחה את התאים בנפח המתאים של מצע גידול, ספור את התאי וגש מיד לצביעה ומיון. קח כמות מספקת של תאים להכנת מבחנות הפיצוי (compensation) ללא צבעי וצבעי בודדים. לאחר מכן, צבע את שאר התאים באמצעות נוגדנים ראשוניים נגד trop tube ו-I TGA six למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר האינקובציה, שטוף עם PBS או מצע איסוף, והסר את העלייה (supernatant) בזהירות רבה.

סמנו את משקע התאים עם הנוגדן המשני המתאים. דגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו והסירו את הצבע, ואז פתרו את המשקע.

ניתן כעת למיין את התאים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS). כעת, לאחר שהתאים מוינו, ניתן להשתמש בהם כדי לחקור את מנגנוני התיקון וההתחדשות ליצירת תרביות של ספירות (spheres) in vitro. ערבבו 100 µl של Matrigel עם רמות מופחתות של גורמי גדילה עם 100 µl של מצע גידול מלא המכיל עד 50,000 תאים מוינים.

העבירו באמצעות פיפט את התערובת לתא העליון של פלטת transwell בעלת 24 בארות; לתא התחתון העבירו באמצעות פיפט 400 µL של מצע גידול מלא. הדגירו בטמפרטורה של 37 °C. החליפו את מצע הגידול בתא התחתון מדי יומיים, והוסיפו 100 µL נוספים של matri gel מדי שבוע, או מוקדם יותר אם השכבה הופכת לדקה.

ספירות נוצרות בדרך כלל לאחר שבעה ימים וניתן לגדלן במשך מספר שבועות או להעבירן במעברים סדרתיים. עבור המודל in vivo, השב את משקע התאים הממוינים במצע מלא המעורבב ביחס של אחד לאחד עם matri gel בריכוז של 5,000 עד 10,000 תאים ל-50 microliters. לאחר הרדמת עכבר C 57 black six המקבל, סטרilize וגלה את גבו, ולאחר מכן את החלק העליון של הגב.

בצעו חתך עורי אורכי מרכזי. השתמשו בצד הקה של להב המספריים כדי להרחיב כיסים בין העור לגב של דופן בית החזה משני הצדדים. דחפו את רגלו של העכבר כלפי מעלה ואחורה כדי להזיז ולזהות את הגבול המדיאלי של השכמה (scapula).

לאחר מכן, באמצעות מזרק אינסולין של 300 µL, מזריקים 50 µL מתליהי תאי התאים אל תוך כרית השומן, במנח מדיאלי לסקפולה (שכמה) ולטראלי לחוליות. צריכה להיווצר בועה (bleb); יש לחזור על ההזרקה בצד השני, ולאחר מכן לסגור את חתך העור באמצעות סיכות או תפרים. לאחר שלושה שבועות, פתח את עורו של העכבר שהורדם (euthanized) כפי שבוצע קודם לכן, ובצע דיסקציה של כרית השומן כולה משני הצדים עם שולי ביטחון.

כדי למנוע החמצה של מבנה רקמה שייתכן שנוצר והתרחב מסביב, יש לקבע את כרית השומן שבוצעה לה נתיחה ב-PFA ולהטמיע אותה בפרפין כדי למנוע דילוג או התעלמות ממבנים במהלך חיתוך הבלוק. בצעו קיטום ראשוני של 40 microns, ולאחר מכן חתכו פרוסה בעובי של ארבעה micron.

הניחו זאת על תגית זכוכית, ולאחר מכן בחנו זאת תחת המיקרוסקופ כדי לקבוע אם קיימים מבנים אפיתליאליים. אם לא נראה דבר, קצצו פעם נוספת וחזרו על שלב זה. קילוף של קנה הנשימה של העכבר כפי שמתואר בסרטון זה, יביא לקנה נשימה חשוף הנראה במיקרוסקופיה של אור כפי שמוצג כאן denuded tracheas.

לאחר 30 דקות של עיכול בפפאין, תוצאות העיכול מוצגות משמאל בסימנים של קשיי נשימה ובקשיי נשימה חשופים. לאחר ארבע שעות של עיכול בפרונאז, התוצאות מוצגות מימין. לאחר הסרת האפיתל, בלוטות התת-רירית משתחררות מהרקמות ונראות כמרבצי ענבים.

הסרת תאי אפיתל מהשטח מסומנת בחצים שחורים. הסרת תאים מבלוטת התת-רירית והצינורות מסומנת בחצים ירוקים. ציטומטריה של זרימה של תרחיפי תאים בודדים צריכה להראות תרשימי פיזור של forward scatter ו-side scatter כפי שמוצג כאן.

הפרדה טובה של תאי תעלה מהשאר. אם תאי קנה הנשימה נצפים עם הנוגדן Trop two בציטומטריית זרימה למיון תאים מופעל פלואורסצנטית, לאחר כשבוע של תרבית, ספרואידים (spheres) צריכים להיות גלויים ב-matrigel; אלו יהיו לומנליים כאשר הם נגזרים מתאי בסיס, ובעלי מראה שונה כאשר הם נגזרים מתאי תעלה. היעילות של תהליך זה היא בסדר גודל של 1% עד 2%, ותאים בודדים עדיין יהיו נוכחים ב-matrigel, אשר ככל הנראה מייצגים תאים מצינורות בלוטות התת-רירית שאינם בעלי יכולת להתחדשות עצמית.

ספירות בזאליות הן גדולות יותר ובמראה לומינלי. הזרקה של תאי גזע של צינוריות אל תוך רפידת השומן של עכבר גורמת להיווצרות מבנים הדומים לבלוטות סוב-מוקוזליות, שהם כדוריים ובעלי לומן מרכזי. אלו נראים בבלוקים אף ללא צביעת h and e.

יש לבצע חתכים רוחביים רבים דרך כרית השומן כדי להשיג חתך המכיל מבנים אפיתליאליים אלו. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי אופן בידודה של אוכלוסיית תאי גזע מתאי צינורות של בלוטת הרוק התת-לסניאלית, וברגע שהטכניקה תשלט, ניתן להשלימה תוך 10 שעות. בעקבות הליך זה, ניתן לשנות את תנאי התרבית כדי לענות על מספר שאלות שונות בנוגע להיווצרות ספירות וגורמי גדילה המאיצים רגנרציה.