הנדסה האבולוציה של הנגיף Adeno הקשורים סינתטי (AAV) בריפוי גנטי באמצעות וקטור משפחת ה-DNA של גרירת רגליים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור ספרייה מגוונת מאוד של קפסידים סינתטיים של וירוס adeno associated, שמתוכה ניתן לבחור חלקיקים בעלי תכונה רצויה. דבר זה מושג תחילה על ידי פרגמנטציה, שיבוט ובחירה של גני קפסיד a a v באמצעות עיכול DNA מבוקר, כדי לאפשר את הרכבתם מחדש לרצפים כימריים באמצעות שתי תגובות PCR. כשלב שני, תוצר ה-PCR שהתקבל משובט בחזרה אל תוך מבנה a a v בעל יכולת רפליקציה, כדי להפיק ספריית פלסמיד הכוללת לפחות מיליון גני קפסיד a a v שונים.

בשלב הבא, ספריית פלסמידים זו מוחדרת (transfected) לתאי 2 9 3 T, יחד עם פלסמיד עזר אדנו-ויראלי, במטרה להפיק ספריית נגיפים כימריים שניתן לבחור מתוכה לאחר מכן על תאי מטרה או בבעלי חיים. התוצאות מראות הנדסה מולקולרית ואבולוציה מוצלחות של וקטורי A A V סינתטיים חדשים, המבוססות על ביטוי מוגבר או ספציפי יותר של גן דגגל (reporter gene) בתאים בתרבית או בעכברים בוגרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תצוגת פפטידים (peptide display), הוא שלערבוב משפחות DNA (DNA family shuffling) יש פוטנציאל לשנות ולשפר בו-זמנית מאפיינים מרובים של קפסיד ה-AV, החל מקשירה לתאים ותעבורה תוך-תאית ועד להסרת המעטפת (uncoating) וביטוי גנים בגרעין.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הטיפול הגנטי והוירולוגיה, כגון כיצד להשיג וקטור אידיאלי עבור יישום טיפולי נתון או כיצד לנתח את הדומיינים של קפסיד ויראלי האחראים לתכונה מסוימת. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות אנושיות מרובות, כולל זיהומים בפתוגנים ויראליים, כיוון שהשיטה שלנו מאפשרת אבולוציה מולקולרית של וקטורי AAV המדביקים באופן ספציפי ועוצמתי תאי מטרה ויראליים, כגון T-cells עבור HIV או הפטוציטים עבור נגיפי ההפטיטיס. כמו כן, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הביולוגיה של AAV ויש להשתמש בה לשיפור וקטורי AAV עבור טיפול גנטי.

ניתן ליישם זאת בקלות גם על משפחות גנים אחרות בעלות רלוונטיות בסיסית או יישומית, כגון גנים המקודדים לפלואורסצנציה התלויה במינון, שלושה דוחות (reporters), אנזימים תאיים או חלבונים המעורבים בהשתקת RNA (RNA interference). הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר ניסינו למצוא וקטור מתאים להחדרה של גנים טיפוליים לרקמות של עכברים בוגרים, והבנו כי לכל הסרוטיפים של AV המופיעים בטבע ישנם חסרונות, כגון שכיחות גבוהה באוכלוסיית בני האדם, ובהתאם לכך, שכיחות גבוהה של חסינות קיימת או ביצועים דלים in vivo למרות יעילות של טרנסדוקציה של הפטוציטים in vitro. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שבירת גן ה-AV caps מבוסס ה-DNA וכמה משלבי ייצור ספריית הנגיפים קשים ללמידה מכיוון שהם דורשים ניסיון ומודעות לשלבים הקריטיים, וזאת כדי להקל על ההכנה השגרתית של כמויות מספיקות של גני הקפסיד של נגיפי adeno associated השונים.

עבור ערבוב DNA (DNA shuffling), גנים אלו מושבטים תחילה לתוך שלד פלסמיד משותף. כדי להשיג זאת, הגנים של ה-cap הרצויים מוגברים תחילה באמצעות PCR מפלסמידי AAV זמינים, תוך שימוש בפריימרים cap F ו-cap R. לאחר מכן, גני ה-cap מושבטים לתוך פלסמיד שהונדס להכיל אתרי קישור ספציפיים לפריימרים וכן אתרי הגבלה. בדוגמה זו, גן ה-cap מושבט לאתרי PAC one ו-SC one, שנמצאים בפריימרים המשמשים להגברת ה-cap ובפלסמיד המקבל, אך אינם קיימים ברוב ה-AAVs. לאחר יצירת מערכי הפלסמידים המקודדים לגני קפסיד של AAV, מתחילים בתהליך ה-cap shuffling באמצעות PCR, על ידי הגברת גני ה-cap הנבחרים באמצעות הפריימרים T3 ו-T7.

הכינו תגובת PCR בנפח של 50 µL המכילה 200 ng של פלסמיד cap, כל פריימר בריכוז סופי של 2 µM, 10 µL של בופר High Five בריכוז 5x, ו-1 µL של פולימראז High Five. תגובה זו תניב כ-3 µg של תוצר PCR, כמות המספיקה לעד שש תגובות shuffling, תלוי במספר גני ה-cap שייכללו בספרייה. התחילו ב-5 דקות ב-95 °C ולאחר מכן הריצו 40 מחזורים של 15 שניות ב-94 °C, 30 שניות ב-57 °C ושלוש דקות ב-68 °C, ולאחר מכן שלב סופי של 10 דקות ב-72 °C.

לאחר טיהור תוצרי ה-PCR, משתמשים בעיכול DNA מבוקר כדי ליצור פרגמנטים של גן cap לצורך הרכבה מחדש לתוך Kyra. אחד ההיבטים המורכבים ביותר בפרוצדורה זו הוא השגת טווח שימושי מסוים של פרגמנטים של DNA מעוכלי cap להרכבה מחדש לתוך kyras; למטרה זו, אנו מכינים כמויות גדולות של גני cap מטוהרים כנקודת התחלה, ולאחר מכן מקיימים מספר תגובות מקבילות בתנאים משתנים. כדי להכין את העיכול באופן אחיד, מערבבים את תוצרי ה-PCR השונים של cap לכמות כוללת של 4 µg ב-54 µL מים, ולאחר מכן מוסיפים 6 µL של תמיסת בופר לתגובת DS ו-0.5 µL של DNAs one לתגובה. מערבבים בזהירות את המבחנה שלוש פעמים, סובבים (spin) לזמן קצר ומניחים מיד על בלוק חימום בטמפרטורה של 25 °C.

דגרו את התגובה הראשונה הזו למשך דקה אחת. לאחר מכן, הכינו תגובת עיכול שנייה, אך דגרו אותה בטמפרטורה של 25 °C למשך דקה אחת ו-15 שניות. באופן זה, הגדירו מספר תגובות מקבילות עם זמני דגירה שבין דקה אחת לשתי דקות, תוך שינוי זמן הדגירה במרווחים של 15 שניות.

עצרו כל תגובה על ידי הוספה של 6 µL של EDTA בריכוז 25 mM. ערבבו קצרה במערבל (vortex) והדגרירו למשך 10 דקות ב-75 °C. התגובות המקבילות הרבות יניבו חמישה דגימות cap שעברו עיכול עם DNAs, אחת עבור זמני הדגרה משתנים; טהרו את מקטעי ה-cap על ג'ל AROS סטנדרטי בריכוז 1%.

באופן אידיאלי, יש לראות מריחה (smear) בין 100 ל-500 base pairs, כפי שמוצג בדוגמה זו עם זמני אינקובציה התחלתיים של דקה אחת, 45 שניות או שתי דקות. בערבוב משפחות של DNA (DNA family shuffling), מקטעי ה-cap מורכבים תחילה מחדש לרצפים באורך מלא באמצעות PCR, שבו הם משמשים כפריימרים עצמיים על בסיס הומולוגיות חלקיות. הכינו תגובה של 50 µL הכוללת 500 ng של מקטעים מנוקים, 10 µL של 10 x fusion buffer, מיקרוליטר אחד של 10 mM dNTPs, 1.5 µL של DMSO ו-0.5 µL של fusion.

מדגרירים שני פולימראזים למשך 30 שניות ב-98 degrees Celsius ולאחר מכן מריצים 40 מחזורים של 10 שניות ב-98 degrees Celsius, 30 שניות ב-42 degrees Celsius ו-45 שניות ב-72 degrees Celsius, ולאחריהם שלב סופי של 10 דקות ב-72 degrees Celsius. לאחר מכן, מבצעים הגברה של גני ה-cap שהורכבו מחדש לצורך שיבוט (cloning) עוקב באמצעות PCR שני, תוך שימוש בפריימרים הנקשרים לרצפים השמורים המקיפים את האתר. לדוגמה, עבור סט SAF ו-SAR או CUF ו-CUR, מכינים תגובה בנפח של 50 µL המכילה 2 µL מתוצר ה-PCR הראשון, של כל פריימר בריכוז סופי של 2 µM, 0.5 µL של magnesium chloride, 10 µL של 5x high-FI buffer ו-1 µL של high-FI polymerase.

מומלץ לבצע בין 16 ל-24 תגובות PCR כדי להבטיח תנובות גבוהות מספיק לשבוט接 (cloning) עוקב. לאחר איחוד תגובות ה-PCR וטיהור פס הכובע (cap band) באורכו המלא, השלב הבא הוא עיכול של מאגר גן ה-cap המטוהר באמצעות PAC one ו-ASC one לשבוט לתוך פלסמיד AAV בעל יכולת רפליקציה. הפלסמיד המקבל נושא חזרות טרמינליות הפוכות (inverted terminal repeats) של AAV המקיפות את גן ה-rep של AAV2 תחת בקרת פרומוטור AAV P5, PAC one ו-ASC one.

אתרי הגבלה במורד ה-rep מאפשרים שיבוט בתוך המסגרת (in-frame cloning) של מאגר ה-cap המעורבב. אתרי קישור של פריימר LSE המסומנים בחצים שימושיים לריצוף של גן ה-cap; יש לערבב את מקטעי ה-cap ואת שלד הפלסמיד המקבל החתוך באופן מתאים ביחס מולרי של שלושה לאחד. הכין תערובת מאסטר בנפח כולל של 40 µL המספיקה ל-20 טרנספורמציות, עם ריכוז DNA סופי של 15 ng/µL.

דגרו למשך לילה ב-16 °C. למחרת, בצעו טרנספורמציה של תגובת הליגציה לתוך e coli. ערבבו 2 µL מתגובת הליגציה עם 30 µL של e coli אלקטרו-קומפטינטים והעבירו לקיווטות אלקטרופורציה שקוללו מראש על קרח. בצעו אלקטרופורציה במתח של 1.8 kV, התנגדות של 200 ohms וקיבול של 25 µF. קבוע הזמן צריך להיות קרוב ל-5 ms. מיד לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של מצע SOC שחומם מראש, והעבירו לבקבוק של 250 mL.

20 תהליכי אלקטרופורציה כאלה יניבו ספרייה עם גיוון של כ-1 × 10⁶ שיבוטים שונים. הוסף נפח אחד של מצע SOC שחומם מראש לטרנספורמציות המאוחדות וסחרר ב-37 °C וב-180 RPM למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסף 40 milliliters של הטרנספורמציות המאוחדות ל-800 milliliters של מצע lb בתוספת ampicillin והדגר למשך 16 שעות נוספות תחת אותם תנאים; לאחר מכן טיהר את ה-plasma DNA של הספרייה באמצעות ערכה זמינה מסחרית.

הפקת הספריה הוויראלית מתחילה בטרנספקציה של תאי HEC 2 9 3 T עם ספריית a a v. כדי להתחיל בהליך זה, זרעו תאי HEC 2 9 3 T ב-10 צלחות ריבועיות של 15 סנטימטרים וגדלו אותם במשך 48 שעות ב-37 °C. עבור כל טרנספקציה, הכינו את שתי תערובות הריאגנטים הבאות בשני מבחנות נפרדות. הכמויות הבאות נתונות עבור 10 צלחות במבחנה הראשונה.

ערבבו 7.9 milliliters של sodium chloride ו-DNA והוסיפו מים עד לנפח כולל של 15.8 milliliters. במבחנה השנייה, הוסיפו 3.52 milliliters של polyethylene amine, 7.9 milliliters של sodium chloride ו-4.38 milliliters מים. שלבו את התערובות, בצעו vortex והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חלקו את התמיסה באופן שווה בין כל אחת מהצלחות של תאי 2 9 3 T. הדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

לאחר 48 שעות, ניתן לאסוף את הספרייה הוויראלית. גרדו את התאים אל תוך התווך, רכזו את התאים מכל הצלחות הפטרי במבחנה אחת וסובבו ב-1200 RPM למשך 15 דקות. השעיו את משקע התאים בשישה מיליליטר של lysis buffer, ולאחר מכן העבירו את הדגימה חמישה מחזורי הקפאה והפשרה; לאחר חמישה מחזורי ההקפאה וההפשרה, דגרו עם Ben Nase למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius.

בשלב הבא, יש לסבב את שיירי התאים (cell debris) במהירות של 3,750 RPM למשך 20 דקות. הכינו גרדיאנט לטיהור הנגיף באמצעות פיפטת פסטור, על ידי הוספת 5 milliliters של תרחיף נגיפים לשפופרת צנטריפוגה מסוג Beckman Quicks seal, ולאחר מכן 1.5 milliliters של כל אחד מפתרונות ה-idal בריכוזים של 15%, 25% ו-40%. השלימו את נפח הגרדיאנט באמצעות באפר ליזיס (lysis buffer) ובצעו אולטרצנטריפוגה במהירות של 50,000 K למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

עם סיום האולטרסנטריפוגציה, הוצא את המבחנה מהרוטור ונקה את החלק החיצוני של המבחנה ב-70%ethanol. החדר מחט לחלק העליון של המבחנה לצורך אוורור, והשתמש במחט נוספת כדי לשאוב 1.2 milliliters של פראקציית ה-40%IOL. הקפד להימנע משאיבה מפראקציית ה-25% כיוון שהיא מכילה חללי ריק.

קפסידי AAV. קלונים בודדים מספריית הפלסמידים המקורית נותחים לצורך בדיקת התפקוד והגיוון שלהם על ידי שימוש בהם להפקת וקטורי AAV המבטאים גן דגל (reporter gene) בתאים מתורבתים או בבעלי חיים; לאחר מכן, הם מודבקים בכמויות שונות של הנגיף המזוקק ויעילות הטרנסדוקציה נקבעת.

מוצגות כאן תוצאות של מיקרוסקופיית פלואורסצנציה משלוש שורות תאים אנושיות שהודבקו בחמישה וקטורים שונים של AAV המבטאים YFP שנוצרו עם גני cap שעברו shuffled. שיטה חלופית לניתוח יעילות התעתוק היא מדידה מבוססת FACS של ביטוי גן דגל פלואורסצנטי. איור זה מציג תוצאה טיפית מארבעה סוגי תאים: כליה אנושית, צוואר רחם אנושי, פיברובלסטים של עכבר ותאי T אנושיים, שהודבקו ב-18 וקטורים שונים של AAV המבטאים YFP שנוצרו עם גני cap שעברו shuffled ונבחרו באופן אקראי מספרייה מקורית.

הביטוי של YFP סומן בצבעים להקלה על הוויזואליזציה. התמונות מציגות אחוזים של תאים שעברו טרנסדוקציה, כאשר שחור מציין 0% ולבן מציין את המספר הגבוה ביותר שנמדד בכל סוג תא. קלון B שני (אדום) מדגים קלון עם יעילות כללית נמוכה, כפי שניתן לצפות מקפסيدات שלא עברו סלקציה. לאחר מכן ניתן לסרוק את הספרייה הוויראלית כדי למצוא חלקיקים בודדים המציגים את מרבית התכונות הרצויות או את כולן בשורת תאים נתונה או בבעלי חיים לצורך סלקציה.

בתאי תרבית, התאים נדבקים תחילה בזיהום משותף (co-infection) עם מנות שונות מהספרייה ועם נגיף ENO five כדי לתמוך בצמיחת ה-a a v, לאחר מכן התאים נאספים וה-a a v המועצם מופק ומשמש להדבקה מחדש של תאים חדשים. קביעת יחסי ה-a a v adenovirus האופטימליים עבור זיהום משותף של תאים היא חשובה, ומדד טוב לזיהום arius רב-עוצמה הוא הופעת אפקטים ציטופתיים שלושה ימים לאחר החדרת הנגיף, המתבטאים בעיגול תאים והיפרדותם. באיור זה, הפאנל השמאלי העליון מראה תאים שאינם מזוהמים, בעוד שהפאנלים האחרים מראים תאים שנדבקו בכמויות המצוינות של חלקיקי adenovirus לתא. מדד שימושי נוסף לזיהום והעצמה של a a v הוא זיהוי חלבוני הקפסיד באמצעות western blotting תוך שימוש בנוגדן B one המזהה אפיתופ קפסיד של a a v השמור מאוד.

הבלוט השמאלי מציג תאים שנדבקו בזינוק משותף של נפחים שונים במיקרוליטרים של ספריית a a V ושל וירוס עזר ENO. שני הנתיבים הראשונים מהווים דוגמאות טובות לתנאים המניבים ביטוי חלבון a a v בקושי ניתן לגילוי, מה שמעיד על זיהום והגברה מספיקים אך לא מופרזים של a a v, ומכך על הקישור הרצוי וההדוק בין הגנוטיפ לפנוטיפ. לפיכך, 0.11 או 10 מיקרוליטרים של עלים אלו שימשו להדבקה חוזרת של תאים רעננים.

התוצאות מה-western blot מוצגות בתאים מימין. ב-LA c בוצעה הדבקה עם a v לבדו כביקורת שלילית. כמו כן, קריטי לבחון את מגוון הספריה במהלך סבבי הדבקה חוזרים באמצעות ריצוף DNA.

תרשים זה מציג השוואות של רצפי חלבונים של שיבוטי AAV מספריית וקטורים המבוססת על AAV 2, 8 ו-9 לפני ואחרי סלקציה. הרצפים שמעל הקו האדום מראים את ה-AAV-ים ההוריים. חצים סגולים מצביעים על אירועי רקומבינציה הומולוגית. החץ האדום מסמן נקודת שחלוף (crossover) בין AAV 2 ל-AAV 9 שנצפתה בכל השיבוטים שנבחרו. לצורך סלקציה בבעלי חיים, ספריית ה-AAV מוחדרת לבעלי החיים, מבודלת מהתאים או מהרקמה המטרה באמצעות PCR, ולאחר מכן משובטת מחדש ונארזת מחדש לסבב הדבקה חדש.

מוצג כאן דוגמה להצלה של שיבוטי AAV שהודבקו בהצלחה מכבדי עכברים שבוע לאחר עירוי של ספרייה פריפריאלית. נתיב 1 מראה את הפס הצפוי בגודל 2.2 kilobase, בעוד שנתיב 2 הוא בקר ללא תבנית; גדלי פסי סמן ה-DNA בנתיב M מצוינים ב-kilobases. ללא קשר להליך הברירה, יש לתקף בסופו של דבר את וריאנט הקפסיד המועשר במערכות המתאימות.

דוגמה לביצועים עדיפים של AAV kymera בתאים בתרבית מוצגת כאן. צבעים כהים יותר מעידים על זיהומיות גבוהה יותר לכל מספר חלקיקים, ולכן לכל שיבט. AAV-DJ מציג ביצועים טובים יותר מאסופה של שמונה סוגי בר (wild types) טבעיים של AAV במגוון רחב של שורות תאים.

לבסוף, מוצג ניתוח של clone של AAV KYMERA שנבחר בכבד עכבר. AAV DN נבחר על תאי hepatoma תואמים ולאחר מכן שימש להפקה של וקטורים רקומביננטיים המבטאים lucid brace, כפי שמוצג בעכברים נציגים שלנו (שלושה לקבוצה) שבוע לאחר עירוי היקפי של מינונים שווים של וקטור זה או ביקורת המבוססת על AAV8 מסוג wild type, אחד הבידודים הטבעיים העוצמתיים ביותר הידועים בכבד עכבר. שימו לב שבעוד ש-clone ה-AAV DN נותן ביטוי כולל נמוך מעט יותר בכבד, הוא ספציפי יותר לאיבר זה כיוון שהוא מראה פחות off targeting באופן משמעותי ברקמות שאינן כבדיות לאחר שרמות הביטוי בכבד כוילו באמצעות תוכנת ההדמיה.

טכניקה זו יכולה להתבצע בתוך שבוע אחד, החל מהגברת הגנים של ה-V capsid ועד להשגת הספריה הויראלית, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור כי הפרוטוקול המסופק כאן נגזר מהניסיונות שלנו בבחירת סרוטיפים טבעיים של AV, וייתכן מאוד שחלק מהתנאים ידרשו התאמה וכוונון עדין כאשר משתמשים אחרים ייצרו ספריות מותאמות אישית משלהם. בנוסף להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרים, כגון תצוגת פפטידים מכוונת לאתר עם AGENESIS או רנדומיזציה מבוססת PCR, על מנת להפיק ספריות מגוונות מאוד או כדי לנסות ולשפר עוד יותר את תכונות הקפסידים שנוצרו והועשרו באמצעות DNA family shuffling לאחר פיתוחם.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום העברה של גנים באמצעות נגיפים לבחון אסטרטגיות טיפוליות למחלות ולתאי מטרה רלוונטיים שבהם סוגי AAV קונבנציונליים סיפקו תוצאות שאינן מספקות, כגון זיהום ב-HIV ותאי T, וכן לבחון העברה של גנים מבוססת וקטור לתאי גזע אנושיים ולתאים אחרים שקשה להדביק בתרבית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להנדס ולפתח ספריות מגוונות מאוד של וקטורים סינתטיים של נגיפי adeno associated virus באמצעות שילוב של פרגמנטציה והרכבה מחדש של גנים, וכן כיצד לבצע ברירה עקרונית של ספריות אלו בתאי תרבית או בבעלי חיים, במטרה להעשיר קפסידים בודדים בעל תכונות ספציפיות רצויות לשימוש כוקטורים להעברת גנים. זכרו כי עבודה עם adenovirus עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט באמצעי זהירות רבים בעת ביצוע פרוצדורה זו.