בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות 'נומיקס וירוס אחד "

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ויריונים בודדים מתוך קונסורציום מעורב ולרצף את החומר הגנומי שהתקבל כדי לזהות וירוסים ממגוון סביבות ללא צורך בתרבית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד הוויריונים הבודדים באמצעות מיון בציטומטריה של זרימה אל חרוזי אגרוז. לכידת הוויריון הבודד מאושרת לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

בשלב הבא, החומר הגנומי מבודל מהוויריונים ומוגבר באמצעות הגברה על ידי תעתוק רב-החלפה (multiple displacement amplification או MDA) כדי להפיק את כמות ה-DNA הדרושה לריצוף. לבסוף, ה-DNA הוויראלי עובר ריצוף באמצעות טכנולוגיות בעלות תפוקה גבוהה (high throughput) כדי ליצור כיסוי רב של הגנום הוויריוני, דבר המסייע משמעותית בהרכבה ובאנוטציה של הגנום. בסופו של דבר, טכניקות ביואינפורמטיות המיועדות לשימוש בגישות של דגימה-תת-ריצוף (sequence sub-sampling) להגדלת גודל הקונטיגים (contigs), מאפשרות ניתוח של ויריונים מבודדים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האקולוגיה הווירוסית על ידי מתן הקשר גנומי למאגר העצום של גנים של ויריופלנקטון שאינם מאנוטטים, וכן לאפשר גילוי של גנומים חדשים ממערכות אקולוגיות מגוונות. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים להתקשה, מכיוון שההגברה והבידוד של ויריונים בודדים דוחפים את גבולות הטכנולוגיה הנוכחית. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הערכנו את השימוש ב-MDA בקהילות של ויריופלנקטון והבנו כי ניתן למיין חלקיק ויראלי בודד, לרצף, ולפיכך להרכיב גנום ויראלי מלא מתוך קהילות מורכבות אלה. כדי למיין וירוסים באמצעות ציטומטר זרימה המצויד במכפילים פוטו-אלקטריים למפזור קדמי מותאם אישית או FSCPMT, התחילו בדילול של החלקיקים הויראליים ב-tris-EDTA מסונן ב-0.1 micron. עבור תערובת המכילה חלקיקי פאג' T4 ולמדא, הגדירו את ה-FSCPMT ל-1000 ואת ה-SSC ל-200 כדי למקסם את יחס אות לרעש.

לאחר הרצת דגימות בקרה, הריצו כ-100 µL של תרחיף הנגיפים הצבועים עד להגעה לסך של 5,000 אירועים. לאחר מכן, השתמשו בגרפים של sybr green one ו-FSCPMT כדי להגדיר שער (gate) הדוק במרכז חלקיקי הנגיפים. כעת, הוסיפו חמישה µL של 1% low melting point agarose בבופר TBE שקוירר ל-37 °C לכל באר על גשמיקת מיקרוסקופ מסוג P-T-F-E, ואז טענו את הגשמיקה לתוך ציטומטר הזרימה כדי ללכוד את חלקיקי הנגיפים הממוינים.

התחילו במיון, כאשר לוכדים 10 אירועים של חלקיקים נגיפיים או יותר בחלק מהבארות, כדי לסייע בזיהוי עומק הנגיפים במהלך מיקרוסקופיה סורקת בלייזר קונפוקאלית. עם סיום המיון, הוציאו את השקף מהציטומטר הזורם והוסיפו חמישה מיקרוליטרים נוספים של אגרוז בנקודת התכה נמוכה שקורר ל-37 °C לכל בארה המכילה את החלקיקים הנגיפיים. עבור ויריונים בודדים, כוון את המיקרוסקופ הסורק בלייזר קונפוקאלי לעירור של 488 nm. לאחר מכן, דגמו את החלקיקים המוטמעים באמצעות עדשה בעלת מרחק עבודה ארוך של 63x כדי לוודא שקיים חלקיק בודד בלבד ושנגיפים מרובים אינם נערמים זה על גבי זה. לאחר זיהוי הבארות עם נגיפים בודדים, השתמשו בתער כדי להוציא את חרוזי האגרוז הרצויים מהשקף והניחו אותם במבחורת PCR סטרילית.

מקמו את המבחנה בבלוק החימום של תרמוסייקלר המכוון ל-94 degrees Celsius למשך שלוש דקות כדי ללוחם את החלקיק הויראלי in-situ. לאחר ביצוע MDA משופר, העבירו את ה-genomic DNA למבחנות Eppendorf בנפח 1.7 milliliter והוסיפו נפח של עשירית מ-three molar sodium acetate בבופר TBE כדי לטהר את החומר הגנומי שהועשר. מקמו את הדגימות בטמפרטורה של 55 degrees Celsius למשך 10 דקות כדי להמיס את האגרוז, ולאחר מכן העבירו את המבחנות ל-42 degrees Celsius כדי להוריד את הטמפרטורה לפני הוספת האנזים. כעת, הוסיפו שתי יחידות של Beta-agarase לכל מבחנה והדגירו את המבחנות למשך שעתיים.

לאחר מכן, הוסיפו לנבובת כל אחת נפח אחד של תמיסת פנול רוויה במאזן (buffered saturated phenol). ערבבו בעוצמה וסבבו את הנבובות בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-3,500 ×g בטמפרטורת החדר. העבירו את העיליות המכילות את ה-DNA לנבובת Eppendorf חדשה בנפח 1.7 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו לנבובות נפח אחד של 100% isopropanol ומיקרוליטר אחד של glyco-blue, והפכו את הנבובות כדי לערבב. לאחר סבוב נוסף של הנבובות בצנטריפוגה, הפעם למשך 60 דקות ב-28,000 ×g וב-4°C, שפכו את ה-isopropanol, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע, והוסיפו 150 מיקרוליטר של 70% ethanol לכל נבובת. סבבו את הנבובות למשך 10 דקות ב-28,000 ×g בטמפרטורת החדר. שפכו את ה-ethanol, ייבשו את משקע ה-DNA באוויר והמיסו מחדש את ה-DNA בנפח מתאים של תמיסת tris-EDTA. שחזור תלת-ממדי זה של חלקיק נגיפי שנצבע ב-sybr green I בתוך חרוז אגרוז מדגים כיצד ניתן להשתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר כדי להדמיות ולאשר כי התקבל ויריון בודד בכל באר לאחר לכידה והטמעה באגרוז; התמונה המוכנסת מראה הגדלה גבוהה יותר של החלקיק הנגיפי המבודד.

כאן מוצג גרף פרופיל של הפלואורסצנציה היחסית של חלקיק נגיפי בודד שצבעו בתוך חרוז אגרוז. סדרת איורים סופית זו מראה כי כמעט כל הגנום של Lambda, למעט חמש זוגות הבסיסים הראשונים, שוחזרו עבור נגיף מייצג זה. כאן מוצג גרף ה-GC עבור הגנום של הנגיף הבודד שזוהה. איור זה מציג את מפת הגנום של lambda. לבסוף, מוצגת מיפוי של גנום נגיפי בודד עבור בקטריופאג lambda מייצג שבודד והוגבר. ציר ה-X מראה את המיקום בגנום. ציר ה-Y מראה את אחוז הכיסוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשתמש בטכניקה סטרילית ולהקדיש את הזמן הדרוש כדי להבטיח מניעת זיהומים. לאחר פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי להעריך את הטקסונומיה של הוויריונים המבודדים לפני ביצוע רצף גנומי מלא. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן בידודן של ויריונים בודדים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), מיקרוסקופיה קונפוקלית והגברה של הגנום המלא.