Name: סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: למדו סינתזה קומבינטורית של סרטי פוליאנהידריד וספריות ננו-חלקיקים ביודגרדביליים. שיטה זו מאפשרת גילוי בזרימה גבוהה של שחרור חלבון ליישומי שחרור תרופות והנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

החוקרים מכירים בפרס ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) והצבא האמריקאי למחקר הרפואי וציוד הפיקוד (גרנט מס W81XWH-10-1-0806) לתמיכה כספית. חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומי למדע תחת גרנט המספר 0552584 EEC ו0851519.

1. סינתזה קומבינטורית פולימר הספרייה (משתנה בכימיה של פולימרים) - ראה איור 1 להגדרת רובוטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס מונומר אחד ב( הריכוז = 25 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הממס המתאים ולטעון בכל לתוך מזרק גז הדוק 10cc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינורות הממס עמיד לפתות נעילת נימים לסוף כל מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרקים על משאבות המזרק (משאבות מזרק לתכנות חדשות Era) ולנעול למקומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המפעילים ליניארי (Zaber) למצב ההתחלתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מהדק מעמד טבעת, למקם את סוף שני צינורות נימים לתוך הבקבוקון מתחיל / גם בתצהיר מונומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום תכנית LabVIEW, שמשאבות נפחים משתנים של מונומר אחד לכל באר בהתאם להרכב קופולימר הרצוי. זו מושגת בתכנית על ידי מורה למפעיל Z-הציר להנמיך את צינורות נימים לתוך הבקבוקון / גם ואז כל משאבה לוותר עצמה הרצויה. NeXT, התכנית מורה Z-המפעיל לחזור לעמדה שלו ואת בית ה-X ו-Y-המפעילים לעבור לעמדתו של הבקבוקון הבא / כן. זה מתבצע עד שכל אחד יש גם את הנפח הרצוי של מונומר הופקד לתוכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות תצהיר מונומר, ספריית מונומר רב היטב או בקבוקון רב מועברת לתנור מחומם מראש ואקום וטופחה תחת ואקום למשך תגובת פילמור העיבוי. לCPH: סינתזת SA התגובה מתבצעת ב 180 מעלות צלזיוס, 0.3 Torr, עבור 1.5 שעות אבל תנאי תגובה אלה ינועו בין מערכות פולימרים שונות. </li></ol> 2. בלנק קומבינטורית וNanoparticle חלבון טעון פולימרים וייצור ספריית סרטים - ראו איור 1 להגדרת רובוטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המזרק במשאבת המזרק לתכנות הראשון מלא ממס (ספרייה ריקה) או ממס עם חלבון מפוזר בזה (ספריית חלבון טעון) ואילו את המזרק במזרק השנימשאבה נשארה ריקה. צינורות לייצור nanoparticle בבעל המדגם הסמוך מתמלאים בהלא ממס (יחס של ממס להלא ממס הוא 1 ל 100). עבור ייצור סרט צלחת ריקה רבה מנוצלת היטב במקומם של הצינורות בבעל המדגם הסמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת LabVIEW, הממס מופקד לכל בקבוקוני הפולימר / בארות של הספרייה (ריכוז = 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) וטופח ל1-5 דקות. צעד sonication אופציונלי (30 של ב 40 הרץ) יכול להיות הציג על מנת להבטיח פירוק פולימר שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, על ידי ייזום תכנית LabVIEW נפרדת, המדגם נסוג לתוך המזרק הריק, ויופקד בצינור המקביל שלה היטב שאינם ממס-(חלקיקים) או ריק (סרטים) בבעל המדגם הסמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך זה מתבצע עבור כל רכב פולימר הספרייה הדיסקרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nanoparticle או ספריית סרטים הועבר אז בתא ואקום להסרת ממס ואינו ממס (מאזני nanoparticleר&quot;י גם ניתן לשחזר באמצעות סינון ואקום). </li></ol> 3. קינטיקס שחרור חלבון תפוקה גבוהה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקירת קינטיקה שחרור חלבון תפוקה גבוהה מספריית פולימר, 96 עמוקים גאו (2 מ&quot;ל / היטב), צלחת פוליפרופילן היא לשנות כך את ראש 1/3 מהקיר גם בטורים שכנים (לשעבר: A ו-B, C ו-D, E, F, G, H) יוסרה לצרף את הבארות. סרטי חלבון הטעונים חייבים להיות מפוברקים באו החלקיקים הועברו לצלחת זה לביצוע מחקרי קינטיקה שחרור תפוקה גבוהה. דגימות nanoparticle חלבון טעון או סרט חייבות להיות ממוקמות רק בבאר אחת מהעמודות הצמודות (לשעבר: A, C, E, ו-G). ראה תרשים 4 לפרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ההעברה של החלקיקים לצלחת שחרורו עמוק נקוותה 96, החלקיקים הרשו להם להתיישב. PBS חיץ (0.1 מ&quot;מ, pH 7.4) הוא הוסיף באיטיות לכל דגימה היטב (עמודות A, C, E ו-G) ולאחר מכן לכל השכן היטב (עמודות B, D, F, ו-H) עד הבארות מלאות והחיץ הוא זורם חופשי בין בארות סמוכות. עבור חלקיקים, תהליך זה צריך להתבצע בזהירות נוספת על מנת להבטיח את החלקיקים יישארו בתחתית גם הדגימה (עמודות, C, E ו-G) ואינו מועבר לשחרור הסמוך היטב (עמודות B, D, F , ו-H). במקרים מסוימים, צנטריפוגה נדרשה למקם את דגימות nanoparticle בתחתית הדגימה היטב (עמודות A, C, E ו-G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, את צלחת שחרורו היא חתום עם מכסה והניחה בטמפרטורה הרצויה (כלומר 37 מעלות צלזיוס) מתחת לתסיסה לתקופת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודתי זמן מצטברות (כלומר 0.04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, ו 30 ימים) כמות החלבון fluorochrome מצומדות פרסם היא לכמת באמצעות סורק 9400 טיפון משטח פלורסנט ( GE Healthcare). צלחת שחרורו מונחת על משטח הסורק, שנסרק באמצעות ליזר העירור המתאים ופליטת filteRS, ועוצמת הקרינה של החלבון שוחרר בשחרור הבארות (עמודות B, D, F ו-H) הוא לכמת (קוואנט תמונה). הוא הציע כי סטנדרטים של ריכוזי חלבון ידוע להיכלל בצלחת גם לחישוב כמות חלבון וחשבונאי למרווית fluorochrome. </li></ol> 4. נציג תוצאות עם הייצור של פולימר הספרייה, אפיון בוצע עם H NMR 1, GPC, וכדי לאמת את שיטת FTIR קומבינטורית זה 1,7,8,11. טווח משקלים מולקולרי מ10,000-20,000 ג&#39;/ mol, מדד נע polydispersity 1.5-3.0, והרכב כימי הוכח כמדויק ובהסכם עם שיטות קונבנציונליות של סינתזת polyanhydride 12-15. כמו כן, תמונות SEM של ספריות חלקיקים הראו מורפולוגיה דומה לפני שטח, גודל והתפלגות גודל כמו זה של חלקיקים מפוברקים קונבנציונלי 2. חלבון השחרור kinetics מחלקיקי polyanhydride או סרטים מתבצע בצלחת גם שונה כפי שתואר לעיל 1. התוצאות הראה שחרור כדי לאפס משוער עם או בלי פרץ תלוי העמסת חלבון וכימית פולימר (איורים 2 ו -3) 1,12,14,16. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" /> איור 1. סרט קומבינטורית פולימר ומנגנון הייצור nanoparticle. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" /> איור 2 שחרור תפוקה גבוהה של טקסס האדומה השור אלבומין (TRBSA) מCPH:. ספריית פולימר nanoparticle SA. chemistries הפולימר SA-עשיר לשחרר מארז TRBSA במהירות הרבה ביותר, ואילו chemistries הפולימר CPH העשיר לשחרר האיטי ביותר. ברי שגיאה מייצגים סטנדרטית לסטייהtion וn = 4. הודפס מחדש באישור מפטרסן et. אל. 1. כל זכויות שמורה 2010 אגודה אמריקנית לכימיה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" /> איור 3 לשחרר תפוקה גבוהה של טקסס האדומה השור אלבומין (TRBSA) מCPTEG:. ספריית סרטי פולימר CPH. chemistries הפולימר CPTEG העשיר לשחרר מארז TRBSA במהירות הרבה ביותר, ואילו chemistries הפולימר CPH העשיר לשחרר האיטי ביותר. ברי שגיאה מייצגים סטיית תקן וn = 3. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" /> איור 4. תמונה שמציגה שתי בארות שכנות &quot;לפני&quot; ושינוי &quot;אחרי&quot; בצלחת עמוקה פוליפרופילן גאה 96. התמונה &quot;אחרי&quot; השינוי בימין גם מתארת ​​את התוספת של סרט פולימר (חלק תחתון של שמאל גם) עם מולקולת ניאון כמוסהששוחרר בין שתי בארות לפתרון חיץ. אז מולקולת הניאון שוחרר הוא זוהה בימין גם.

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial%2Fhigh-throughput+methods+for+the+determination+of+polyanhydride+phase+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior.</a> J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).</li>
<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ידע של תנאי הסינתזה הדרושות ואת טמפרטורות מעבר הזכוכית (T g ים) של הפולימרים המסונתזים חיוני לייצור ספרייה. אם T g שלהם מתחת לטמפרטורת חדר, צעד ייצור nanoparticle ייתכן שיצטרך להתבצע בסביבה מבוקרת טמפרטורה מתחת T g של הפולימרים. בנוסף, זהירות יש לנקוט על מנת להבטיח שכל הציוד שבא במגע עם טמפרטורות גבוהות והממסים חייב להיות בכושר כדי להתמודד עם תנאים אלה. כמה מהפרמטרים של פרוטוקול זה יכול להיות מותאם (כלומר, טמפרטורה, ואקום, זמני דגירה, ממסי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> שלב ממונע XYZ: 3x T-LSM050A, נסיעות 50 מ&quot;מ בציר </td><td> טכנולוגיות Zaber </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> משאבת מזרק יחידה NE-1000 </td><td> מערכות משאבת עידן חדשות </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> פיירקס * Vista * צינורות תרבות מוקדיות שימוש חוזרים זכוכית </td><td> קורנינג </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> cuvettes זכוכית </td><td> אסטרטגיות מדעיות </td><td> G102 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> מכשירים הלאומיים </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> מזרקי SGE גז הדוקים, luer Loc </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> U96 DeepWell צלחות 1.3 מ&quot;ל ו2.0 מ&quot;ל </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 278743 </td></tr><tr><td> גם מחצלות כובע </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 276000 </td></tr><tr><td> טיפון 9400 </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-79 </td></tr><tr><td> Whatman כיתת 50 מעגלים 90 מ&quot;מ </td><td> Whatman </td><td> 1450-090 </td></tr></tbody></table>

סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות nanoparticle

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides הוא קבוצה של חומרים ביולוגיים עם biocompatibility מצוין ויכולות אספקת סמים. בזמן שהם נחקרו רבים עם קונבנציונלי אחד מדגם ב-A-זמן טכניקות סינתזה, גישה אחרונה יותר תפוקה גבוהה פותחה מאפשרת סינתזה והבדיקה של ספריות גדולות של 1 polyanhydrides. זה יאפשר ביצוע אופטימיזציה יעילה יותר ותהליך עיצוב של biomaterials אלה עבור יישומי משלוח סמים וחיסון. שיטת עבודה זו מתארת ​​את הסינתזה קומבינטורית של סרט polyanhydride מתכלה וספריות nanoparticle וזיהוי התפוקה גבוהה של שחרור חלבון מהספריות הללו. בשיטת רובוט מופעל זה (איור 1), ומפעיל ליניארי ומשאבות מזרק נשלטים על ידי LabVIEW, המאפשר פרוטוקול אוטומטי ללא ידות, ביטול שגיאות משתמש. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת ייצור המהיר של ספריות פולימר מייקרו בקנה מידה, אדוםucing הגודל יצווה תוך כתוצאה מהיצירה של מערכות פולימרי multivariant. גישה זו לסינתזה קומבינטורית פולימר מאפשרת סינתזה של עד 15 פולימרים שונים בסכום שווה ערך של זמן זה ייקח לסנתז פולימר 1 כמקובל. בנוסף, ספריית פולימר קומבינטורית יכולה להיות מפוברקת בגיאומטריות ריקות או חלבון טעונים כוללים סרטים או חלקיקים עם פיזורה של ספריית הפולימר בממס ומשקעים אל הלא ממס (עבור חלקיקים) או על ידי ייבוש ואקום (לסרטים). בעקבות טעינת חלבון fluorochrome מצומדות לספריות הפולימר, קינטיקה שחרור החלבון ניתן להעריך בתפוקה גבוהה באמצעות שיטת זיהוי מבוססת פלואורסצנטי (איורים 2 ו 3) כפי שתואר לעיל 1. פלטפורמת קומבינטורית זו אומתה בשיטות קונבנציונליות 2 וסרט polyanhydride וספריות nanoparticle התאפיינו עם <sup&gt; 1 H NMR ו FTIR. הספריות נבדקו עבור קינטיקה חלבון שחרור, יציבות וantigenicity; ברעילות סלולרית מבחנה, ציטוקינים ייצור, משטח סמן ביטוי, הדבקה, הפצה ובידול, ובbiodistribution וmucoadhesion 1-11 vivo. השיטה פותחה קומבינטורית להלן מאפשרת סינתזת תפוקה גבוהה פולימר וייצור של חלבון nanoparticle הטעון וספריות סרטים, שיכול, בתורו, להיות מוקרן במבחנת in vivo לאופטימיזציה של ביצועים ביולוגיים.

שיטה זו מתארת ​​את הסינתזה קומבינטורית של סרט polyanhydride מתכלה וספריות nanoparticle וזיהוי התפוקה גבוהה של שחרור חלבון מהספריות הללו.

סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle

פוליאנהידרידים הם מחלקה של ביו-חומרים בעלי תאימות ביולוגית מצוינת ויכולות להובלת תרופות. למרות שהם נחקרו באופן נרחב עם...

סרטון זה מתאר סינתזה קומבינטורית של ספריות ננו-חלקיקים וסרטי פולי-אנהידריד מתכלים, וכן זיהוי בסבירה גבוהה של שחרור חלבונים מספריות אלו. ראשית, נעשה שימוש במכשור השקעה אוטומטי בעל סבירה גבוהה להשקעת מערך מגוון של מונומרים לתוך קובטות זכוכית. תגובת פולי-קונדנסציה מבוצעת בטמפרטורה של 180 °C ובלחץ של 0.3 tor למשך 1.5 שעות.תנאי תגובה אלה ספציפיים עבור סינתזת פולימר פולי-אנהידריד מסוג C-P-H-S-A. באמצעות מכשיר השקיעה האוטומטי, הממס וכל רכיבי הכמיסה משוקעים לתוך הקיווטות המכילות את ספריית הפולימרים. ניתן להשתמש בסוניקציה כדי להבטיח המסה מלאה של הפולימר ופיזור אחיד של הרכיבים הנוספים.לאחר מכן, הפולימר המומס מועבר למבחנה המכילה ממס שאינו הממס המקורי (nonsolvent) כדי לייצר את ספריית הננו-חלקיקים באמצעות שיקוע ננוי (nanoprecipitation). הננו-חלקיקים מופקים באמצעות ייבוש בוואקום או סינון, ולאחר מכן מועברים לפלטה של 96 בארות המותאמת לשחרור חומרים. לבסוף, הספרייה הטעונה בחלבון מדגרה בתנאים פיזיולוגיים, וקינטיקת שחרור החלבון מוערכת באמצעות שיטת זיהוי פלואורסצנטית במרחב.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות קינטיקה של שחרור חלבון כפונקציה של תכונות הפולימר או תנאי סביבת השחרור. היתרון המרכזי של גישה זו על פני טכניקות קונבנציונליות אחרות של בדיקת דגימה אחת בכל פעם הוא היכולת לסנתז מספר דגימות בו-זמנית. לאחר מכן, ניתן לסנן דגימות אלה בסריקה רב-דגימתית (high throughput) כדי לבחון אינטראקציות בין חלבון לפולימר, תא לפולימר או פולימר למארח.פעולה זו מאיצה את התכנון והפיתוח הרציונליים של ביו-חומרים אלו עבור הולכת תרופות והנדסת רקמות. את הפרוצדורה תדגים La Tricia Peterson, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. בחלק זה של הסרטון, נעשה שימוש במכשיר השקעה ברמה גבוהה (high throughput) להשקעת ספריית מונומרים בעלת הרכב משתנה, לאחר סינתזת הפולימר.מכשיר זה משמש לייצור של ספרייה קומבינטורית של סרטי פולימר או ננו-חלקיקים, ריקים או טעונים בחלבון. הפלטפורמה האוטומטית מורכבת משתי משאבות מזרקים ניתנות לתכנות ושלושה מפעילים ליניאריים המחוברים בטור למחשב. תוכנת LabVIEW משמשת להעברת פקודות למשאבות המזרקים ולמפעילים.מזרקים של 10 cc בעלי אטימה גבוהה נטענים למשאבות מזרקים עם צינורות קפילריים ממתכת המחוברים באמצעות מחברי lure lock, אשר מזרימים את תמיסות הפולימר לתוך קיובטות זכוכית. בהדגמה זו, יעשה שימוש ב-seic acid או SA יחד עם one six Biss para oxy heane או CPH כדי ליצור ספריית ננו-חלקיקים המכמיסים Texas Red Boan serum albumin. ניתן להתאיים את ההוראות בסרטון זה ובמסמכים הנלווים כדי לייצר ולבחון מגוון רחב של ספריות סרטי פולימר וננו-חלקיקים.כדי לסנתז את הספריות, התחילו בהמסה של כל מונומר וכלורופורם בריכוז סופי של 25 milligrams per milliliter בתוך מבחנה מזכוכית. לאחר מכן, העבירו כל תמיסה למזרק אטום לגז בנפח 10 cc על ידי שאיבת התמיסה דרך קצה ה-lure lock של המזרק. הסירו בועות אוויר כלשהן.בשלב הבא, חברו את צינור הנימי מפלדת אל-חלד עם חיבור lure lock העמיד בממס לקצה המזרק. אחרו את הצינורות הנימיים בתפסנים וחברו אותם למעמד טבעת. לאחר מכן, מקמו את קצותיהם של שני הצינורות הנימיים בתוך כלי ההתחלה.עבור השקעת המונומר. מקמו את המזרקים על משאבות המזרקים הניתנות לתכנות ונעלו אותם במיקומם בתוכנת ה-lab view. הגדירו את המפעילים הליניאריים למצב ההתחלה בתוכנה.התחל את השקיעה האוטומטית של המonomers SA ו-CPH אל תוך הקובטות הזכוכית בצירים x, y ו-Z. המפעילים (actuators) ימקמו נכונה את צינורות הנימיים בכל קובטה וישאבו נפחים מתוכננים של כל מונומר לתוכם, ובכך ייצרו ספריית מונומרים בעלת הרכבים משתנים. לאחר שקיעת המונומרים.העבירו את ספריית המונומרים לתנור ואקום שחומם מראש והדרימו בטמפרטורה של 180 degrees Celsius ובלחץ של 0.3 tour למשך 1.5 שעות כדי לאפשר פולימריזציית עיבוי. לאחר ההדגרה, הושלמה בניית ספריית הפולימרים. לאחר מכן, ייוצרו ננו-חלקיקי פולימר טעונים בחלבון.עיינו בפרוטוקול הנלווה להכנת ספריית סרטי פולימר טעונים בחלבון לצורך הכנת ספריית ננו-חלקיקים טעונים בחלבון. במקרה זה, הוסיפו את החלבון, Texas red bovine serum albumin, לממס המתאים, שצריך להיות מסוגל להמיס את ספריית הפולימר. כאן, נעשה שימוש ב-methylene chloride בריכוז של 2 mg/mL.מלאו מזרק של 10 cc בממס המכיל Texas Red BSA והניחו אותו במשאבת המזרקים הראשונה. לאחר מכן, הניחו מזרק נקי וריק של שני cc במשאבת המזרקים השנייה, והניחו מבחנות המכילות 15 milliliters של ממס שאינו ממיס, במקרה זה פנטן, במחזיק המבחנות הסמוך לפלטפורמת הבקבוקונים. לאחר מכן, בתוכנת lab view, הפעילו את תהליך שיקוע הממס האוטומטי על ידי בחירת התוכנית.לאחר הפעלת התוכנית, הממס מוזרם אל תוך הקובטות המכילות את ספריית הפולימרים, מה שיוצר ריכוז פולימר של 20 mg/mL. כאשר כל הממס הוזרם, יש להמתין דקה אחת עד חמש דקות להמסת הפולימר. לאחר מכן, ניתן לבצע ערבוב אופציונלי כדי להבטיח המסה מלאה של הפולימר ופיזור אחיד של החלבון.בשלב הבא, הפעילו את תוכנית העברת הדגימות ב-LabVIEW. כל דגימה של פולימר מומס בספרייה נשאבת למזרק הריק ומועברה לשפופרת המתאימה של הממס הלא-ממיס במחזיק הדגימות. לאחר העברת כל דגימה, השגיחו את הננו-חלקיקים הטעונים בחלבון על ידי הנחת ספריית הננו-חלקיקים בתא ריקומון בוואקום של 10 millimeters of mercury, או באמצעות סינון בוואקום עד להסרת הממס.כדי לחקור את השחרור של BSA encapsulated, התחילו עם פלטת פוליפרופילן עמוקה בעלת 96 בארות, ששופרה על ידי הסרת חצי האינץ' העליון של דופן כל בארה בכל עמודה שנייה סמוכה בפלטה. הסרת החלק העליון של כל בארה בין עמודות A ו-B, C ו-D, E ו-F, ו-G ו-H מאפשרת זרימת נוזלים בין כל זוג בארות סמוכות כאשר הן מלאות עד לנפח העברה מלא. הוסיפו סטנדרטים של Texas red BSA בטווח של 1000 עד 10 micrograms per milliliter אל הפלטה העמוקה בעלת 96 הבארות.אלו ישמשו לחישוב כמות החלבון ויחשבו גם את כיבוי הפלואורוכרום; השחזר את המסה הרצויה של הננוחלקיקים בבופר PBS, ולאחר מכן בצע סוניקציה כדי לפזר את החלקיקים באופן אחיד. לאחר מכן, העבר את ספריית הננוחלקיקים לתוך פלטת 96 בארות עמוקה והמתן עד שהדגימות ישקעו לתחתית הפלטה. לאחר מכן, באמצעות פיפטור, מלא באיטיות את כל הבארות הסמוכות בבופר PBS עד לגובה של רבע אינץ' מהחלק העליון של הבאר.יש להוסיף מספיק בופר לבארים הסמוכות כך שיהיה זרימה חופשית בין הבארים. לאחר מכן, אטמו את לוח השחרור בעזרת המכסה והניחו אותו בטמפרטורה של 37 °C תחת ערבוב. לאורך הניסוי, בנקודות זמן הדרגתיות, השתמשו בסורק פלואורסצנטי שטוח מדגם 9, 400 Typhoon כדי לסרוק את הלוח תוך שימוש במסנני עירור, לייזר ופליטה מתאימים.לאחר הסריקה, השתמשו בתוכנה לכימות תמונות כדי לכמת את כמות החלבון המצומד לפלואורוכרום ששוחרר בכל שלב שחרור. Texas Red BSA הוכנס לתוך ספריית ננו-חלקיקים פולימריים שסונתזו ממונומרים של SA ו-CPH כפי שמתואר בסרטון זה, כדי לקבוע את קינטיקת שחרור החלבון כפונקציה של הכימיה של הפולימר. הננו-חלקיקים הטעונים בחלבון הודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך חודש, ובמהלכו בוצעו סריקות פלואורסצנטיות בנקודות זמן הדרגתיות לצורך כימות שחרור החלבון.כפי שמוצג כאן, שיטת תפוקת ההידרו זו שימשה לקביעת קינטיקת השחרור של Texas Red BSA מספריית ננו-חלקיקי פולי-אנהידריד A-C-P-H-S-A. נצפו מגמות התלויות בכימיה, עם שיעורי שחרור עולים מכימיות של סרטי Sarich. תוצאות דומות התקבלו בעת שימוש בבדיקות סטנדרטיות לכמות חלבון.בניסוי נפרד, נבחנה שחרור של Texas Red BSA מספריות סרטים של CPT CPH Poly Anhydride כפי שמוצג כאן; נצפתה קינטיקת שחרור מסדר אפס כמעט, כאשר סרטים עשירים ב-cpeg שחררו את החלבון במהירות הרב ביותר, עם יישומים פוטנציאליים בתחום הרפואי כהתקני הולכת תרופות מתכלים. תוצאות אלו מצביעות על כך שניתן לשלוט בפרופיל השחרור הרצוי של תרופה טיפולית או אנטיגן של חיסון על ידי שינוי הכימיה של הפולימר. בעקבות הליך זה, פותחו שיטות קומבינטוריות אחרות לבחינת תחומים כגון יציבות חלבונים, רעילות תאית, אקטיבציה תאית ופיזור ביולוגי InVivo.היבטים אלו חשובים לתכנון רציונלי של ביו-חומרים להולכת תרופות ולהנדסת רקמות. אין לשכוח להשתמש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים ולהקפיד על נהלי מעבדה בטיחותיים לאורך כל הפרוטוקול.

combinatorial-synthesis-high-throughput-protein-release-from-polymer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תיאור של ההיווצרות של הפולימר microarray באמצעות טכניקת photopolymerization על שבב. אפיון משטח התפוקה הגבוהה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מדידות זווית מגע מים, ספקטרוסקופיה Photoelectron רנטגן ושעה של ספקטרומטריית טיסה משנית יון המוני וassay מצורף תא גם תאר.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

אנו מציגים גישת microfluidic לביטוי של מערכי חלבון. המכשיר מורכב מאלף תאי תגובה הנשלטים על ידי מייקרו שסתומים מכאניים. מכשיר microfluidic הוא הזדווגו לספריית גן microarray-מודפסת. גנים אלו אז מתועתקים ומתורגמים על שבב, וכתוצאה מכך מערך חלבון מוכן לשימוש ניסיוני.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

במאמר זה, שיטת תפוקה גבוהה מוצג לסינתזה של אוליגוסכרידים ו חיבורן אל פני השטח של חלקיקים polyanhydride לשימוש נוסף מיקוד קולטנים ספציפיים על תאים מציגי אנטיגן.

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

טכניקה פשוטה, חזקה וניתן להרחבה לfunctionalize ולהרכיב עצמי סרטי monolayer nanoparticle ליגנד מקרוסקופית על גבי מצעים נטולי תבנית מתוארת בפרוטוקול זה.

טכניקה לfunctionalize ועצמי להרכיב מקרוסקופית Nanoparticle ליגנד חד שכבתי סרטים על גבי מצעים נטולי תבנית

אנו מדווחים על פרוטוקולים ל"פילמור" סוגים שונים של ננו-חלקיקי מתכת עטופים בפולימר לשרשראות ארוכות של "הומו-" ו"קו-פולימרים".

באמצעות Polystyrene-<em&gt; בלוק</em&gt; -poly (חומצה אקרילית) -coated מתכת חלקיקים כמו מונומרים להומו- ושיתוף פילמור

פילמור ממטרים ללא עוררה מספק גישה אבי טיפוס ודגמים, לשחזור לסינתזה של פולי גירויים רגיש (-isopropylacrylamide N) microgels של התפלגות גודל הצרה. בסינתזה בפרוטוקול זה, אפיון פיזור אור ומעקב קרינת חלקיק בודד של microgels אלה או בהתקנה של מיקרוסקופיה רחב בתחום הם הפגינו.

סינתזה מבוקרת מעקב הקרינה של פולי אחיד מאוד (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Microgels

ננו מספקות מנגנונים מגוונים של משלוח טיפולית מבוקרת מדע בסיסי ויישומים translational, אך ייצור שלהם לעתים קרובות דורשת מומחיות שאינו זמין במעבדות ביותר ביו. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור ייצור מדרגי של טעינת טיפוליות מגוונות nanocarriers התאספו עצמית באמצעות nanoprecipitation פלאש.

הרכבה מהירה, מדרגי וטעינה של חלבונים ביו, Immunostimulants לתוך Nanocarriers סינתטי מגוונות באמצעות פלאש Nanoprecipitation

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

ננו-ג'לים הם פלטפורמת ננו-חלקיקים מצוינת ורב-תכליתית לאספקת תרופות ביולוגיות. ננו-ג'לים פולימריים מבוססי פולי(אתילן) המגיבים לגירויים, המסוגלים לעטוף מטענים מבוססי חלבון, סונתזו באמצעות אסטרטגיית קו-פילמור צולבת בת שלב אחד בתנאים מימיים. הייצור והאפיון האופטימליים של ננו-חלקיקים חדשניים אלה מוצגים כאן.

סינתזה של ננו-ג'לים המגיבים לגירויים באמצעות קרוסלינקינג מימי חד-שלבי וקו-ננופילמריזציה

במאמר זה אנו מציגים שני פרוטוקולים להטמעת תגובות סינתזת חלבונים נטולי תאים במטריצות הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו ללא צורך בפאזה נוזלית חיצונית.

שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים בקנה מידה מאקרו

הייצור של התקן דו-שכבתי מבוסס פולידימתילסילוקסאן (PDMS) לייצור ספריות קומבינטוריות בתחליבים של מים בשמן (תקעים) מוצג כאן. החומרה והתוכנה הדרושים לאוטומציה של ייצור תקעים מפורטים בפרוטוקול, ומודגם גם ייצור ספרייה כמותית של תקעים פלואורסצנטיים.

התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי לייצור תקע קומבינטורי

למדו סינתזה קומבינטורית של סרטי פוליאנהידריד וספריות ננו-חלקיקים ביודגרדביליים. שיטה זו מאפשרת גילוי בזרימה גבוהה של שחרור חלבון ליישומי שחרור תרופות והנדסת רקמות.

סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle

גלה סרטונים נוספים