הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגלות אינטראקציות חלבון חוץ-תאיות חדשות המעורבות בתהליכי זיהוי תאים, בפרט חלבוני קולטן משובצים בממברנה. גישת AveXis נועדה לעקוף את זיקות האינטראקציה החלשות מאוד המאפיינות סוג זה של אינטראקציות חלבון ואת העובדה שקשה לתמרן חלבוני ממברנה מבחינה ביוכימית. זה מושג על ידי הרכבת ספריית חלבונים רקומביננטית של האזורים החוץ-תאיים של קולטני פני התא.

זה מושג על ידי תכנון פלסמידים לביטוי כדי לייצר את אזורי תחום האקטו של הקולטנים כשברים מסיסים כמו גם פיתיונות ביוטיניליים מונומריים וגם שבחים מתויגים של אנזים פנטמר. השלב השני הוא לבטא ולנרמל את החלבונים כדי שיהיו מוכנים לבדיקת אינטראקציה. כל החלבונים מיוצרים בתאי יונקים כדי להבטיח הוספת שינויים לאחר התרגום כגון דיס, סולפיד, קשרים וגליקוזילציה.

שלב מכריע בפרוטוקול הוא להבטיח שחלבוני הפיתיון והטרף בתוך הספרייה מנורמלים כולם לרמות הסף. לאחר מכן מגיע החלק המרגש, סינון אינטראקציות חדשות. בני משפחת בייטס מסודרים לבארות בודדות של לוחית מיקרוט ולאחר מכן בודקים אינטראקציות באמצעות השבח.

ואז מבוצע שלב כביסה. השלב האחרון הוא להוסיף את המצע לאנזים כדי לזהות כל שבח שנלכד על מערכי חלבוני הפיתיון. בסופו של דבר, התוצאות של מסך VEX יכולות להראות אילו קולטנים של גולשי תאים מסוגלים ליצור שותפים קושרים ולכן עשויים להיות מעורבים בתהליכי זיהוי ותקשורת בין תאים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות מיצוי חלבון פופולריות, כגון שני טיהורים היברידיים או ביוכימיים של שמרים, הוא שהיא תוכננה במיוחד לאיתור אינטראקציות חלבון חוץ-תאיות. זה מתאים במיוחד לגילוי אינטראקציות חדשות בין חלבוני קולטן קשורים לממברנה. קשה לזהות אינטראקציות אלה באמצעות טכניקות אחרות מכיוון שחלבוני הממברנה קשים למניפולציה ביוכימית ואינטראקציות הקולטן הנגדי האופייניות שלהם חלשות ביותר.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לאופן שבו תאים מזהים ומתקשרים זה עם זה. ברמה המולקולרית, ניתן להשתמש בו כדי לענות על שאלות הנוגעות לתהליכים ביולוגיים בסיסיים כגון אילו חלבוני קולטן המוצגים על פני הביציות והזרע שילבו זה את זה, או אילו אינטראקציות ליגנד קולטן אחראיות להתנהגויות תאיות כגון היתוך מיוציטים או היווצרות פסגה עצבית. האתגר העיקרי בגישה זו הוא להרכיב את ספריות החלבון של הפיתיון ולהתפלל שבתוכם ניתן לסנן אינטראקציות.

כמו כן, חשוב מאוד לוודא כי חלבוני הפיתיון והטרף מנורמלים ברמות הסף הנדרשות לבדיקה. זה מצמצם את התדירות של שלילי כוזב וחיובי כוזב. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה במהלך הדוקטורט שלי כאשר ניסיתי לזהות שותף מקשר לחלבון פני התא CD 200.

בעיקרו של דבר, שאלתי את השאלה, מהו דפוס הקישור לקולטן פני התא הספציפי הזה? גם היום? זו עדיין שאלה שקשה לענות עליה מבחינה טכנית באותה תקופה, עם זאת, הגנום האנושי היה קרוב להשלמה והבנתי שמכיוון שכעת יש לנו רשימה מלאה של כל הקולטנים על פני התא בגנום, אנו יכולים כעת לשאול בתוך קבוצה זו של חלבוני קולטנים שיכולים לקיים אינטראקציה טכנית.

זו שאלה הרבה יותר קלה לתשובה, ו-AveXis הייתה השיטה שפיתחנו כדי לענות עליה. לאחר שהוקמה ספרייה של פיתיון ווקטורי טרום ביטוי, התכוננו להעביר אותם לתאי HEC 2 9 3 E התחילו בזריעת התאים יום לפני הטרנספקציה בצפיפות של 250,000 תאים למיליליטר ב-50 מיליליטר של מדיה בסגנון חופשי 2 9 3 כדי להבטיח התרוממות ביוטין יעילה. השלם את המדיום המשמש לייצור חלבוני פיתיון, לא חלבוני טרף עם d ביוטין עם כל הצלחות המוכנות, דגר על התאים למשך הלילה בתנאים סטנדרטיים.

מכיוון שלביוטין יש מסיסות נמוכה ותמיסה מדויקת, אנו מעדיפים לשקול את הביוטין הנוסף ואז להוסיף לחומר ולנער במרץ למחרת. העבירו 50 מיליליטר של תאים מתורבתים עם 25 מיקרוגרם של הפיתיון או פלסמיד הטרף באמצעות מגיב טרנספקציה מתאים לייצור פיתיונות ביוטיניליים לעריסה טרנספקט. מבנה הפיתיון ביחס של 10 לאחד עם פלסמידים המקודדים צורה מופרשת של חלבון ELI ביוטין ליגאז לכל קציר.

התרביות חמישה ימים לאחר הטרנספקציה על ידי חיוורון התאים על ידי צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 3000 למשך 20 דקות ושנית סינון הסופרנטנט S דרך מסנן של 0.22 מיקרון. אחד המאפיינים המרכזיים של AveXis הוא מכיוון שחלבונים רקומביננטיים מופרשים, ניתן לדלל אותם או לרכז אותם עד לפעילויות סף. מצאנו שלחלבונים רקומביננטיים יש ביטוי משתנה עד ארבעה סדרי גודל, כך ששלב הנורמליזציה מפחית את התרחשותן של תוצאות חיוביות כוזבות במהלך שלבי הסינון.

כדי להתחיל בנורמליזציה של הפיתיון, יש להסיר את הביוטין הלא מצומד מהמדיה על ידי דיאליזה מכיוון שהוא יתחרה על חלבון הפיתיון הביוטיני על קשירה לסטרפט באתרי קשירה החל באבטחת הפיתיון בצינור דיאליזה. כדי להבטיח דיאליזה יעילה של החלבונים הרקומביננטיים, מצאנו שחשוב לספק שטח פנים עודף לצינורות הדיאליזה. בדרך כלל, אנו מספקים פי שניים עד שלושה יותר צינורות ממה שנדרש בפועל עבור הנפח העובר דיאליזה.

במשך תקופה של 24 שעות, דיאליזה של הפיתיון באופן נרחב כנגד מאגר מתאים כגון PBS לאחר ביצוע דיאליזה. אלייזה מתחילה בחסימת הבארות של לוחית מיקרוט מקודדת סטרפטוקוקוס עם PBST המכיל BSA למשך 15 דקות. בינתיים, בצלחת נקייה, הכינו סדרה של ארבעה דילול אחד עד שלושה של חלבוני הפיתיון ב-PBST עם 2% BSA.

לאחר הדגירה של 15 דקות, העבירו את הדילול לצלחת המקודדת STTR ודגרו את הצלחת למשך שעה של טמפרטורת החדר לאחר שעה, שטפו את הבארות ואז לכל אחת מהן, הוסיפו היטב 100 מיקרוליטר של שני מיקרוגרם למיליליטר OX 68. דוגרים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה נוספת. לאחר הדגירה השנייה, בצע סדרת שטיפה נוספת והעמיס את הצלחת בפוספטאז אלקליין אנטי אמריקאי.

דגרו את הצלחת למשך שעה שלישית בטמפרטורת החדר. כעת שטפו את הצלחת שלוש פעמים ב- PBST ותנו לה PBS כביסה סופית. כדי להסיר כל חומר ניקוי שנותר, הוסף 100 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למצע מיליליטר 1 0 4 במאגר אמין אתנול לאחר שעה.

בטמפרטורת החדר נמדדה ספיגה של 4 0 5 ננומטר, סדרת דילול של ארבעה פיתיון דיאליזה שונים זוהתה על ידי אלייזה באמצעות נוגדן חד שבטי נגד CD ארבעה תגים. אם חלבוני הפיתיון הלא מדוללים אינם מספיקים כדי להרוות את כל אתרי קשירת הביוטין של צלחת מצופה ENC של סטרפטוק, אז רכז את החלבון באמצעות רכז ספין של Viva. אחרת, השתמש בחלבון הפיתיון בריכוז מדולל ב-PBST עם 2% BSA.

זה מספיק בדיוק כדי להרוות את אתר קשירת הביוטין של הבדיקה. כמת את הרמות היחסיות שבהן מתבטאים החלבונים הקדם-חלבונים באמצעות פעילות האנזים בטא לקטמאז. התחל ביצירת סדרת דילול של הסופינט המכילה את הפרפרוטאינים במאגר PBST 2%BSA.

לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר מהדילול ל -60 מיקרוליטר של תמיסת סטפין חנקתית הטעונה בצלחת. העבירו מיד את הצלחת לקורא צלחות ומדדו את הספיגה של 4 85 ננומטר אחת לדקה למשך 20 הדקות הבאות באמצעות רכזים צנטריפוגליים או דילול PBST עם 2% BSA. הגדר את הריכוז הסופי של הדגימות להידרוליזה של כל הניטרו בבדיקה תוך כשבע דקות, שזה בערך שני אול ניטרו מחזור לדקה.

התחל את מסך AveXis על ידי שטיפת צלחת מצופה סטרפטוקוקוס TAVR ENC ב-PBST והקשה על הצלחת יבשה על מגבת נייר. לאחר מכן, הוסיפו PBST עם BSA לכל באר ודגרו על הצלחת למשך 30 דקות. זה חוסם אתרי קשירת חלבון מזויפים.

בתוך כל אחד מהם, הסר היטב את תמיסת החסימה בתנועה חכמה של הצלחת מעל כיור והוסף 100 מיקרוליטר פיתיון מונומרי ביוטיניל מנורמל לבארות המתאימות. דוגרים את הצלחת למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את דגימות הפיתיון מהצלחת בתנועה נוספת ושטוף אותה שלוש פעמים עם PBST.

לאחר מכן הקש יבש לאחר הכביסה השלישית. כעת הוסיפו 100 מיקרוליטר ממבנה הטרף הפנטמר המנורמל לכל באר ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שעה, תנו לצלחת שלוש שטיפות נוספות עם PBST ושטיפה אחרונה עם PBS בלבד.

לבסוף, הוסיפו 60 מיקרוליטר של תמיסת שבע חנקן לכל באר ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, או רצוי לדגור את הצלחות למשך 16 שעות בארבע מעלות SIU. למחרת, אינטראקציות חיוביות יהפכו לאדומות. צלם את הלוח לתיעוד חזותי ולאחר מכן כמת את התגובות בספיגה של 4 85 ננומטר באמצעות קורא לוחות.

לאחר כ-10 דקות מתחילת תגובת הסקר של AveXis, נצפו שינויים בצבע צהוב לאדום הן בבקרת לכידת הטרף בתיווך הנוגדנים והן באינטראקציה חיובית של בקרה. שינוי צבע זה מעיד על הידרוליזה של החנקן במצע. ניתן להבחין בכמה אינטראקציות חיוביות בטווח זמן זה, אך לרובן לקח כמה שעות להופיע.

בדרך כלל, נצפה שיעור פגיעה של כ-0.4 עד 0.6% חיובי. לאחר הכנת ספריות החלבון, ניתן לבצע את חלק הסינון של טכניקה זו במהירות. זה בהחלט אפשרי לסנן עד 12 צלחות ביום לאחר זיהוי אינטראקציה.

השלב הבא החשוב ביותר הוא קודם כל להראות שניתן לחזור על האינטראקציה באמצעות תכשירי חלבון עצמאיים טריים. שנית, אנו תמיד קובעים אם האינטראקציה אינה תלויה באוריינטציה של טרף הפיתיון, כלומר, האם ניתן להחזיר אותה? זה כרוך בשיבוט תחומי וקטור הפיתיון לתוך וקטור הטרף ולהיפך.

אינטראקציות שניתן לחזור עליהן והדדיות נחשבות לביטחון גבוה ותמיד הוכחו כחיוביות. באמצעות טכניקות אחרות כגון תהודה של פלזמה על פני השטח, אנו אוהבים להשתמש בפלזמה על פני השטח בתהודה כדי לאמת בנוסף את כל האינטראקציות שאנו מזהים מחדש. חשוב לציין, זה מספק הדגמה לכך ששני הרכיבים המטוהרים יכולים לקיים אינטראקציה ישירה וניתן להשתמש בהם גם כדי להראות שהכריכה היא יושבת ולכן ספציפית.