מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר
7 במרץ 2012
אנו מציגים שיטה ליצירת חלון הדמיה בגולגולת העכבר החובקת מילימטרים והוא יציב במשך חודשים ללא דלקת של המוח. שיטה זו גם מתאים מחקרים ארוכי טווח של זרימת דם, דינמיקה סלולריים, ותא / מבנה כלי הדם באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור חלון גולגולת דק ויציב מעל קורטקס העכבר כדי לאפשר דימות חוזר מבלי להפר את הסביבה התוך-גולגולית. דבר זה מושג תחילה על ידי חיבור תושבת ראש שתאפשר החזקה יציבה של הראש תחת מכשיר הדימות. לאחר מכן, יש לדקק בזהירות את הגולגולת באזור מעל פני השטח הדורסליים של המוח ולהסיק את פני השטח באמצעות נייר לטש בעל גרעין עדין.
לאחר מכן, כסו את החלון בנקודה קטנה של דבק ציאנואקרילט ובתכסית זכוכית כדי לחזק את החלון. השלב האחרון הוא הכנת החיה להדמיה תחת מיקרוסקופ פוטונים כפולים. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית פוטונים כפולים in vivo משמשת להצגת מבנים עדינים כגון עורקים, ורידים, נימים ודנדריטים עצביים, שניתן להדמיים בעומק של עד 250 micrometers בתוך הקורטקס לאורך שבועות.
היתרון המרכזי של טכניקת חלון הגולגולת זו הוא שהגולגולת המכסה את הקורטקס נותרת ללא פגיעה. ראשית, אנו מדקיקים את הגולגולת כדי להשיג בהירות אופטית, ולאחר מכן מחזקים את הגולגולת באמצעות דבק ציאנואקרילט וזכוכית כיסוי. שיטה זו אמורה להיות שימושית לחקר מגוון של עכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים במצבי הרדמה או במצב OIC.
כדי להתחיל בהליך זה, עקרו באוטוקלאב את כלי הניתוח הנדרשים והרדימו עכבר בן כשלושה עד שישה שבועות בהתאם לשיטות המפורטות בכתב היד המצורף. בדקו את הרפלקס על ידי צביטה בבוהן כדי לוודא שהעכבר נמצא במישור הרדמה ניתוחי. לאחר מכן, קבעו את העכבר במסגרת סטריאוטקסיס.
שמר על טמפרטורת גוף של העכבר ב-37 °C. השתמש בגוף חימום ובגשש רקטלי עם בקרה במעגל משוב. מרח משחה עינית על עיניו כדי לשמור על הלחות.
לאחר מכן, גלחו את הקרקפת באמצעות מכונת גילוח חשמלית קטנה. לאחר מכן, נקו את הקרקפת עם Betadine, ולאחר מכן נגבו אותה עם 70% isopropyl alcohol. לאחר מכן, חממו מנה של נוזל חוט שדרה מלאכותי סטרילי ל-37 degrees Celsius תחת מיקרוסקופ.
הסר את הקרקפת מכל שטח הגולגולת הגבית באמצעות מספריים כירורגיים. גזום את העור לצדדים עד לקצוות השרירים הרקיים בשני צדי הגולגולת, ואחורית לשרירי הצוואר. לאחר מכן, השתמש בלהב סקלפל כדי להסיר את הפריוסטאום (קרום העצם) הדק מפני השטח של הגולגולת.
לאחר מכן, ייבשו ונקו את הגולגולת. לאחר מכן, מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על פני השטח של הגולגולת. המתינו עד שהדבק יתייבש לחלוטין.
שכבת דבק זו נדרשת להצמדה נאותה של המלט הדנטלי. בשלבים הבאים, עבור הכנה של דימוי במצב ערות, קידחו חורים והחדירו שני ברגים בעלי הברגה עצמית (self-tapping) מסוג 0 0 0 למשטח הגולגולת בצד הנגדי.
לאחר מכן, הצמידו לגולגולת מחבר קשיח בהתאמה אישית בעל שתי נקודות עיגון. פעולה זו מפחיתה משמעותית את דרגות החופש ומפשטת את המיקום מחדש של אותו שדה דימות במחקרים אורך. מוט רוחב רחב מספק גם מקום מספיק להצבת אלקטרודות ולגירוי רעידות.
בשלב הבא, כסו את כל שטח הגולגולת, למעט מיקום החלון, בשכבה של צמנט דנטלי, והבטיחו שכל קצוות העור החשופים מכוסים בצמנט. לפני דילול הגולגולת, ודאו שהמקדחים חדים והימנעו משימוש חוזר בהם. השתמשו במקדח דנטלי במהירות נמוכה כדי לדלל אזור של 2 mm על 2 mm מעל הקורטקס הסומטוסנסורי באמצעות מקדח בקוטר 0.5 mm.
לאחר מכן, דללו את פני השטח של הגולגולת היבשה למשך מספר שניות בלבד בכל פעם, תוך שטיפה תקופתית של הגולגולת ב-CSF כדי למנוע חימום. לאחר מכן, דללו את העצם. בהמשך, העבירו את המקדח למהירות נמוכה יותר וגססו את פני השטח של הגולגולת במגעים קלים בלבד.
יש להביא את המקדח אל פני השטח בזווית של כ-30 מעלות ביחס לאנך. המשך בדילול העצם מעבר לשכבה הווסקולרית אל תוך שכבת העצם השנייה, מעל פני השטח של המוח.
החזיקו את המקדח בתנועות קטנות ומבוקרות והפעילו כוח רק בכיוון הלטרלי. כאשר עובי העצם יהיה כ-50 microns, כלי הדם של הקילוף (peel vessels) אמורים להיות גלויים בבירור דרך העצם הרטובה. בעומק זה, נקודות לבנות קטנות בתוך העצם יהיו גלויות למשך מספר שניות.
מיד לאחר הרטבת פני השטח היבשים של הגולגולת, עובי העצם הסופי צריך להיות כ-10 עד 15 מיקרונים. כאשר העצם דקה מספיק, הנקודות הלבנות הקטנות בעצם לא יהיו גלויות עוד בעת הרטבת פני השטח היבשים של הגולגולת. כעת יש ללטש את החלון באמצעות אבקת תחמוצת בדיל.
השתמשו בקורט קטן של אבקה, בגודל של כרבע מגודל החלון; ערבבו תרחיף של אבקה עם CSF באמצעות מקדח מוכן מראש עם שוט סיליקון. פולש את הפני השטח במשך 10 דקות, שטפו היטב את אבקת תחמוצת הבדיל מהחלון ויבשו את העצם. תהליך זה אמור לסייע בהפחתת קצוות מחוספסים שנותרו מהמקדח במהלך הליך הדילול.
בשלב הבא, חתוך מספר חתיכות ריבועיות של זכוכית כיסוי מספר 0 בגודל הקטן מעט מגודל החלון. השתמש במגרדת כדי לסמן בעדינות את הקווים האופקיים והאנכיים המופרדים בכיסוי. החלק עם סרגל ללא שבירת הזכוכית.
לאחר מכן, הניחו את לוכסנית הכיסוי בתוך צלחת פטרי. הפרידו בין חלקי הזכוכית על ידי הקשה של הצלחת נגד קצה השולחן. לאחר מכן, מרחו כמות קטנה של דבק Sano ACRL מעל החלון באמצעות הקצה העץ של מקלון צמר שבור.
הניחו במהירות חתיכת זכוכית כיסוי חתומה מראש מעל הדבק. הימנעו מיצירת בועות מתחת לזכוכית הכיסוי לאחר שהדבק התייבש לחלוטין במשך 15 דקות. הסירו שאריות של דבק cyanoacrylate מהמשטח העליון של זכוכית הכיסוי באמצעות להב סקלפל.
אטמו את קצוות החלון באמצעות צמנט דנטלי. לאחר מכן, צרו שוליים מוגבהים מעט כדי להחזיק מים עבור עדשת הטבילה (dipping lens) בסיום התהליך. הניחו את החיה בכלוב חם עד להתאוששות מלאה מההרדמה.
בשלב זה, ייצב את בעל החיים על לוח בסיס אופטי (optical breadboard) לצורך דימות והשתמש במסגרת כתמיכה לראש. הפלטה הנפרדת שלנו מאפשרת להעביר את בעל החיים ואת כל מכשירי הניטור הפיזיולוגיים כיחידה אחת בין אתר הניתוח לאתרי הדימות בדו-פוטון. אם נדרש דימות של זרימת דם, הזרק 0.05 milliliters של צבע fluorescent dextran בריכוז 5% דרך הווריד התת-מסלולי (infraorbital vein) כדי לסמן את סרום הדם.
יש לבצע זאת תחת הרדמה כללית, והצבע נשאר בדרך כלל במחזור הדם למשך מספר שעות. הזרק תמיסת lactated ringer באופן אינטריפרואיטוני בנפח של 3 µL לגרם כל שעתיים כדי לשמור על נוזלי הגוף ועל דרישות האנרגיה. התר את העכבר על ידי הפסקת מתן ה-isoflurane.
שעה לאחר היקיצה, העכבר מוכן לדימוי. סגרו את הכלוב מעל המיקרוסקופ כדי למנוע זיהום מאור. מוצג. להלן דוגמה של כלי הדם הקורטיקליים בירך של עכבר YFP אחד שסומן על ידי הזרקה תוך-ורידית של dextran מצומד ל-Texas red; כלי הדם הדורליים נראים לעיתים קרובות מעט מעל פני הקורטקס בתוך ה-dura mater.
עורקי קליפה (peel arteries) גדולים וורידים שוכנים על פני השטח הקורטיקליים. כלי דם חודרים מסתעפים מרשת פני השטח זו וצוללים אל תוך הקורטקס, שם הם מתפצלים למצע נימיים צפוף המזין את הרקמה הקורטיקלית. סרטון זה מציג את כלי הדם על פני השטח של הקליפה בעכבר ער.
ניתן להבחין בתנודות ספונטניות בקוטר העורק כאשר בעל החיים נמצא במצב מנוחה רגוע. שיטה זו צפויה להועיל במחקר של מגוון רחב של בעלי חיים טרנסוניים פלואורסצנטיים, הן במצב הרדמה והן במצב ערות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ליצירת חלון דימות יציב בגולגולת של עכבר, המאפשרת דימות לטווח ארוך ללא דלקת במוח. הטכניקה שימושית במיוחד למחקרים אורכיים העוסקים בזרימת דם ובדינמיקה תאית.
מרכיבים מרכזיים של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טכניקות דימוי
- דינמיקה תאית
רקע
- חלונות דימות יציבים הם קריטיים למחקרי in vivo.
- שיטות מסורתיות עלולות להפר את הסביבה התוך-גולגולתית.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית מאפשרת דימות עמוק של מבני מוח.
- מחקרים אורכיים דורשים תנאים יציבים לאורך זמן.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לדימות יציב של קורטקס העכבר.
- הס facilitar של דימות חוזר ללא גרימה לדלקת.
- שיפור חקר זרימת הדם ומבנים תאיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הצמדת מתקן ראש יציב לצורך דימות.
- דילול הגולגולת מעל פני השטח הגביים (דורסליים) של המוח.
- ליטוש פני השטח של הגולגולת למשמ השקיפות.
- חיזוק החלון באמצעות דבק ציאנו-אקרילט וזכוכית כיסוי.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של חלון דימוג יציב.
- יכולת דימוג של מבנים בעומק של עד 250 micrometers.
- יציבות לטווח ארוך שנצפתה לאורך שבועות.
- ויזואליזציה יעילה של מבני עורקים ונימי דם.
מסקנות
- השיטה מאפשרת דימות לא פולשני של קליפת המוח בעכבר.
- היא תומכת במחקרים מפורטים של דינמיקה תאית וזרימת דם.
- טכניקה זו יכולה לקדם את המחקר במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות אורך (Longitudinal) in vivo של תפקוד קורטיקלי דורש גישה אופטית יציבה ללא הפרעה לסביבה התוך-גולגולתית, צורך קריטי לתיקוף מטרות במדעי העצבים הפרה-קליניים. חלון גולגולת מודק, מלוטש ומחוזק (PoRTS) מאפשר מפגשי דימות חוזרים לאורך חודשים עם דלקת מינימלית, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות במערכות הרלוונטיות למחלה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של דינמיקה תאית וכלי דם בהכנות של חיות תחת הרדמה ובמצב ערות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הדמיה אורךית של כלי הדם הקורטיקליים ומבנים נוירונליים ללא פריצה של הגולגולת.
- ערך תפעולי: מפחית שונות ביולוגית על ידי שמירה על שלמות הסביבה התוך-גולגולתית לאורך מספר מפגשים חוזרים.
- ערך חיזוי: תומך בביטחון במטרה על ידי אפשרות לוויזואליזציה של השפעות תרופתיות על זרימת הדם ותפקוד תאי לאורך תקופות ממושכות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לסטנדרטיזציה של בדיקות המשך באמצעות אספקת פלטפורמת דימות יציבה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות הכנה עקבית של החלונות ובהירות אופטית לאורך שבועות.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה על פני מודלים טרנסגניים פלואורסצנטיים לצורך הערכת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לדימות של תפקוד קורטיקלי הן במצב של הרדמה והן במצב של ערות.
- ערך תפעולי: תומך בהלימה של ביומרקרים תרגומיים באמצעות מעקב ארוך טווח אחר תגובות וסקולריות ותאיות.
- הפחתת סיכונים: מסייע לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי הפחתת משתנים מבלבלים הנובעים מהפרעה כירורגית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
חלון ה-PoRTS משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשר ניטור רציף של תגובות ביולוגיות ללא הפרעה סביבתית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות הדמיה חוזרת של מבנים קורטיקליים לאורך זמן.
- סקירה: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות הכנת חלון סטנדרטית וניתנת לשחזור, עם חדירה כמותית לעומק של עד 250 μm.
- אנליטיקה: מספקת פלטים מדידים, כגון תנודות בקוטר כלי דם ודינמיקה של רשת נימיים, לצורך ניתוח השוואתי של מצבים.
- מחקר תרגומי: מחברת בין שלב הגילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות להדמיה במצב עירנות, המשקפת טוב יותר תגובות פיזיולוגיות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כבסיס ליכולת הניתנת לשימוש חוזר במחקרים שונים, ובכך מפחיתה את הצורך בהכנה כירורגית חוזרת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון תחזיתי בתיקוף המטרה באמצעות הפחתת עמימות מנגנונית ודימות אורך רציף ויציב.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה בין מעבדות ומערכות מודלים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go באמצעות הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים הנובע מהפרעה תוך-גולגולתית.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המבוסס על מדדים תפקודיים לאורך זמן במקום על נקודות סיום סופיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות מיקרו-כירורגיות ובהכנת חלון גולגולתי.
- מחייב מכשור מדויק הכולל מקדחות שיניים, חומרי פוליש ומערכות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.
- דורש סטנדרד אחיד בין הצוותים להבטחת עקביות בפרוטוקולים של דילול הגולגולת והחיזוק שלה.
- כולל שיקולי התאמה בין זני עכברים ומודלים טרנסגניים להשגת בהירות אופטית מיטבית.
- מוגבל על ידי הצורך בתחזוקה תקופתית למניעת התנתקות של זכוכית הכיסוי או התדרדרות הדבק במחקרים ארוכי טווח.
