הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

ניתוח אינטראקציות COMIN באמצעות רצף אבקה ותגיות היא שיטה לניתוח אינטראקציות COMIN ארוכות טווח ברחבי הגנום. בקיצור, אנו מכנים זאת magic share pad. שיטה זו כוללת שלבים רבים של ביולוגיה מולקולרית ועשויה להיות מורכבת.

לפיכך, בסרטון הבא נראה לכם כמה מהשלבים המרכזיים המעורבים ב-immuno immunoprecipitation ובבניית הספריה עבור אנליזת chair PET. שיקוע חיסוני של כרומטין, המכונה chip, הוא השלב הקריטי הראשון בבניית ספריה של chair pet. כאן, דגימות כרומטין מתרביות תאים עוברות קישור צולב (cross-linking), סוניקציה ושיקוע חיסוני.

מנות נפרדות של DNA מהשבב עוברים ליגציה למחברי חצי (half linkers) עם ברקוד, ולאחר מכן מתבצעת ליגציה של קרבה (proximity ligation). מקטעי ה-Pets משוחררים באמצעות עיכול רסטריקציה, מטוהרים על חרו지를 מגנטיים מצופים, ועוברים ליגציה למתאמים עבור ריצוף דור הבא. מקטעי chair pets כימריים מזוהים באמצעות הרכב מחברי ה-AB והתגים השוליים.

רצפי המקשר המרכזיים נקראים ומופנו אל הגנום. בסרטון זה, נציג את פרוטוקול ה-ChIP הסטנדרטי המשמש באופן שגרתי במעבדה שלנו על קו תאי סרטן השד MCF 7. מהנתונים שלנו עולה כי העשרה גבוהה יותר של ה-ChIP עם נוגדנים ספציפיים מניבה נתוני ChIP-seq טובים יותר. לכן, אנו ממליצים מאוד על אופטימיזציה של פרוטוקול ה-ChIP ואימות של ההעשרה באמצעות qPCR.

לפני המעבר לבניית ספריית chair pet, מתרבתו תאי CF seven עד למשקע של כ-75% בצלחת תרבית רקמה של 500 סמ"ר, המכילה כ-20 מיליון תאים לפני הקשירה הצולבת. יש להסיר את מצע הגידול ולשטוף את התאים פעמיים ב-PBS חם. קבע את התאים באמצעות 1.5 millimolar EGS שהוכן טרי למשך 45 דקות על רוטטור בטמפרטורת החדר. הוסף formaldehyde בריכוז של 37% עד לריכוז סופי של 1% והדגרה למשך 20 דקות.

יעילות הקשירה הצלבית היא קריטית ומשתנה בהתאם לקווי התאים ולחלבון המדובר. יש לבצע אופטימיזציה לריכוז החומר מקשיר, לזמן הדגירה ולטמפרטורה. יש לעצור את פעילות מקשרי הצלב באמצעות ריכוז סופי של 200 millimolar glycine למשך 10 דקות.

יש להשליך את קושרי הצלב (cross linkers) המנוטרלים ולשטוף פעמיים ב-PBS קר. יש להעביר את התאים על ידי גירוד משקע התאים באמצעות צנטריפוגת שולחנית מקוררת; המשקע מוכן כעת לליזיס של התאים. לחלופין, ניתן להקפיא את המשקע בטמפרטורה של 80- °C. אם משקע התאים קפוא, יש להפשיר אותו על קרח לפני תחילת הליזיס של התאים, ולסבב את המשקע עם תמיסת ליזיס 0.1% SDS.

סובב את המבחנה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה מקוררת, השלף את העליון (Supernatant) וחזור על תהליך ליזיס התאים. לאחר מכן, בצע ליזיס גרעיני לשחרור כרומטין מקשור (cross-linked) לפני פרגמנטציה של הכרומטין. היעדרו של הממברנה הגרעינית מאפשר ביצוע סוניקציה לכרומטין המקשור בתנאים עדינים יותר.

יש להשעות את ה-nuclear palette של Reus Band בבפר lysis Buffer עם 1% SDS. העבירו את התוךית למבחנה עבור צנטריפוגה במהירות גבוהה. סובבו את המבחנה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

הסרו שאריות גרעין באמצעות סרכזנייה. הפלטה הכרומטית צריכה להיראות כך. השתמשו בטיפ של פיפט P 1000 כדי לפרק את הפלטה לחתיכות ושטפו פעמיים עם 0.1% SDS lysis Buffer.

סובב את המבחנה בטמפרטורה של 4°C באמצעות צנטריפוגה מקוררת. הפלט הגרעיני מוכן כעת לסוניקציה. לחילופין, הקפא את הפלט בטמפרטורה של 80°C-.

העבירו את הפלט (pellet) למבחנה שקופה. הוסיפו למבחנה תמיסת ליזיס (lysis buffer) עם 0.1% SDS והסירו את כל הבועות. שמרו את הדגימות בקור לאורך כל תהליך הסוניקציה כדי למנוע התחממות יתר. תנאים שונים, כגון נפח התמיסה, עומק הפרובה, עוצמת הסוניקציה, מספר המחזורים ומידת הצלוב (cross-linking), עשויים להשפיע על יעילות הסוניקציה.

בצעו ביטול קשירה צולבת (Reverse cross-link) וחלוקה למנות (aliquot) של כרומטין באמצעות proteinase K והריצו ג'ל agarose. כדי לאמת את יעילות הפרגמנטציה, מומלץ לבצע אופטימיזציה כדי להגיע לטווח הגדלים הרצוי של ה-DNA שבין 200 ל-600 bp. הסירו את משקעי התאים באמצעות צנטריפוגציה.

הכרומטין מוכן כעת לשטיפה מקדימה (pre-clearing) באמצעות חרוזי מגנט. לחלופין, ניתן להקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לאיסוף כמות מספיקה של כרומטין. כדי להתחיל את ה-ChIP, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם תמיסת שטיפה לחרוזים; שטיפה זו ושטיפות עתידיות המערבות חרוזי חלבון מגנטיים מורכבות מהשלבים הבאים.

הוסיפו כרומטין שעבר סוניקציה לחרוזי הבסיס שנשטפו מראש והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 4°C במבחנה נפרדת. כסו את החרוזים שנשטפו מראש בנוגדן והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. שטפו את החרוזים המכוסים בנוגדן פעמיים עם בופר שטיפת חרוזים.

המורכבות הגבוהה של התסבכת עבור ליגציה בקרבה מובילה ללא תמורה לרעש לא ספציפי משמעותי, ובכך מעלה את עלות הריצוף. מלבד הפחתת רמת המורכבות ורעש הרקע, השתמשנו בנוגדן מונוקלונאלי ל-RNA polymerase two של עכבר כדי לזהות אינטראקציות של כרומטין המעורבות בבקרה על שעתוק.

דבר זה מאפשר חקירה של מקדמים (promoters) פעילים ואת האזורים הרגולטוריים התואמים להם, מה שמאפשר הבנה של שעתוק יעיל וייתכן ששיתופי. השליכו את תמיסת השטיפה מהחרוזיים המצופים בנוגדנים. שלבו כרומטין שעבר ניקוי מקדמי (Pre-cleared chromatin) עם חרוזיים מצופים בנוגדנים והדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר ההדגירה למשך לילה, החרוזיים יעברו סדרה של שטיפות להסרת כרומטין שאינו קשור. השעיקו את החרוזיים בנפחי תמיסת TE. קצית קטנה תישמר לבדיקה כמותית ולבדיקת העשרה. ניתוח אינטראקציית כרומטין באמצעות רצף PaD ו-Tag היא טכניקה שפותחה לניתוח de novo בקנה מידה רחב של מבני כרומטין מסדר גבוה המגיבים זה עם זה.

מקטעי DNA שהועשרו באמצעות שיקוע חיסוני של כרומטין נלכדים על ידי ליגציה בקרבת מקום. אסטרטגיית ה-pad וה-tag מיושמת בבנייה של ספריות CHI PET, המרצפות באמצעות טכנולוגיות ריצוף רחב-הספק של הדור הבא. בסרטון זה, נציג את ההיבטים הניסיוניים הקריטיים בבניית ספריית CHI PET.

החצי הראשון של בניית הספריה כולל מניפולציה של חרוזי protein A או G, שאליהם קשורים מקטעי ה-DNA, במטרה להסיר את האנזימים ואת מלח התמיכה. לאחר כל תגובה אנזימטית, השתמשו בסנטריפיגציה עדינה ובפעולת נקישה (flicking) בכל שלב של השטיפה. שאיפו את העלייה (supernatant) באמצעות פפטה מספר פעמים כדי למקסם את לכידת החרוזים כאשר הם מונחים על חלקיק מגנטי.

מכשיר ריכוז לכל שלבי האינקובציה המכילים חרו지를 בתערובת התגובה. הכין תערובת מאסטר (master mix) מראש והוסף את האנזים בסוף, לאחר שהחרוזים הושעו באופן הומוגני. ודא שהחרוזים מעורבבים היטב לאורך כל האינקובציה. אוליגו-נוקלאוטידים של חצאי מקשרים (Half linker) תוכננו עם ברקוד פנימי המורכב מארבעה נוקלאוטידים ואתר זיהוי עבור אנזים ההגבלה מסוג IIS‏ MME1.

לאחר ליגציה של מחברי החצי (half linkers) למקטעי ה-DNA הקשורי בקומפלקסים כרומטיניים C, מקטעי ה-DNA המקימים יחדיו אינטראקציה יחוברים באמצעות רצף מחבר מלא. מחברי חצי אלו יוצרים רצפים עם מחברי ab הטרודימרים הנובעים מתוצרי ליגציה לא ספציפיים, או רצפים עם מחברי AA או BB הומודימרים הנובעים מתוצרי ליגציה ספציפיים. לפיכך, השימוש בשני מחברי חצי בעלי ברקודים נוקלאוטידיים שונים מאפשר אפיון של ניסויים או חזרות שונות, כמו גם ניטור של שיעורי הליגציה כימריים לא ספציפיים בין קומפלקסי שבבים שונים.

חשוב להכין את התגובה על קרח ולהפשיר את ה-half linkers בעדינות על קרח. ערבבו היטב את ה-half linkers עם מים ולאחר מכן עם PEG המכיל ligase buffer. ודאו שה-master mix מעורבב היטב לפני ה-resus.

הוסיפו T4 DNA ligase ל-chip DNA המושעה רק לאחר שקישורי החצי (half linkers) ומקטעי ה-chip DNA עורבבו היטב, כדי למנוע שרשראות (concatenation) של קישורי החצי. אטמו את המבחנה בפראפילום. דגרו למשך לילה ב-16 °C עם סיבוב. קומפלקסים של כרומטין שלמים נשטפים לאחר מכן מהחרוזים על ידי הוספה של SDS בבופר EB; השתמשו ב-eluted DNA להורדת ריכוז ה-SDS ב-Triton X 100 כדי לנטרל את כל ה-SDS. מעגליות של קומפלקסי כרומטין מוגשמת על ידי ליגציה של שני קישורי חצי, היוצרים רצף קישור שלם בנקודת המפגש. בצעו ליגציה לקומפלקסי כרומטין שנטהו בתנאים של דילול קיצוני כדי למזער ליגציות בין קומפלקסים שונים של DNA-חלבון; הוסיפו T4 DNA ligase רק לאחר שקומפלקסי הכרומטין שנטהו דוללו היטב בתערובת התגובה. לאחר ביטול הקשרים (Reverse cross-linking), כדי להסיר חלבונים הקשורים ל-DNA, טהרו את מקטעי ה-DNA המעגליים באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם. השתמשו במערכת KaiGen phase lock gel להפרדה קלה.

לאחר הפקת הפניל, השתמש בנשא ה-DNA מסוג glyco blue A כדי להגדיל את המסה ואת נראות המשקע. חצאי אוליגו-נוקלאוטידי המקשר (linker) מכילים אתרי זיהוי של MM E one משני הצדדים. אנזים הגבלה מסוג Type two S מסוג MM E one חותך 18 ו-20 זוגות בסיסים במורד אתרי קישור המטרה שלו כדי להפיק תגים קצרים של מקטע הכרומטין, ובכך יוצר מבני מקשר-תג של PET המכונה בקיצור pets.

בנוסף, כל חצית-מקשר (half linker) מ модиפית באמצעות ביוטין כדי לאפשר ניקוי של מבני ה-pet באמצעות חרוזי מגנט מצופים בסטרפטאבידין. בצע עיכול MME אחד לשחרור מבני ה-tag Linker. נקה את ה-pets על ידי קישור סלקטיבי לחרוזי סטרפטאבידין, וקשור (ligate) את מבני ה-pet למתאמים עבור ריצוף בסביבה בעלת תפוקה גבוהה.

השתמש ב-fusion DNA polymerase כדי להגביר את ה-CHI PET Library Fusion. DNA polymerase משמש ליצירת תבניות בדיוק וביעילות גבוהים. הכן את תגובת ה-PCR במצב קר והוסף את ה-fusion DNA polymerase אחרון.

מכיוון שהאנזים מראה פעילות אקסונוקליאז 3' ל-5' שעלולה לפרק פריימרים בהיעדרה של dNTPs. אם ספריית ה-charset נבנתה בהצלחה, צריכה להופיע פס בולט וברור של כ-223 זוגות בסיסים. הימנעו מפסים לא ספציפיים בעת גזירת הפס של 223 זוגות בסיסים מהג'ל, וטהרו את הפס הגזור באמצעות פרוטוקול Gel Crush.

בצעו בקרת איכות באמצעות Agilent 2, 100 bioanalyzer עם ערכת DNA 1000 לפני ריצוף בעלת תפוקה גבוהה. הדגמנו כעת את פרוצדורת CHI PET לזיהוי לא מוטה של אינטראקציות כרומטין ברחבי הגנום. איכות נתוני ה-CHI PET תלויה ביעילות הנוגדן שנעשה בו שימוש שבשבב ובעומק הריצוף.

כאן אנו משתמשים ב-18 עד 20 מיליון קריאות למיפוי אינטראקציות. פרוטוקול ספציפי זה שימש לאפיון מוצלח של רשתות אינטראקציית כרומטין הקשורות לקולטן האסטרוגן ול-RNA polymerase בגנום האנושי. אנו צופים כי בדיקה זו תהיה כלי רב עוצמה למחקרים עתידיים על הארכיטקטורה התלת-ממדית של ביולוגיית השעתוק בהקשר של הגנום השלם.

אנו מקווים שסרטון זה יהיה שימושי עבורכם. תודה שצפיתם.