בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות 'נומיקס וירוס אחד "
26 במאי 2013
ג'נומיקס וירוס אחד (SVG) הוא שיטה לבודד ולהגביר את הגנום של virons בודד. השעיות נגיפיות של מכלול מעורב מסודרים באמצעות cytometry זרימה לשקופית מיקרוסקופ עם בארות בדידות המכילות agarose, ובכך ללכוד את virion והפחתת גז הגנום במהלך עיבוד במורד הזרם. ההגברה הגנום כולו מושגת באמצעות הגברה עקירה מרובה (מד"א) וכתוצאה מכך חומר גנטי שמתאים לסידור.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד וריאנים בודדים מקונסורציום מעורב ולרצף את החומר הגנומי המתקבל כדי לזהות נגיפים ממגוון סביבות ללא צורך בגידול. זה מושג על ידי בידוד תחילה של הגרסאות הבודדות באמצעות מיון ציטומטרי של זרימה על חרוזי ארו. לכידת יון בודד מאומתת לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
לאחר מכן, החומר הגנומי מבודד מהיונים ומוגבר באמצעות הגברת תזוזה מרובה או MDA כדי לייצר את כמות ה-DNA הדרושה לריצוף. לבסוף, ה-DNA הנגיפי מרוצף באמצעות טכנולוגיות תפוקה גבוהות כדי ליצור כיסוי עודף של גנום הוויריון המסייע באופן משמעותי בהרכבת הגנום וההערות. בסופו של דבר, טכניקות ביואינפורמטיות שמטרתן להשתמש בגישות תת-דגימה של רצף כדי להגדיל את גודל הקון מאפשרות ניתוח של וונים מבודדים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האקולוגיה הנגיפית על ידי מתן הקשר גנומי למאגר העצום של גנים של פלנקטון OC מבוארים, כמו גם לאפשר גילוי גנומים חדשים ממערכות אקולוגיות מגוונות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהגברה ובידוד של יונים בודדים דוחפים את גבולות הטכנולוגיה הנוכחית. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הערכנו את השימוש ב-MDA על קהילות פלנקטון של Vero והבנו שאפשר למיין חלקיק ורצף ויראלי יחיד ולכן להרכיב גנום ויראלי שלם מקהילות מורכבות אלה כדי למיין וירוסים באמצעות ציטומטר זרימה המצויד בצינורות פוטו-מכפיל פיזור קדימה מותאמים אישית או F-S-C-P-M-T התחל בדילול החלקיקים הנגיפיים ב-tris מסוננים של 0.1 מיקרון, EDTA עבור מכלול מעורב המכיל חלקיקי פאג' T ארבע ולמבדה מגדיר את ה-F-S-C-P-M-T ל-1000 ואת ה-SSC ל-200 כדי למקסם את יחס האות לרעש.
לאחר הפעלת דגימות בקרה, הפעל כ-100 מיקרוליטר של התרחיף הנגיפי המתמשך לסך של 5,000 אירועים. לאחר מכן השתמש בחלקות הסייבר הירוק ו-F-S-C-P-M-T כדי למקם שער הדוק במרכז החלקיקים הנגיפיים. כעת הוסף חמישה מיקרוליטרים של נקודת התכה נמוכה של 1% במאגר TBE מקורר ל-37 מעלות צלזיוס לכל באר בשקופית מיקרוסקופ A-P-T-F-E ולאחר מכן טען את השקופית לתוך ציטומטר הזרימה כדי ללכוד את החלקיקים הנגיפיים הממוינים.
התחל למיין, ללכוד 10 אירועי חלקיקים נגיפיים או יותר בחלק מהבארות כדי לסייע בזיהוי עומק הנגיפים במהלך מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. בסיום המיון, הסר את השקופית מציטומטר הזרימה והוסף עוד חמישה מיקרוליטרים של נקודת התכה נמוכה מקוררת ל-37 מעלות צלזיוס לכל באר. הטמעת החלקיקים הנגיפיים לווריון יחיד.
הגדר את מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי ל-488 ננומטר. לאחר מכן עירור דמיין את החלקיקים המוטבעים באמצעות יעד מרחק עבודה ארוך פי 63 כדי לוודא שרק חלקיק אחד קיים וכי וירוסים מרובים אינם נערמים זה על גבי זה. לאחר מכן, לאחר שזוהו הבארות עם נגיפים בודדים, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את חרוזי האגרוס הרצויים מהמגלשה ולהניח אותם בצינור PCR סטרילי.
הנח את הצינור בבלוק החום של תרמו-סייקלר המוגדר ל-94 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות כדי להכין את החלקיק הנגיפי באתרו. לאחר מכן, לאחר ביצוע MDA שונה, העבירו את ה-DNA הגנומי לצינורות אינור של 1.7 מיליליטר והוסיפו נפח עשירי של שלוש נתרן אצטט טוחנת במאגר TBE כדי לטהר את החומר הגנומי המוגבר, הניחו את הדגימות ב-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להמיס את הארוס ולאחר מכן הזיזו את הצינורות ל-42 מעלות צלזיוס כדי להפחית את הטמפרטורה לפני הוספת האנזים. כעת הוסף שתי יחידות של בטא aase לכל צינור ודגר את הצינורות למשך שעתיים.
לאחר מכן הוסף נפח אחד של תמיסת פנול רוויה חוצץ לכל צינור. מערבבים במרץ וצנטריפוגה את הצינורות למשך 15 דקות בטמפרטורה G.At 3,500 פעמים מטמפרטורת החדר, מעבירים את ה-DNA המכיל SUPERNATANTS לצינור איינור חדש של 1.7 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף נפח אחד של 100% איזופרופנול ומיקרוליטר אחד של גליקו כחול לצינורות והפוך את הצינורות לערבוב לאחר צנטריפוגה נוספת של הצינורות.
הפעם למשך 60 דקות ב 28, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. שפכו את האיזופרופנול, הקפידו לא להפריע לגלולה והוסיפו 150 מיקרוליטר של 70% אתנול לכל צינור. סובב את הצינורות במשך 10 דקות ב 28, 000 פעמים.
G בטמפרטורת החדר. יש לייבש את האתנול באוויר, את כדור ה-DNA ולהשעות מחדש את ה-DNA בנפח מתאים של מאגר tris EDTA. שחזור תלת מימדי זה של חלקיק ויראלי מוכתם בצבע ירוק סייבר במהירות אגרו מדגים כיצד ניתן להשתמש במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי כדי להמחיש ולאשר כי ויריון בודד מתקבל בכל באר לאחר שנלכד והוטמע ב-aros, הכניסה מראה הגדלה גבוהה יותר של החלקיק הנגיפי המבודד.
כאן מוצגת תרשים פרופיל של הקרינה היחסית של החלקיק הנגיפי הבודד המוכתם בתוך חרוז ארוס. סדרת נתונים אחרונה זו מראה כיצד כמעט כל הגנום של למבדה, למעט חמשת זוגות הבסיסים הראשונים, התאושש עבור הנגיף המייצג הזה. הנה תרשים ה-GC עבור הנגיף הבודד.
הגנום שזוהה מוצג. איור זה מציג את מפת הגנום של למבדה. לבסוף, המיפוי של גנום נגיף בודד מוצג עבור החיידקים המבודדים והמוגברים המייצגים פאג' למבדה.
ציר ה-X מראה את מיקום הגנום. ציר Y מציג את אחוז הכיסוי. כאשר מנסים הליך זה, חשוב להשתמש בטכניקה סטרילית ולהקדיש זמן כדי להבטיח שהזיהום יימנע.
בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות על מנת להעריך את הטקסונומיה של הגרסאות המבודדות לפני ריצוף הגנום השלם. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבודד גרסאות בודדות באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, מיקרוסקופיה קונפוקלית והגברת גנום שלם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
גנומיקה של וירוס יחיד (SVG) היא שיטה שנועדה לבודד ולהגדיל את הגנומים של וירונים בודדים מתמסים ויראליים מעורבים. טכניקה זו משתמשת בציטומטריה של זרימה למיון ובשימוש בהגברה רב-מיקומית (MDA) להגברת גנום שלם, ומאפשרת רצף עוקב.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- וירלוגיה
- גנומיקה
- מיקרוביולוגיה
רקע
- בידוד וירונים בודדים מאפשר את המחקר של גנומים ויראליים ללא טיפוח.
- ציטומטריה של זרימה משמשת למיון וירונים על חרוזי אגרוז.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מבצעת אימות ללכידת וירונים בודדים.
- טכנולוגיות רצף גבוה תפוקה משמשות לניתוח גנומי.
מטרת המחקר
- לבודד וירונים בודדים מקונסורציות מעורבות.
- לרצף חומר גנטי לזיהוי וירוסים.
- להגדיל את הרכבת הגנום והערות באמצעות ביואיפורמטיקה.
שיטות ששימשו
- מיון ציטומטרי של זרימה של תמסים ויראליים.
- בידוד חומר גנטי מווירונים שנלכדו.
- הגברה רב-מיקומית (MDA) להגברת ה-DNA.
- רצף גבוה תפוקה לכיסוי גנומי מקיף.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של וירונים בודדים מדגימות מעורבות.
- ייצור DNA מספק לרצף דרך MDA.
- רצף כיסוי גבוה המסייע בהרכבת הגנום.
- יישום טכניקות ביואיפורמטיקה לניתוח נתונים.
מסקנות
- SVG יעיל לחקר גנומים ויראליים בסביבות מגוונות.
- השיטה מפחיתה את גזירת הגנום במהלך העיבוד.
- הביואיפורמטיקה משפרת את ניתוח הווירונים המבודדים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Single Virus Genomics (SVG) enables cultivation-free genomic characterization of individual virions, addressing a critical gap in viral ecology and discovery pipelines. By isolating and amplifying single viral genomes from complex mixtures, SVG supports target de-risking and predictive confidence in early-stage antiviral and phage therapy research. This method enhances portfolio relevance by providing high-resolution genomic data from unculturable viruses, informing mechanistic studies and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral hypotheses by providing genomic context to individual virions from mixed environmental samples.
- Operational Value: Supports biological de-risking through cultivation-free isolation, reducing false negatives in target identification.
- Predictive Value: Generates high-coverage sequencing data that aids in genome assembly and annotation, improving confidence in viral target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-molecular-weight genomic DNA via MDA, enabling reliable downstream sequencing and comparative analysis.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through flow cytometry-based sorting and confocal validation, ensuring reproducible single-virion capture.
- Scalability: Allows processing of thousands of events via flow cytometry, supporting high-throughput screening of viral diversity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viral genome data to preclinical validation by enabling sequence-based taxonomy and functional inference.
- Biomarker Alignment: Supports identification of viral genomic signatures that may correlate with pathogenic potential or host interaction profiles.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in viral target selection through direct genomic evidence.
Pipeline & Workflow Integration
SVG fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and target validation prior to lead identification and preclinical evaluation. Its output—amplified, sequencable viral DNA—directly enables genomic screening and comparative analytics workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating single virons for genomic interrogation, clarifying viral diversity and functional potential in complex communities.
- Screening: Enables assay standardization through flow sorting and MDA amplification, providing reproducible inputs for sequencing-based screening platforms.
- Analytics: Generates quantitative genomic outputs (coverage, GC content, genome maps) that allow cross-condition comparison and variant calling.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing genome-resolved data that can inform biomarker development and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for viral genome characterization across diverse ecosystems, reducing reliance on cultivation-dependent methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in viral target validation by delivering cultivation-free, genome-resolved data from single particles.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through validated single-virion capture via flow cytometry and confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of viral targets, reducing investment in non-viable or poorly characterized candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering high-confidence genomic data that informs advancement decisions in antiviral and phage-derived therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, confocal microscopy, and molecular biology for single-particle handling and amplification.
- Dependent on access to flow cytometers with custom scatter detection and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation, contamination control, and bioinformatic analysis across teams.
- Must account for variability in viral size, density, and staining efficiency when adapting to diverse viral systems or environmental samples.
- Practical limitations include amplification bias and stochastic sampling effects inherent to single-cell/single-virion MDA approaches.
