תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

מטרת ניסוי זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש במערכת תרבית של תאי עצבים ראשוניים כדי לחקור את השלב החבוי (latency) ואת ההפעלה מחדש של נגיף ההרפס סימפלקס. זאת על ידי בידוד ראשוני של נוירונים מהגנגליונים הצוואריים העליונים של עוברים מסוג RA, וגידול נוירונים שבודדו מגנגליונים שעברו דיסוציאציה, לאחר סילוק של תאים שאינם נוירונים. זיהום חבוי של HSV מוקם באמצעות נגיף EGFP להדבקת הנוירונים בנוכחות של מעכב רפליקציה ליטית.

השלב הבא הוא השראת רה-אקטיבציה (הפעלה מחדש) של התרביות הזרועות שהודבקו באופן לטנטי. לבסוף, יעילות הרה-אקטיבציה מוערכת על ידי ניטור ביטוי EGFP לאורך זמן. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות כיצד מסלולי איתות עצביים שונים מווסתים את הלטנטיות והרה-אקטיבציה של נגיף ההרפס סימפלקס באמצעות שימוש במעכבים כימיים, השתקה של RNA (RNA interference) והחדרת גנים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת מחקרים מפורטים של האינטראקציות המווסתות את הלטנציית של נגיף ההרפס סימפלקס בנוירון המארח ברמה המולקולרית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הלטנציית של נגיף ההרפס סימפלקס, כגון מהם האותות הפועלים כדי לדכא את הגנום הלטנטי וכיצד מופעלת הריאקטיבציה ברמה המולקולרית? בנוירונים, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי לטנציית של HSV-1.

ניתן ליישם זאת גם על וירוסים נוירוטרופיים אחרים ממשפחת alpha herpes. את הפרוצדורה ידגימו Marigo Kochi ו-Julian Kim, שניהם סטודנטים לתואר שני במעבדותינו. עבור פרוטוקול זה, נוירונים של הגנגליון הצווארי העליון (SCG) מבודלים מגורי חולדה ביום העוברי E 21, שהוצאו מרחמה של נקבת חולדה הרייה. בעבודה תחת מנדף נתיחה, יש להקריב כל גור על ידי כיוון המספריים לבסיס הצוואר, מעט מעל הכתפיים, וחיתוך הראש מהטורסו. כדי לחשוף את הגנגליונים, השתמשו במחטים במידה 23 gauge כדי לקבע את הראש, כאשר הצוואר פונה כלפי מעלה, בשלושה מיקומים.

ראשית, קבעו את חוט השדרה באמצעות סיכות. שנית, משכו את העור הקדמי מעל האף וקבעו אותו בסיכה, ושלישית, קבעו בסיכה את הוושט והקנה הרחק מאחורי הצוואר. חפשו את ה-SCG על ידי איתור נקודת הפיצול של העורק הקרוטידי.

עורק התרדמה הוא מבנה זוגי. ישנן שתי התפצלוּת על שני צידי הצוואר, ולפיכך שני s CGS לכל pop. ה-SCG ממוקם ממש מתחת לענף.

הפרידו את ה-SCG מהעורקים על ידי מתיחת הפיצול (bifurcation) בעזרת שני הקצוות. ה-SCG שקוף וחסר צבע בהשוואה לרקמת השומן הצהובה והאטומה שמקיפה את הפיצול. העבירו את הגנגליונים ל-12 milliliters של L 15.

מצע מועשר בגלוקוז בתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר על קרח. לאחר שכל ה-SCGs נאספים מהעוברים ונשלפים בעדינות, סובבו את הגנגליונים בצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 600 RPM, והסירו את עודפי המצע.

השעה את הגנגליונים ב-1 ml של מצע L 15 המכיל trypsin ו-collagenase. דגרי במשך 24 דקות ב-37 °C.

יש לערבב בכל שמונה דקות. לאחר מכן, הוסף 10 milliliters של מצע ים (sea media) כדי לבטל את השפעת ה-trypsin, וסבב בצנטריפוגה למשך דקה אחת. ב-600 RPM, הסר כמה שיותר ממצע ה-tryin collagenase, ושטוף את הגנגליונים עם 10 milliliters של מצע C (C media) על ידי סבב בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-600 RPM.

חזור על שטיפה זו פעם אחת. הסר את מדיום השטיפה ושחזר את הגנגליונים ב-1 mL של מדיום C כדי להפריד אותם באמצעות טריטורציה (tritrate), תוך שימוש במחט בקוטר 21 gauge המחוברת למזרק של 5 mL למשך מקסימום 15 מחזורי דחיפה ושאיבה. השלם את הטריטורציה באמצעות מחט בקוטר 23 gauge עד שמרבית הגושים יופרדו.

הסר גושים שנותרו של תאים על ידי סינון הנוירונים המופרדים דרך מסנן ניילון של 70 micron לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter. השב aliquot של 10 microliter מתליית התאים המסוננת, תערובת של triam blue, כדי לקבוע את מספר התאים החיים. ספור את מספר התאים שדוחים באופן פעיל את הצבע באמצעות hemo cytometer.

בשלב הבא, העבירו 5,000 עד 6,000 תאים חיים סה"כ ב-100 µL של מצע C לכל באער של פלטת תרבית רקמות בעלת 96 באערים, המצופה מראש בקולגן ובלמינין; יש לכלול 50 ng/mL של nerve growth factor במצע C. דגרו למשך לילה ב-37 °C. למחרת, ביום הראשון למשמרת חוץ גופית (DIV 1), בדקו את ההיצמדות התקינה של הנוירונים ואת הצמיחה של חלק מהבליטות האקסונליות.

החליפו את מצע C בבארים ב-50 µL של מצע neuro basal או NBM המכיל NGF Acho ו-five fluoro two doxy uridine. החליפו את המצע שורה אחר שורה כדי להבטיח שהתאים לא יתייבשו. דגרו את התרביות ב-37 °C למשך חמישה ימים.

יש לעקוב אחר התרבית מדי יום כדי לוודא את מות התאים שאינם נוירונים ואת צמיחת הנוירונים. כדי להתחיל חלק זה של הפרוטוקול ביום השישי לאחר הזריעה (in vitro), ודא שמרבית תאי התמיכה שאינם נוירונים חוסלו. חשוב ביותר לצמצם מניפולציות פיזיות מיותרות של הנוירונים בכל עת.

יש להסיר ולהחליף את המצע בעדינות רבה ובאיטיות, שכן מתח מכני שייווצר עלול להשפיע על חיוניות הנוירונים. הוסף aciclovir או CV למצע הקיים בכל באר עד לריכוז סופי של 100 micromolar. הוסף CV באיטיות ובעדינות כדי להבטיח שכוח מכני לא ישפיע לרעה על התאים ביום למחרת.

ביום השביעי לאחר הזריעה (DIV 7), הדביקו את תרביות ה-SCG ב-HSV 1 רקומביננטי המבטא רפורטר EGF המחובר לחלבון הליטי הווירוסלי US 11, בריבוי הדבקה (MOI) של בין 1 ל-2. הוסיפו את הווירוס המדולל ישירות למצע הגידול הקיים בבאר. כללו בקרת הדבקה דמה (mock infection) והדבקה ליטית.

ביקורת חיובית במצע ללא CV. יש להמתין להמשך ההדבקה במשך שעתיים עד שלוש בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, יש להחליף את מצע ההדבקה ב-NBM טרי המכיל NGF ו-CV. חשוב מאוד לפעול בעדינות רבה בעת החלפת מצע ההדבקה. יש להטות את הפלטה לכיוונך ולהסיר באיטיות את המצע מתחתית הבאר.

לאחר מכן, כוון את קצה הפ pipette אל דופן הבאר ולא אל תחתיתה, ואפשר למצע להחליק בעדינות על התאים. החלף את המצע בשורה אחת בכל פעם כדי למנוע מהתאים להתייבש. החזר את התרביות לאינקובטור, תוך טיפול עדין ככל האפשר כדי למנוע פגיעה ביכולתן לתמוך ב-HSV one latency.

יש לתחזק את התרביות במשך שישה ימים בטמפרטורה של 37 °C, שבמהלכם הווירוס יכונן לטנציה. במהלך תקופה זו, יש להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר את ביטויו של us 11 EGFP כאינדיקטור לרפליקציה ליטית.

כמצופה, לא אמור להיות ביטוי של GFP בביקורת הזיהום המדומה (mock). S 11 EGFP אמור להיות מזוהה רק בזיהום. בארות ביקורת חיובית ללא טיפול ב-CV מעידות על זיהום ראשוני מוצלח ושכפול ליטי פורה.

כדי להעריך את הפעוליות המחודשת ב-DIV 14, החלף בזהירות את ה-CV המכיל מדיום במדיום טרי ללא CV, כפי שבוצע קודם לכן. כוון את קצה הפ pipette לדופן הבאר ולא לתחתיתה, ואפשר למדיום להחליק בעדינות אל התאים במידת הצורך. הוסף משתנים פרמקולוגיים או ביולוגיים כגון LY 2 9 0 0 4 בריכוז 20 micromolar.

לא צריכה להידגם ביטוי של GFP בתרביות המודבקות באופן חבוי שטופלו ב-A CV. החזירו את התאים ל-37 degrees Celsius למשך תקופה של חמישה עד שישה ימים. עקבו אחר התרביות החיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות נוירונים העוברים ריאקטיבציה.

תדירות ההפעלה מחדש מחושבת על ידי ספירת מספר הבארות המכילות נוירונים חיוביים ל-EGFP והבעת נתון זה כפרופורציה ממספר הבארות הכולל של הדגימות. איור זה מדגים דוגמה שבה trigger statin, מעורר ידוע של הפעלה מחדש, מיושם על תרביות SCG שהודבקו בשלב מאוחר. ההפעלה מחדש נוטרה והוערכה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מדי יום לאחר הטיפול התרופתי למשך תקופה של חמישה ימים.

בשימוש ב-TSA, ההפעלה מחדש מגיעה ל-50% מהמקסימום תוך יומיים, ובתוך חמישה ימים, ההפעלה מחדש מגיעה ל-60% מהבסיס או מההפעלה מחדש הספונטנית המיוצגת על ידי ה-DMSO. תרביות ביקורת מטופלות בניסוי זה הן כ-10%, ובדרך כלל נעות בין 5% ל-20% בשימוש במערכת in vitro זו. בשלב מאוחר יותר, תרביות SCG נגועות טופלו גם ב-LY 2 9 0 0 4.

תרבויות של השראה ידועה להפעלה מחדש, שבה ההפעלה מחדש הושרית על ידי LY, הושוו לאלו שטופלו במעכב סינתזת ה-DNA הוויראלי, phospho, ללא חומצה אצטית, ואת שני התרכובות יחד כפי שמוצג כאן, ביטוי US 11 EGFP נפגע על ידי PAA בתרבויות שהושרו להפעלה מחדש עם LY 2 9 4 0 0 2, דבר המצביע על כך שביטוי US 11 EGFP תלוי בשכפול ה-DNA הוויראלי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להקפיד על טכניקה סטרילית ולטפל בתרבית ה-CG בעדינות רבה ככל האפשר כדי למנוע הגברה של הפעלה מחדש ספונטנית המושרית על ידי סטרס או תנועות מכניות. לאחר ביצוע הליך זה להקמת זיהומי HSV one חבויים בנורונים בתרבית, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון S-H-R-N-A, knockdown וביטוי אקטופי של גן wild type ושל מוטציה (gene loss) על מנת לאפיין תפקודים נורוניים המווסתים את החביון וההפעלה מחדש של HSV one.

זכרו כי HSV-1 הוא פתוגן אנושי הדורש אמצעי בטיחות ברמת PSL 2. עליכם להיות בקיאים בעבודה בתנאי PSL 2 לפני ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים תרביות SCG כדי ליצור זיהומי HSV-1 חבויים, וכיצד להשרות ביעילות ריאקטיבציה בנוירונים.