Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים שלוש דוגמאות להגברת PCR ישירות מכמויות קטנות של דגימות לא מטוהרות, כולל רקמות צמחים ובעלי חיים. ניתן לבצע PCR ישיר באמצעות שני פרוטוקולים חלופיים. בפרוטוקול הישיר, כמות זעירה של דגימה לא מטוהרת מתווספת ישירות לתגובת ה-PCR, בעוד שפרוטוקול הדילול דורש שלב קצר לפני הדגירה לפני ה-PCR כדי לשחרר DNA מחומר הדגימה.

בדוגמה הראשונה, גנוטיפ של ארבידופסיס מושג באמצעות הפרוטוקול הישיר. אתר הגבלה ספציפי לאלל מוכנס ל-DNA המטרה, ולאחר מכן מזוהים פולימורפיזמים ספציפיים לנוקלאוטידים בודדים של אלל בעקבות עיכול אנדונוקלאז הגבלה. לאחר מכן, פרוטוקול הדילול משמש תחילה כדי להגביר מקטעי DNA ספציפיים מעלי אלון בני 15 שנה, ולאחר מכן לגנוטיפ עכברים טרנסגניים ישירות מרקמת אוזן העכבר.

בכל שלוש הדוגמאות, הגברת ה-DNA מושגת ללא כל שלבי טיהור דגימה לפני PCR בשיטת ה-PCR הישיר. היתרון העיקרי של PCR ישיר על פני השיטות המסורתיות הוא שאין צורך בשלבי מיצוי או טיהור DNA. זה מתורגם לחיסכון בזמן ובהוצאות.

התחל את ניתוח הרצף הפולימורפי הנגזר המוגבר או בדיקת הגנוטיפ על ידי ניסוח תחילה של תגובות PCR של 20 או 50 מיקרוליטר באמצעות ערכת ה-PCR הישירה של הצמח כמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, חותכים אגרוף של 0.50 מילימטר מעלה צמח Arabidopsis באמצעות חד הקרן ומחצלת החיתוך של Harris Uni, ומחזיקים את האגרוף בחוזקה. לחץ את קצה החיתוך לתוך הרקמה וסובב את האגרוף קדימה ואחורה.

לחץ על הבוכנה כדי להוציא את דיסק האגרוף לתערובת תגובת PCR. ודא שהדגימה נופלת לתמיסת ה-PCR ואינה נדבקת לשני הקירות. כדי למנוע זיהום צולב בפרוטוקול הישיר, חשוב להשתמש בשיטה הנכונה לניקוי כלי הדגימה.

נקה את קצה החיתוך של האגרוף בין כל דגימה על ידי טבילתו בתמיסת נתרן היפוכלוריט של 2%. לחץ על הבוכנה למעלה ולמטה כמה פעמים ונגב את קצה החיתוך במגבת נייר נקייה. יש לשטוף את שטיח החיתוך גם בין הדגימות.

לאחר מכן, השתמש במחזור תרמי של Pico 24 באר וצלחת PCR כדי לבצע את תגובות ה-PCR תוך שימוש בתנאי הרכיבה המתוארים בטקסט הנלווה לסרטון זה לאחר PCR, סובב את החומר הצמחי. העבירו חמישה מיקרוליטרים של הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש לאחר מהדורה של ארבעה מיקרוליטר מים. הוסף מיקרוליטר אחד של אנדונוקלאז ההגבלה SSP תערובת אחת בעדינות ובקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור.

דגרו על תערובת התגובה למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השביתו את אנזים ההגבלה על ידי דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר עיכול אנזים הגבלה, הוסף 2.5 מיקרוליטר של מאגר טעינה פי חמישה לתגובה.

בצע אלקטרופורזה של ג'ל ארוס כדי לנתח את השברים המתקבלים על ידי העמסת 10 מיקרוליטר מהתערובת המתקבלת לג'ל. ובכן, כדי להתחיל, חותכים אגרוף של שני מילימטר של עלה אלון. הנח את הדגימה לתוך 20 מיקרוליטר של מאגר דילול המסופק עם ערכת ה-PCR הישירה של הצמח.

נקה את קצה החיתוך של הפנצ'ר ומחצלת החיתוך כמו קודם, מועך את דגימת העלה עם קצה פיפטה של 100 מיקרוליטר על ידי לחיצה קצרה על דופן הצינור. סובב את הדגימות לזמן קצר בצינור מיקרו צנטריפוגה עד שהתגובות נמצאות בתחתית הצינורות. ניתן להשתמש בסופרנטנט ישירות ב-PCR או לדלל אותו אחד עד 10 או אחד עד 100 במים סטריליים.

בהתאם לסוג המדגם, השתמש ב-0.5 מיקרוליטר למיקרוליטר אחד של הסופרנטנט או דילול כתבנית לתגובת PCR של 20 מיקרוליטר. הגדר את התגובות כמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הכנת התגובות, השתמש במחזור התרמי PICO 24 ובצלחת ה-PCR כדי לבצע את תגובות ה-PCR תוך שימוש בתנאי הרכיבה המתוארים בטקסט.

לאחר PCR, הוסף לתגובה חמישה מיקרוליטרים של מאגר טעינה של חמישה x ובצע אלקטרופורזה של ג'ל ארוס עם 15 מיקרוליטר מהתערובת המתקבלת. התחל את פרוטוקול הדילול לגנוטיפ של עכברים טרנסגניים על ידי הנחת אגרוף של שני מילימטר של רקמת אוזן עכבר ב-20 מיקרוליטר של מאגר דילול המכיל 0.5 מיקרוליטר של תוסף שחרור DNA המסופק עם רקמת החיה. ערכת PCR ישירה דוגרת את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, ולאחר מכן דגירה של שתי דקות ב-98 מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה של הדגימות, השתמש במיקרוליטר אחד של סופרנטנט כתבנית לתגובת PCR של 20 מיקרוליטר. ניתן להעביר כל סופרנטנט שאין להשתמש בו מיד לצינור חדש ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס כשלב אחרון, המחזור התרמי 24 בארות וצלחת ה-PCR משמשים לביצוע תגובות ה-PCR תוך שימוש בתנאי הרכיבה המפורטים בנוהל הכתוב לאחר PCR, הוסף חמישה מיקרוליטר של חמישה x מאגר טעינה לתגובה ובצע אלקטרופורזה של ג'ל ארוס עם 15 מיקרוליטר של המתקבלת תערובת בטכניקת כובעי D. אתר ההגבלה בתוך חיתוך העניין מוצג או מושמד באמצעות פריימר PCR עם אי התאמה אחת או יותר ל-DNA המטרה.

בדוגמה זו, 160 זוג הבסיסים של מוצרי PCR המכילים את אתר החיתוך המעניין g או אלל בגנום ה-arabidopsis הוגברו מאגרופי עלי צמח עם ערכת ה-PCR הישירה של צמח האש. הפריימר הקדמי הכיל אי התאמה אחת בשלושת הקצוות הראשוניים שיצרו SS P אתר הגבלה ספציפי אחד ב-DNA המטרה, שכלל את האלל A אך לא באלל השני של החיתוך. מוצרי ה-PCR הלא מטוהרים עוכלו עם אנזים הגבלה אחד SS P, וכתוצאה מכך נותחו שברים על ג'ל ג'ל g ותואמים לאללים של הצליפה של כל דגימה.

בתמונה זו, תוצרי ה-PCR השלמים נמצאים משמאל והשברים המעוכלים מימין. פרוטוקולי דילול נחוצים לאתגר חומר צמחי כמו עלה האלון בשל הריכוז הגבוה של תרכובות פנוליות באמצעות פרוטוקול הדילול המתואר כאן. שבר 297 זוגות הבסיסים של DNA כלורו פלסטי הוגבר בפרוטוקול בן שלושה שלבים.

דגימות עלי אלון עם דילול שונה מוצגות בנוסף לבקרות חיוביות ושליליות. ערכת ה-PCR הישירה של רקמת חיות האש שימשה להגברה של שני שברים עם הפרש גודל גדול באמצעות סט פריימר אחד בלבד והביאה לתפוקות בשפע של שני מוצרים בגודל נכון של 1500 זוגות בסיסים לעכברים טרנסגניים ו-200 זוגות בסיסים לעכברים מסוג בר. הרצועה העליונה החלשה יותר עם עכברים הטרוזיגוטיים נובעת מהתחרות של שתי התבניות על אותו תיקון פריימר.

עם זאת, תוצאות הגנוטיפ אינן חד משמעיות. כמו כן נבדקה יציבות הדגימות שהוכנו באמצעות פרוטוקול הדילול. התוצאות מראות כי דגימות מדוללות שעברו מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים בהקפאה וכאלה שאוחסנו במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך שנה לפחות היו דומות לדגימות ששימשו מיד ל-PCR כדי לבחון עוד יותר את ביצועי הליך זה, הוגברו ארבעה אמפליקונים מרקמות אוזניים של עכבר באמצעות פרוטוקול הדילול של ערכת ה-PCR הישירה של רקמת חיות האש.

לשם השוואה, ה-DNA טוהר לראשונה באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית ואותם שברים הוגברו באמצעות התחלה חמה של DNA פולימראז על פי המלצות היצרן רק עם ערכת ה-PCR הישירה של רקמת בעלי חיים אש כל ארבעת האמפליקונים הוגברו בהצלחה Direct PCR שימושי במיוחד במחקרי גנוטיפ הדורשים הגברה של מספר רב של דגימות. דילוג על שלב טיהור ה-DNA יכול להפחית משמעותית את הזמן הדרוש לביצוע הניסוי. הטכניקה מספקת יתרונות נוספים על ידי הפחתת הסיכון לזיהום וחיסכון בחומר דגימה יקר ערך.