Name: Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: למדו שיטת Direct PCR לגנוטיפינג דגימות צמחים ובעלי חיים ללא טיהור DNA מראש. הטכניקה חוסכת זמן ומשאבים בתהליכי PCR ישירים מרקמות Arabidopsis ועכברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

לדגימות ארבידופסיס וprimers PCR המודאג אנו מודים פרוף Jaakko Kangasjärvi וקבוצתו, קבוצת לחץ הצמח, ביולוגית צמח, המחלקה לBiosciences, אוניברסיטת הלסינקי. הניסויים עם השיטה המסורתית שנערכו על ידי הגב &#39;Airi Lamminmäki. דגימות עכבר מהונדסות נמסרו על ידי ד&quot;ר יאנה Vesterinen, מכון לביו / ביוכימיה, אוניברסיטת הלסינקי. אריס Uni-Core ומאט חיתוך האריס הם סימנים מסחריים של Shunderson התקשורת בע&quot;מ כל הסימנים המסחריים האחרים הם הרכוש של תרם הפישר סיינטיפיק בע&quot;מ וחברות הבנות שלה.

<ol><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li>
<li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCAPS%2C+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms%3A+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li>
<li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li>
<li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li>
<li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li>
<li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li>
<li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory%22">Molecular Cloning: A Laboratory</a>. , 2nd ed, CSH Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li>
</ol>

הייצור והגישה חופשיה למאמר זה הוא בחסות תרם פישר סיינטיפיק, Inc

הגישה הישירה PCR הדגימה כאן מאפשרת להגברת PCR ישירות מכמויות קטנות של דגימות unpurified, צמצום הזמן הנדרש ולפשט את זרימת העבודה למפעל וgenotyping בעלי החיים (איור 7). הוכיח גם כאן הוא השימוש בפרוטוקול הדילול בשילוב עם הגישה הישירה PCR (איור 3). פרוטוקול הדילול מומלץ עם דגימות עלים קשות (למשל בגיל צמח, מיני צמחים המכילים תרכובות מפריעות) או עם amplicons הארוך (או GC-עשיר). פרוטוקול זה שימושי במיוחד כאשר מתחיל ניסוי חדש ישיר PCR, המאפשר אופטימיזציה של התגובה. הפרוטוקול יכול לשמש ככלי לטיפול בקשיים מזדמנים כגון תשואות מוצר נמוכות בשל הבדלים בחומר ברקמות ו / או פריימרים המשומשים. יתר על כן, בעת הרצת תגובות מרובות מאותו המדגם, שימוש בפרוטוקול הדילול מבטיח כל המדגם אינו נצרך באחדתגובה. כדי לטהר את ה-DNA מצמחים לPCR, הכנס היה לבצע תמוגה תא אחרי בידוד DNA תוך שימוש ברכיבים שונים שעלולים להפריע לניתוח PCR 8. לצמחים ובמיוחד מאתגרים עם תוכן פנוליות גבוה, תוספת של polyvinylpyrrolidone שמש באופן מסורתי כדי להסיר את התרכובות שנקשרות ל-DNA בעקבות תמוגה תא 2,5. כפי שניתן לראות כאן, ניתן להימנע מפעולות המסובכות האלה, זמן עתירות באמצעות שימוש בצמח Phire הישירה PCR הערכה לזיהוי DNA היעד. תמוגה תא וצעדי בידוד DNA ניתן להשמיט תוך שימוש בטכניקות dCAPS הרגישות ישירות מעלי צמח ארבידופסיס (איור 2). כפי שהודגם כאן, פרוטוקול דילול יעילות מנהל את הנוכחות של מרכיבים בעייתיים שיכול להפריע PCR (איור 3). באופן מסורתי, תנאי מוקדם לבעלי החיים genotyping היה isolatiעל של הדנ&quot;א הגנומי מרקמות בעלי חיים באמצעות תהליך רעיל, זמן רב המאופיינים בדגירה ארוכה עם proteinase K לעכל עור ורקמת חיבור, ואחרי חילוץ ממס אורגני, משקעי אלכוהול, וצעדי צנטריפוגה 6,9,10. כפי שהודגם כאן, פישוט תהליך זה מושג באמצעות שימוש בבעלי חי Phire רקמות הישירות PCR הקיט, המאפשר עכברים הטרנסגניים להיות genotyped ללא טיהור DNA לפני (איור 4). הדוגמא הראתה במאמר זה בעיקר מאתגרת כמו שרק סט אחד פריימר שמש להגברה של שני שברים עם הבדל בגודל גדול. למרות הקושי המולד של הפרוטוקול, שימוש בגישה הישירה PCR בשיתוף עם פרוטוקול הדילול פשוט הביא תשואות גבוהות של שני מוצרי PCR (איור 4). זיהוי DNA יעד PCR מבוסס יש יישומים רבים במחקר, כולל ניתוח גנוטיפ לזהותאת התפקידים של גנים בהתפתחות, פיזיולוגיה ומחלות. בשל סובלנות המעכב של polymerases דנ&quot;א המיוחד, את הפרוטוקולים ניתן להשלים בזמן מינימאלי ללא טיהור DNA מוקדמת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Phire צמח הישיר PCR Kit </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-130 </td><td> 200 תגובות (50 μl כל אחד) </td></tr><tr><td> Phire בעלי חי רקמות הישירה PCR Kit </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 μl כל אחד) </td></tr><tr><td> אריס Uni-Core 0.35 מ&quot;מ (ורוד) </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-180S / L </td><td> כמות: 5/25 </td></tr><tr><td> אריס Uni-Core 0.50 מ&quot;מ (כחול) </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-185S / L </td><td> כמות: 5/25 </td></tr><tr><td> אריס חיתוך Mat 6.4 × 7.6 סנטימטר </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-190 </td><td> כמות: 5 </td></tr><tr><td> SSPI </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> ER0771 </td><td> 100 μl (100 תגובות) </td></tr><tr><td> Piko Cycler 24 ובכן התרמית </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות PCR Piko 24 Well </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR ערכת טיהור </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preps 250 preps </td></tr></tbody></table>

genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור dna לפני

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

הגישה הישירה PCR מאפשרת הגברת PCR ישירות מכמויות קטנות של דגימות unpurified, והוא הוכיח כאן לכמה צמח ורקמות של חיות (איור 1). הישיר PCR מבוסס על הונדס במיוחד Thermo Scientific polymerases DNA Phire Phusion ו, הכולל תחום מחייב גדילי הדנ&quot;א כפול שנותן להם תכונות ייחודיות כגון סובלנות גבוהה של מעכבים. זיהוי DNA יעד PCR מבוסס יש יישומים רבים במחקר במפעל, כולל ניתוח ובדיקה של transgenes גנוטיפ צמח. PCR מרקמות צמח באופן מסורתי כרוך שלב ראשוני DNA בידוד, שעשוי לדרוש ריאגנטים יקרים או רעילים. התהליך דורש זמן ומגביר את הסיכון לזיהום צולב 1, 2. לעומת זאת, על ידי שימוש Thermo Scientific Phire צמח ישיר PCR ערכת DNA היעד ניתן לאתר בקלות, ללא מיצוי DNA מוקדם. במודל הפגין כאן,דוגמה לניתוח שנגזר בקע מוגבר רב צורות רצף (dCAPS) 3,4 מתבצעת ישירות מעלי הצמח ארבידופסיס. מבחני dCAPS genotyping יכולים לשמש לזיהוי פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) על ידי עיכול SNP אלל ספציפי הגבלת endonuclease 3. כמה דוגמאות צמחים נוטות להיות מאתגר יותר בעת שימוש בשיטות PCR ישירות כפי שהם מכילים רכיבים שמפריעים לPCR, כמו תרכובות פנוליות. במקרים אלה, צעד נוסף כדי להסיר את התרכובות נדרש 2,5 באופן מסורתי. כאן, בעיה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש בפרוטוקול דילול קל ומהיר ואחרי הגברת PCR ישירה (איור 1). חמש העשרה אלון בן משמשים כמודל עבור צמחים מאתגרים, כדגם מכיל כמויות גבוהות של תרכובות פנוליות כוללים טאנינים. העברת גנים לעכברים משמשת באופן נרחב כדי ללמוד את התפקידים של גנים בdevelopment, פיזיולוגיה ומחלות של בני אדם. השימוש בבעלי החיים אלה מחייב בדיקות לנוכחות של transgene, בדרך כלל עם ה-PCR. באופן מסורתי, זה כרוך בצעד זמן רב DNA בידוד, שבמהלכו DNA לניתוח PCR מטוהר מרקמות אוזן, זנב או בוהן 6,7. עם זאת, עם עכברי Thermo Scientific Phire בעלי חי הרקמות הישירות PCR Kit המהונדסים ניתן genotyped ללא טיהור DNA מוקדמת. בפרוטוקול המהונדס העכבר genotyping זה הושג ישירות מרקמות אוזן עכבר, כפי שמודגם כאן לדוגמה מאתגרת שבו רק סט אחד פריימר משמש להגברה של שני שברים שונים מאוד בגודלו.

הגישה הישירה PCR מוצגת כאן מאפשרת הגברת PCR ישירות מכמויות קטנות של צמח unpurified ורקמות בעלי חיים.

Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני

גישת ה-PCR הישיר מאפשרת הגברה של PCR ישירות מכמויות קטנות של דגימות שאינן מנוקות, והיא מוצגת כאן עבור מספר צמחים ו...

המטרה הכללית של סרטון זה היא להדגים שלו דוגמאות של הגברה באמצעות PCR ישירות מכמויות קטנות של דגימות שאינן מטוהרות, כולל רקמות צמחים ובעלי חיים. ניתן לבצע PCR ישיר באמצעות שני פרוטוקולים חלופיים. בפרוטוקול הישיר, כמות מזערית של דגימה שאינה מטוהרת מתווספת ישירות לתגובת ה-PCR, בעוד שפרוטוקול הדילול דורש שלב קצר של דגירה מוקדמת לפני ה-PCR לשחרור ה-DNA מחומר הדגימה.בדוגמה הראשונה, ביצוע גנוטיפינג של arabidopsis מושג באמצעות הפרוטוקול הישיר. אתר הגבלה ספציפי לאלל מוכנס לתוך ה-DNA מטרה, ולאחר מכן מזוהים פולימורפיזמים של נוקלאוטיד בודד (SNPs) ספציפיים לאלל בעקבות עיכול באמצעות אנדונוקליאז הגבלה. לאחר מכן, נעשה שימוש בפרוטוקול הדילול תחילה כדי להגביר מקטעי DNA ספציפיים מעלי אלון בני 15 שנה, ולאחר מכן כדי לבצע גנוטיפינג לעכברים טרנסגניים ישירות מרקמת אוזן של עכבר.בכל שלושת הדוגמאות, הגברת ה-DNA מושגת ללא שלבי טיהור של הדגימה לפני ה-PCR, וזאת באמצעות שיטת ה-direct PCR. היתרון העיקרי של direct PCR על פני השיטות המסורתיות הוא שאין צורך בשלבי מיצוי או טיהור של ה-DNA. דבר זה מתרגם לחיסכון הן בזמן והן בהוצאות.התחילו את בדיקת הגנוטיפינג מסוג dCAPS (derived cleaved, amplified polymorphic sequence) תחילה על ידי הכנת תגובות PCR בנפח של 20 או 50 µL באמצעות ערכת plant direct PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, גזרו דגימה בקוטר 0.50 mm מעלה של צמח Arabidopsis באמצעות Harris Uni unicorn ומשטח חיתוך, תוך כדי החזקה חזקה של המחורר. לחצו את קצה החיתוך אל תוך הרקמה וסובבו את המחורר קדימה ואחורה.לחץ על הבוכנה כדי להשליך את דיסקיות הדגימה אל תוך תערובת ריאקציית PCR. ודא שהדגימה נופלת אל תוך תמיסת ה-PCR ואינה נדבקת לדפנות. כדי למנוע זיהום צולב בפרוטוקול הישיר, קריטי להשתמש בשיטה הנכונה לניקוי כלי הדגימה.נקה את קצה החיתוך של המחורר בין דגימה לדגימה על ידי טבילה שלו בתמיסת sodium hypochlorite בריכוז 2%. לחץ את הבוכנה למעלה ולמטה מספר פעמים ונגב את קצה החיתוך בעזרת מגבת נייר נקייה. יש לשטוף גם את משטח החיתוך בין הדגימות.בשלב הבא, השתמש במכשיר תרמו-סייקלר (thermal cycler) בעל 24 בארות ובפלטת PCR כדי לבצע את תגובות ה-PCR בהתאם לתנאי המחזור המתוארים בטקסט הנלווה לסרטון זה. לאחר ה-PCR, סבב את חומר הצמח בצנטריפוגה. העבר 5 µL מהנוזל העליון (supernatant) למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה לאחר הוספה של 4 µL מים. הוסף 1 µL של אנזים הגבלה (restriction endonuclease) SSP1, ערבב בעדינות וסבב קצר בצנטריפוגה כדי לרכז את התוכן בתחתית המבחנה.דגרו את תערובת התגובה למשך שעה אחת ב-37 °C. לאחר מכן, בטלו את פעילות אנזים ההגבלה על ידי דגירה ב-65 °C למשך 20 דקות. לאחר עיכול אנזים ההגבלה, הוסיפו 2.5 µL של loading buffer בריכוז five x לתגובה.בצעו אלקטרופורזה של ג'ל Agarose כדי לנתח את הפרגמנטים שהתקבלו, על ידי טעינה של 10 µL מהתערובת שהתקבלה לתוך באר הג'ל. ראשית, גזרו דגימה קטנה (punch) של 2 mm מעלה אלון. הניחו את הדגימה לתוך 20 µL של תמיסת דילול (dilution buffer) המסופקת עם ערכת ה-plant direct PCR.נקה את קצה החיתוך של משטח הניקוב והחיתוך כפי שבוצע קודם לכן, רסק את דגימת העלה באמצעות טיפ של פיפט של 100 µL על ידי לחיצה קצרה נגד דופן המבחנה. סבב את הדגימות לזמן קצר במבחנת מיקרו-צנטריפוגה עד שהתגובות יגיעו לתחתית המבחנות. ניתן להשתמש בנוזל העליון (supernatant) ישירות ב-PCR או לדללו ביחס של 1:10 או 1:100 במים סטריליים.בהתאם לסוג הדגימה, השתמש ב-0.5 µL עד 1 µL מהסופרנאט או מהדילול כתבנית לתגובת PCR בנפח של 20 µL. הכן את התגובות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הכנת התגובות, השתמש במכשיר ה-PCR (thermal cycler) מדגם PICO בעל 24 בארות ובפלטת PCR כדי לבצע את תגובות ה-PCR, בהתאם לתנאי המחזור המתוארים בטקסט.לאחר ה-PCR, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של loading buffer בריכוז five x לתגובה ובצעו אלקטרופורזה של ג'ל עם 15 מיקרוליטרים מהתערובת שהתקבלה. התחילו את פרוטוקול הדילול לגינוטיפיקציה של עכברים טרנסגניים על ידי הנחת punch של 2 מ"מ של רקמת אוזן עכבר ב-20 מיקרוליטרים של dilution buffer המכיל 0.5 מיקרוליטרים של DNA release additive שסופק עם רקמת בעל החיים. דגרו את הדגימות של ערכת ה-Direct PCR בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, ולאחריהן דגירה של שתי דקות ב-98 degrees Celsius.לאחר צנטריפוגציה של הדגימות, השתמשו ב-1 µL מהעליילי (supernatant) כתבנית לתגובת PCR בנפח של 20 µL. ניתן להעביר כל עליילי שאינו מיועד לשימוש מיידי למבחנה חדשה ולאחסנו בטמפרטורה של 20- °C. כשלב סופי, השתמשו בטרמוסייקלר (thermal cycler) ובפלטת PCR בעלת 24 בארות לביצוע תגובות ה-PCR לפי תנאי המחזור המפורטים בפרוטוקול הכתוב. לאחר ה-PCR, הוסיפו 5 µL של loading buffer בריכוז 5x לתגובה, ובצעו אלקטרופורזה של ג'ל agarose עם 15 µL מהתערובת שהתקבלה בטכניקת D caps. אתר ההכרזה בתוך ה-SNP המדובר מוכנס או מושמד באמצעות פריימר PCR עם אי-התאמה (mismatch) אחת או יותר לסביבת ה-DNA של היעד.בדוגמה זו, מוצרי PCR בני 160 זוגות בסיסים המכילים את אתר ה-SNP המבוקש g או a בגנום של arabidopsis הוגברו מדגימות של חורי עלה של צמחים באמצעות ערכת fire plant direct PCR. הפריימר הקדמי הכיל אי-התאמה אחת בקצה ה-3', אשר יצרה אתר הגבלה ספציפי ל-SspI ב-DNA המטרה, שהיה קיים באלל A אך לא באלל השני של ה-SNP. מוצרי ה-PCR שלא עברו טיהור עוכרו עם אנזים ההבליה SspI, והפרגמנטים שהתקבלו נותחו על ג'ל agarose; נתיבים g ו-a תואמים לאללי ה-SNP של כל דגימה.בתמונה זו, תוצרי ה-PCR השלמים מופיעים משמאל והמקטעים שעברו עיכול מופיעים מימין. פרוטוקולי דילול נחוצים עבור חומר צמחי מאתגר, כגון עלה אלון, בשל ריכוזו הגבוה של תרכובות פנוליות, תוך שימוש בפרוטוקול הדילול המתואר כאן. מקטע של 297 base pair של DNA כלורופלסטי הועשיר באמצעות פרוטוקול בעל שלושה שלבים.דגימות של עלי אלון בריכוזים שונים מוצגות בנוסף לבקרות חיוביות ושליליות. ערכת ה-PCR הישירה לרקמת בעלי חיים שימשה להגברה של שני מקטעים בעלי הפרש גודל משמעותי באמצעות סט פריימרים אחד בלבד, והביאה לתשואות גבוהות של שני המוצרים בגודל הנכון: 1500 base pairs עבור עכברים טרנסגניים ו-200 base pairs עבור עכברים מסוג בר (wild type). הפס העליון החלש יותר בעכברים הטרוזיגוטים נובע מתחרות בין שני התבניות על אותו קישור פריימר.עם זאת, תוצאות הגנוטיפיקה אינן מעומעמות. נבדקה גם היציבות של הדגימות שהוכנו באמצעות פרוטוקול הדילול. התוצאות מראות כי דגימות מדוללות שהוכפפו למספר מחזורי הקפאה והפשרה, ודגימות שנשמרו בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius למשך שנה אחת לפחות, היו דומות לדגימות ששימשו מיד ל-PCR. כדי לבחון עוד יותר את ביצועיו של הליך זה, הוגברו ארבעה Amplicons מרקמות אוזן של עכברים באמצעות פרוטוקול הדילול של ערכת fire animal tissue direct PCR.להשוואה, DNA טוהר תחילה באמצעות ערכה מסחרית למיצוי DNA, ואותם מקטעים הוגברו באמצעות hot start tac DNA polymerase בהתאם להמלצות היצרן. רק באמצעות ערכת fire animal tissue direct PCR כל ארבעת האמפליקונים הוגברו בהצלחה. Direct PCR שימושי במיוחד במחקרי גנוטיפיקה הדורשים הגברה של מספר רב של דגימות. דילוג על שלב טהרת ה-DNA יכול להפחית משמעותית את הזמן הנדרש לביצוע הניסוי. הטכניקה מספקת יתרונות נוספים על ידי הפחתת הסיכון לזיהום וחיסכון בחומר דגימה יקר ערך.

genotyping-of-plant-and-animal-samples-without-prior-dna-purification

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים גישה דגימה פולשנית ביעילות לאסוף דגימות שיער של יונקים קטנים חמקמק, כפי שמוצג על pika האמריקאי. אנו מדגימים את השירות של שיטה זו על ידי מיצוי דנ"א של השיער שנדגמו הגברה מספר סוגים של סמנים מולקולריים נפוץ לימודי האקולוגיה ושימור חיות בר.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

מאמר זה מתאר מיצוי DNA מקליפס זנב של דג זברה. הפרוטוקול מדגים שיטה מהירה ויעילה לניתוח גנוטיפים של דגי זברה.

מיצוי DNA מקליפ זנב: שיטה המשמשת בגנוטיפ של דגי זברה

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

מתוארת כאן שיטה למיצוי, טיהור ובקרת איכות של DNA גנומי מהפתוגן הפטרייתי הביוטרופי המחייב, טחב אבקתי, לשימוש בריצוף גנום לקריאה ארוכה.

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

ההשוואה ואופטימיזציה של שתי שיטות העשרה DNA DNA organellar צמח מוצגים: צנטריפוגה ההפרש הדיפרנציאלי ואת החלוקה של gDNA הכולל מבוסס על מצב מתילציה. אנו מעריכים את כמות הדנ"א וכתוצאה מכך, מדגימים ביצועים ברצף של הדור הבא, וקוראים את הפוטנציאל לשימוש ברצף המולקולה החד-פעמית.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

באמצעות pBIBAC-GW וקטור בינארי הופך ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד ללא פגע, תהליך קל ופשוט. . הנה, סדרה של פרוטוקולים מוצג מדריך את הקורא לאורך התהליך הטרנסגניים תודרנית מפעלים לייצור, ובדיקות את הצמחים על intactness, להעתיק מספר התוספות.

ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש שילוב של חישובית ומחקר ספסל למצוא רצפי חדשניים אשר לא ניתן להפריד בקלות בין רצף טיהור משותף, אשר עשוי להיות מוכר באופן חלקי בלבד.

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בטכנולוגיית ברקוד DNA לאימות חומרים רפואיים מבוססי צמחים, ואת צמח המרפא Angelica sinensis (אוליב). דילס זוהה כדוגמה.

יישום ברקוד DNA לזיהוי צמחי מרפא

למדו שיטת Direct PCR לגנוטיפינג דגימות צמחים ובעלי חיים ללא טיהור DNA מראש. הטכניקה חוסכת זמן ומשאבים בתהליכי PCR ישירים מרקמות Arabidopsis ועכברים.

Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני

גלה סרטונים נוספים