סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle

סרטון זה מתאר את הסינתזה הקומבינטורית של ספריות סרטי פולי אנהידריד וננו-חלקיקים מתכלים, ואת זיהוי התפוקה הגבוהה של שחרור חלבון מספריות אלה. ראשית, מנגנוני שיקוע אוטומטיים בעלי תפוקה גבוהה המשמשים להפקדת מערך מגוון של מונומרים בקובטות זכוכית. תגובת עיבוי פולי מתבצעת ב -180 מעלות צלזיוס ו -0.3 טור למשך 1.5 שעות.

תנאי תגובה אלה ספציפיים לסינתזה של פולימר פולי אנהידריד C-P-H-S-A. באמצעות מנגנון התצהיר האוטומטי, הממס וכל הרכיבים לאנקפסולציה מופקדים בקובטות המכילות את ספריית הפולימרים. ניתן לתת סוניקציה כדי להבטיח פירוק מלא של הפולימר ופיזור אחיד של הרכיבים הנוספים.

לאחר מכן הפולימר המומס מועבר לתוך שפופרת של ממס שאינו ממס כדי לייצר את ספריית הננו-חלקיקים על ידי משקעים ננו. הננו-חלקיקים משוחזרים על ידי ייבוש או סינון ואקום, ולאחר מכן מועברים לצלחת ששוחררה היטב 96. לבסוף, הספרייה העמוסה בחלבון מודגרת בתנאים פיזיולוגיים וקינטיקה של שחרור חלבון מוערכת בשיטת זיהוי חלל פלואורסצנטי.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות קינטיקה של שחרור חלבון כפונקציה של תכונות פולימר או תנאי סביבת שחרור. היתרון העיקרי של גישה זו על פני טכניקות קונבנציונליות אחרות של דגימה אחת בכל פעם הוא שאנו מסוגלים לסנתז מספר דגימות בו זמנית. לאחר מכן ניתן לסנן דגימות אלה בתפוקה גבוהה עבור פולימר חלבון, פולימר תאים, או אינטראקציות פולימר מארח.

זה מזרז את התכנון והפיתוח הרציונלי של הביו-חומרים הללו להעברת תרופות והנדסת רקמות. מי שתדגים את ההליך תהיה לה טרישה פטרסון, פוסט-ניתוח מהמעבדה שלי. בחלק זה של הסרטון, נעשה שימוש במנגנון תצהיר תפוקה של הייאט להפקדת ספריית מונומרים משתנה מבחינה קומפוזיציונית לאחר סינתזת פולימרים.

מכשיר זה משמש לייצור ספרייה קומבינטורית של סרטי פולימר ריקים או טעוני חלבון או ננו-חלקיקים. הפלטפורמה האוטומטית מורכבת משתי משאבות מזרקים ניתנות לתכנות ושלושה מפעילים ליניאריים המחוברים בסדרה למחשב במחשב. תוכנת LabVIEW משמשת להכוונת פקודות למשאבות המזרקים והמפעילים.

מזרקים אטומים של 10 סמ"ק נטענים לתוך משאבות המזרק עם צינורות נימי מתכת המחוברים באמצעות אביזרי נעילת פיתיון, המחלקים את תמיסות הפולימר לקובטות זכוכית. בהדגמה זו, חומצה סאית או SA תשמש עם אחד שש Biss para oxy heane או CPH כדי ליצור ספרייה של ננו-חלקיקים העוטפים אלבומין בסרום טקסס רד בואן. ניתן להתאים את ההוראות בסרטון זה ובמסמכים הנלווים לייצור ובדיקה של מגוון רחב של ספריות סרטי פולימר וננו-חלקיקים.

כדי לסנתז את הספריות יש להתחיל בהמסת כל מונומר וכלורופורם בריכוז סופי של 25 מיליגרם למיליליטר בבקבוקון זכוכית. לאחר מכן, טען כל תמיסה למזרק אטום של 10 סמ"ק על ידי שאיבת התמיסה דרך קצה נעילת הפיתוי של המזרק. הסר בועות אוויר.

לאחר מכן, חבר את צינור נימי הנירוסטה העמיד בפני ממס לקצה המזרק. אבטח את צינורות הנימים במלחציים, הצמד למעמד טבעת. לאחר מכן מקם את קצה שני הצינורות הנימים לתוך הווטרינר ההתחלתי.

לתצהיר מונומר. הנח את המזרקים על משאבות המזרקים הניתנות לתכנות ונעל אותם במקומם בתוכנת תצוגת המעבדה. הגדר את המפעילים הליניאריים למצב ההתחלה בתוכנה.

התחל את התצהיר האוטומטי של מונומרים SA ו-CPH לתוך קובטות הזכוכית של ציר x, y ו-Z. מפעילים ימקמו כראוי את צינורות הנימים בכל Q, וטרינר וישאבו לתוכם נפחים מתוכנתים של כל מונומר, וייצרו ספריית מונומרים משתנה מבחינה קומפוזיציונית. לאחר תצהיר מונומר.

העבירו את ספריית המונומר לתנור ואקום שחומם מראש ודגרו בחום של 180 מעלות צלזיוס וסיור של 0.3 למשך 1.5 שעות כדי לאפשר פילמור עיבוי. לאחר הדגירה הושלם ייצור ספריית הפולימרים. לאחר מכן נוצרים ננו-חלקיקים פולימריים טעוני חלבון.

ראה את הפרוטוקול הנלווה לייצור ספריית סרטי פולימר עמוסי חלבון לייצור ספריית ננו-חלקיקים עמוסה בחלבון. הוסף את החלבון במקרה זה, אלבומין סרום בקר אדום טקסס לממס המתאים, שאמור להיות מסוגל להמיס את ספריית הפולימרים. כאן משתמשים במתילן כלוריד בריכוז של שני מיליגרם למיליליטר.

מלאו את מזרק ה-10 סמ"ק ב-Texas Red BSA המכיל ממס והניחו אותו במשאבת המזרק הראשונה. לאחר מכן הניחו מזרק נקי וריק של שני סמ"ק במשאבת המזרק השנייה הניחו צינורות המכילים 15 מיליליטר של ממס nons במקרה זה, פנטן במחזיק הצינור הסמוך לפלטפורמת הבקבוקון. בשלב הבא במעבדה, צפה בתוכנה התחל את תהליך שקיעת הממס האוטומטי על ידי בחירת התוכנית.

לאחר התחלת התוכנית, הממס מופקד בקובטות המכילות את ספריית הפולימרים, וכתוצאה מכך ריכוז פולימר של 20 מיליגרם למיליליטר. כאשר כל הממס הופקד, אפשר לו להמיס את הפולימר למשך דקה עד חמש דקות. עקוב אחר זה עם סינדיקציה אופציונלית כדי להבטיח פירוק מלא של פולימרים ופיזור חלבון אחיד.

לאחר מכן, התחל את תוכנית העברת הדגימה בתצוגת מעבדה. כל דגימת פולימר מומסת בספרייה נשלפת לאחר מכן למזרק הריק ומועברת לתוך השפופרת המתאימה לה של ממס שאינו ממס במחזיק הדגימה. לאחר העברת כל דגימה, שחזר את הננו-חלקיקים הטעונים בחלבון על ידי הנחת ספריית הננו-חלקיקים בתא ואקום ב-10 מילימטרים של ואקום כספית, או באמצעות סינון ואקום עד להסרת הממס.

כדי לחקור את שחרור ה-BSA המכוסה, התחל עם צלחת פוליפרופילן מרותכת עמוקה 96 ששונתה על ידי הסרת חצי הסנטימטר העליון של כל קיר באר של כל עמוד סמוך אחר בצלחת. הסרת החלק העליון של כל באר בין עמודות A ו-B, C ו-DENF ו-GNH מאפשרת זרימת נוזלים בין כל זוג בארות סמוכות כאשר הן מלאות להעברת נפח מלא. תקני BSA אדומים של טקסס נעים בין 1000 ל -10 מיקרוגרם למיליליטר לתוך צלחת 96 הבאר העמוקה.

אלה ישמשו לחישוב כמות החלבון ויסבירו גם את כיבוי הפלואורוכרום להרכיב מחדש את המסה הרצויה של ננו-חלקיקים במאגר PBS, ואז סוניקט כדי לפזר את החלקיקים באופן אחיד. לאחר מכן, העבירו את ספריית הננו-חלקיקים לתוך צלחת הבאר העמוקה של 96 והמתן עד שהדגימות ישקעו בתחתית לוחית הבאר. לאחר מכן, בעזרת צינור מלאו לאט את כל הבארות הסמוכות במאגר PBS עד רבע סנטימטר מראש הבאר.

צריך להיות מספיק חיץ בבארות הסמוכות כך שהוא יזרום בחופשיות בין הבארות. לאחר מכן, אטמו את צלחת השחרור עם המכסה והניחו אותה על 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה. למשך הניסוי בנקודות זמן מצטברות, השתמש בסורק פלואורסצנטי שטוח 9,400 טייפון כדי לסרוק את הצלחת באמצעות מסנני העירור, הלייזר והפליטה המתאימים.

לאחר הסריקה, השתמש בתוכנת קוונטית תמונה כדי לכמת את כמות החלבון המצומד פלואורוכרום המשוחרר בכל שחרור. ובכן, Texas Red BSA היה עטוף בספריית ננו-חלקיקים פולימריים המסונתזים ממונומרים SA ו-CPH כמתואר בסרטון זה כדי לקבוע קינטיקה של שחרור חלבון כפונקציה של כימיה פולימרית הננו-חלקיקים הטעונים בחלבון הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד, במהלכו התקבלו סריקות פלואורסצנטיות בנקודות זמן מצטברות לכימות שחרור החלבון.

כפי שמוצג כאן, שיטת תפוקה הידרו זו שימשה לקביעת קינטיקה של שחרור BSA של טקסס אדום מספריית ננו-חלקיקי פולי אנהידריד A-C-P-H-S-A. מגמות תלויות כימיה נצפו עם עלייה בשיעורי השחרור מכימיה של סרטי Sarich. תוצאות דומות התקבלו בעת שימוש במבחני כימות חלבון סטנדרטיים.

בניסוי נפרד, שחרור ה-BSA של טקסס רד מספריות הסרטים CPT CPH Poly Anhydride הוערך כפי שמוצג כאן נצפו קינטיקה של שחרור קרוב לאפס עם סרטים עשירים ב-cpeg המשחררים את החלבון במהירות הגבוהה ביותר עם יישומים פוטנציאליים בתחום הרפואי כמכשירים להעברת תרופות מתכלים. תוצאות אלו מצביעות על כך שניתן לשלוט בפרופיל השחרור הרצוי של תרופה טיפולית או אנטיגן חיסון על ידי שינוי הכימיה של הפולימרים. בעקבות הליך זה, פותחו שיטות קומבינטוריות אחרות לחקירת תחומים כגון יציבות חלבון, רעילות תאית, הפעלה תאית והפצה ביולוגית של InVivo.

היבטים אלה חשובים לתכנון רציונלי של ביו-חומרים להעברת תרופות והנדסת רקמות. אל תשכח ללבוש PPE מתאים ולתרגל נהלי מעבדה בטוחים לאורך כל הפרוטוקול הזה.