ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנטר אינטראקציות של קולטני ליגנד עם העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית. השיטה המוצגת כאן משתמשת בתכונה מעניינת של PDA BLUESHIFT בספקטרום ה-UV לעומת ספקטרום הספיגה האלקטרוני של PDA. לאחר שאנליט מקיים אינטראקציה עם קולטנים המחוברים ל-PDA, מסונתז תחילה פולימר D אצטילן או PDA, ומכינים ליפוזומי PDA.

הדומין הבא R המתויג BSA קשור למשטח הליפוזום PDA. כאשר נמדדת העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית. ספקטרום הפליטה של BSA Rod Domine הקשור לליפוזום חופף לספקטרום הספיגה של PDA.

זה עונה על דרישת התהודה למנגנון השריגים. לפיכך, ניתן להשיג נתונים המצביעים על אינטראקציות בין ליגנדים לקולטנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות כמו אלייזה הוא ששיטה זו פשוטה מאוד וזולה.

מכיוון שהפלואורסצ רגיש יותר באופן מהותי מקלורימטריה, אנו יכולים לקבל את גבול הזיהוי בריכוזים נמוכים מאוד של תת-ננו מולר או נמוכים יותר. ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על חישה חיידקית וויראלית מכיוון שהיא יכולה לחוש באופן סלקטיבי את המיקרובים האלה בריכוזים נמוכים מאוד. הרעיון של שיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר מצאנו את היעילות של חיישני קו PAL לביקור איומים בשנת 2010.

נניח שיש לנו שתי מולקולות, תורם ומקבל, ושתי המולקולות מחוברות זו לזו. לאחר מכן, כאשר אנו נותנים כמות מסוימת של אנרגיה לתורם, התורם מתרגש ממצב הקרקע למצב הנרגש, ואז האנרגיה הזו מועברת למקבל. אז המקבל במצב הקרקע מקבל את האנרגיה הזו ומתרגש בהעברת האנרגיה של התנגדות הקרינה.

אותו דבר קורה, אבל במונחים של פלואורסצנטיות, שם התורם מתרגש, אבל האנרגיה מועברת למקבל והמקבל הוא זה שנותן פלואורסצנטיות. זה כאילו שיש לך שתי נורות יחד שבהן אתה נותן את החשמל לאחת הנורות, אבל הנורה השנייה נושבת ללא חשמל. כאן אנו רוצים להראות את תלות המרחק של הפריט.

פריט עובד רק כאשר התורם והמקבל קרובים מאוד זה לזה, שזה בערך 10 ננומטר. בואו נרגש כאן את המולקולות התורמות, אבל כפי שאתם יכולים לראות, המולקולה המקבלת רחוקה. כך שגם אם אנו נותנים כמות מסוימת של אנרגיה לתורם, היא לא מועברת למולקולה המקבלת.

אז פרד לא עובד. אז F פרד תלוי מרחק. עוזר הידרוקסי CIN, D אצטילן, או N-H-S-P-C-D-A הוא מרכיב חיוני בהכנת ליפוזומים.

לאורך הליך זה, יש להגן על תמיסת ה- PDA מפני אור. בעזרת עטיפת נייר אלומיניום על כל מיכל, התחל את הסינתזה במכסה אדים כימי. בבקבוק תחתון עגול שלבו 10 12 חומצה דית פנטקוסטלית, סוף הידרוקסי CIN אמיד ואחד שלושה אמינו דימתיל פרופיל.

שלושה אתיל קרבימיד הידרוכלוריד בנפח סופי של 20 מיליליטר כלורו מתאן יבש בבקבוק תחתון עגול. מערבבים את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. וודאו שהבקבוק סגור היטב.

לאחר מכן העבירו את הבקבוק למאייד סיבובי כדי להסיר את הממס. לאחר הסרת הממס, סרט דק יבש יישאר מתחת למכסה אדים. הוסף תמיסה המורכבת מ -25 מיליליטר אתר דתיל ו -25 מיליליטר מים לבקבוק התחתון העגול וסובב בעדינות כדקה.

כדי להרכיב מחדש את השאריות, העבירו את התמיסה למשפך מפריד והפכו מספר פעמים לערבוב. לאחר ששכבות אתר האתיל והמים נפרדות, פתח את הברז כדי להסיר את השכבה המימית לכוס. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיליליטר מים למשפך ההפרדה וערבבו.

חזור על תהליך החילוץ כמו קודם בסך הכל שלוש מיצוי. שילוב השכבות האורגניות מכל מיצוי לאחר המיצוי האחרון, ייבוש השכבה האורגנית בגרם אחד של מגנזיום גופרתי למשך חצי שעה. בעזרת מסנן ווטמן, נייר סינון ציון, סנן את התמיסה.

לאחר מכן הסר את אתר האתיל על ידי אידוי סיבובי לקבלת אבקה מוצקה לבנה של N-H-S-P-C-D-A. לאחר מכן, העבירו שניים עד שלושה מיליגרם אבקה לכלורופורם דוטראט בצינור NMR. נתח את ה-N-H-S-P-C-D-A באמצעות תהודה מגנטית גרעינית כפי שמוצג כאן.

שיאי NMR חדשים נראים ב-2.842. להכנה בבקבוק תחתון עגול ממיסים PCDA ל-P-C-D-A-N-H-S לאחד שניים די אריסטו SN גליצרול שלושה פוספוכולין שמונה לאחד לאחד ל-20 מיליליטר של די כלורו מתאן תוך כדי ערבוב. לאחר מכן, הניחו נייר סינון ווטמן בתוך משפך ושפכו את התמיסה כדי להסיר אגרגטים.

אוספים אותו בבקבוק תחתון עגול. העבירו את הבקבוק למאייד סיבובי, ואז אידו את הממס לחלוטין כדי להניב סרט דק של מונומרים. בעזרת ואקום יבש סרט דק למשך הלילה.

למחרת, הוסף 50 מיליליטר מים נטולי יונים כדי ליצור תמיסת ליפוזום ב-0.65 עד מילימול אחד. לאחר מכן העבירו את התמיסה לכוס חדשה של 50 מיליליטר והפכו את המתלה שנוצר לסוניקציה עם אטור בדיקה ב-76 מעלות צלזיוס למשך כ-18 דקות. העבירו בזהירות את התמיסה דרך נייר סינון ווטמן במשפך כדי להסיר את אגרגטי השומנים ולאסוף אותה בבקבוק.

הניחו את התמיסה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לקדם הרכבה עצמית של המונומרים. למחרת הפתרונות אמורים להיות ברורים אופטית, לפלמר את ליפוזומי מונומר דיא אצטילן בהרכבה עצמית על ידי הקרנה עם 254 ננומטר של קרינת UV למשך כשתי דקות. באמצעות מקור UV של קרן עט באוויר, התמיסה השקופה תהפוך לכחולה לאחר חשיפה לאור UV.

תמיסת הליפוזום תהיה יציבה בטמפרטורת החדר למשך שבועיים לפחות ותהיה יציבה יותר בקירור. כדי לקשור דומין מוט BSA למשטח הליפוזום, יש להמיס את מוט BSA דומין ב-PBS לריכוז סופי של 1.2 מיקרו-מולאר של תמיסת BSA Rod Domine, הוסף שני מיליליטר של דומין מוט BSA ל-10 מיליליטר של תמיסת ליפוזום שהוכנה בסעיף הקודם בטמפרטורת החדר. עקבו אחר תגובה קלאסית לקשירת קבוצות אמינים משאריות הליזין של חלבונים לחומצה קרבוקסילית המופעלת על ידי קבוצת NHS.

N-H-S-P-C-D-A תוכנן לקשירה קוולנטית של מולקולות חלבון עם ליפוזומים באמצעות תגובות אמין של NHS. NHS הוא חומר עזיבה מצוין המניע את תגובת החומצה הקרבוקסילית אמין בכיוון קדימה. התשואה של תגובה זו בתנאים מתאימים צריכה להיות כמותית.

כדי להסיר חופשי BSA Rod Domine להשרות נקבובית ספקטרה, קרום אסטר תאית ביוטכנולוגית עם חתך משקל מולקולרי של 100, 000 במים נטולי יונים למשך 15 דקות בכוס ליטר אחד לביצוע דיאליזה כדי לחסל BSA Rumine לא תגובתי, שמשקלו המולקולרי הוא כ 66, 000. דלטון מעביר בזהירות את התמיסה לקרום הדיאליזה וטובל אותה ב-800 מיליליטר. מים נטולי יונים בחושך, החליפו את המים ב 2 8 14 24 ו -36 שעות לאחר 48 שעות, העבירו את התמיסה הסופית לבקבוקון מכוסה בנייר אלומיניום.

אחסן את הבקבוקון בארבע מעלות צלזיוס כדי לעקוב אחר קשירת החלבון באמצעות שריג BSA. רוד דומין: ליפוזומים מתויגים לפני ואחרי פילמור נותחו באמצעות UV V וספקטרוסקופיה פלואורסצנטית, כפי שניתן לראות כאן עבור התורם והמקבל המבודד. יעילות השריג תלויה מאוד במרחק המקבל של התורם ו- J. המרווה בפליטה נצפית בגלל חריץ בין r דומין ל- PDA עקב הופעת ספיגה אלקטרונית.

ספקטרום של מחשב כף יד כחול לאחר פילמור פוטו. כאן, יעילות השריג היא אפס עבור ליפוזומים לא מפולימרים ורוד דומין מכיוון שיש אפס חפיפה ספקטרלית עבור ליפוזומים לא מפולימרים באזור הנראה. כדי לנטר את השריג בין ליפוזומי מוט דומין ו-PDA שהוכנו כמתואר בסרטון זה, נותחו ליפוזומים מתויגים בביוטין מפולימרים ופולימרים של האו"ם באמצעות ספקטרוסקופיה UV וספקטרוסקופיה פלואורסצנטית.

כפי שניתן לראות כאן, פליטת רומין SR 1 0 1 מופחתת בכ-45% לאחר פילמור מה שמרמז על כיבוי פליטה עקב דאגה עם תוספת סטרפטווידין לתמיסה. החפיפה הספקטרלית המצוינת על ידי ערך J פוחתת כפי שניתן לראות כאן. יעילות השריג ירדה עם העלייה בריכוז הסטרפטווידין.

פליטת הדומין R גדלה לאחר הוספת סטרפטווידין עקב הירידה בערך J עבור ספקטרום פליטת הדומין של sofo R וספקטרום ספיגת PDA בעקבות אינטראקציות סטרפטווידין ביוטין. זה מצביע על כך שברמה המולקולרית, אינטראקציות הביוטין סטרפטווידין מובילות לשינויים עדינים באורך ההצמדה האפקטיבי של ה-PDA, מה שמביא לירידה בצורת ה-PDA הכחולה לצורת PDA אדומה יציבה יותר מבחינה תרמודינמית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנטר באופן סלקטיבי אינטראקציה של מדריכי ליגנד באמצעות איום ביצוע הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלייזה כדי לענות על שאלות נוספות כמו קשירה סלקטיבית של חלבונים.