Name: שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: למד לשלב את הטרנספורטר MalFGK2 בננודיסקים לחקר חלבוני ממברנה. השיטה משלבת חלבוני scaffold, ליפידים וכרומטוגרפיית סינון ג'ל ליצירת חלקיקים יציבים ומסיסים למחקר ביוכימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות. CSC מומן על ידי מלגת דוקטורט ממדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה. FD היא קנדה מחקר קתדרה משנית.

<html> תהליך כינונה מחדש באופן כללי תהליך הבנייה מחדש מתחיל על ידי ערבוב קרום פיגום החלבון (MSP) עם 2 המורכבים MalFGK המטוהר בנוכחות פוספוליפידים דטרגנט-solubilized. הצעד אחריו ההסרה האיטית של חומר הניקוי על ידי חומר הנקרא פוליסטירן סופח-Bio חרוזים או Amberlite (איור 1). התהליך אוטומטי ההרכבה מתרחש ככל הנראה בשל אינטראקציות apolar בין פוספוליפידים הידרופובי, 2 המורכבים MalFGK ועל פני השטח של חלבון amphipathic MSP. המוצר הסופי הוא חלקיק discoid המורכב משתי מולקולות של עטיפת MSP סביב 2 המורכבים MalFGK. החלקיקים הם מופרדים מadducts ואגרגטים על ידי-צנטריפוגה אולטרה וכרומטוגרפיה אנליטית גודל הדרה. החלקיקים מתאפיינים אלקטרופורזה היליד ג &#39;וספקטרוסקופיה פיזור האור דינאמי. כותרת &quot;&gt; 1. הכנת ממברנה פיגום חלבון, MSP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתויג-MSP (גרסת MSP1D1 1) הוא מיוצר מpMSP1D1 פלסמיד בE. coli BL21 (DE3) מושרה בOD 600 ~ 0.5 עם mM β-D-1-thiogalactopyranoside איזופרופיל 0.5 עבור 3 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים נקצרים על ידי צנטריפוגה XG ב 5000 עבור 10 דקות ב 4 ° C וresuspended בTSG10 חיץ המכיל פלואוריד phenylmethanesulfonyl מיקרומטר 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי lysed עם עיתונות צרפתית (3x) בשעת 8000 psi והחומר המסיס יוסר על ידי צנטריפוגה XG ב 5000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. החלק מסיס המכיל MSP מבודד על ידי צנטריפוגה החרדית ב125.000 XG עבור 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSP מטוהר על ידי ניקל chelating כרומטוגרפיה באמצעות ~ 1.5 המ&quot;ל Ni Sepharose HP בTSG10 חיץ. מזהמים נשטפים עם TSG10 מאגר המכיל 50 המ&quot;מ imidazole. MSP הוא eluted עם TSG10 חיץ המכיל 600 מ&quot;מimidazole. החלבון המטוהר הוא דיאליזה בTSG10 חיץ ומאוחסן ב-70 ° C בריכוז חלבון של ~ 10-15 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li></ol> 2. הכנת 2 קומפלקס MalFGK <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 המורכבות MalFGK, מתויג ב- C-הסופי של MalK, בא לידי ביטוי מפלסמיד pBAD22-FGK בE. coli BL21 (DE3), ועורר בOD 600 ~ 0.5 עם 0.2 L-arabinose% עבור 3 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות תמוגה תא וצנטריפוגה כמו בשלב 1.3, קרום הכדור הוא resuspended בTSG20 חיץ בריכוז סופי של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. חומר solubilized עם 1% w / v-n-β-dodecyl maltopyranoside (DDM) ל3 שעות ב 4 ° C בטלטול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החומרים מסיסים יוסרו על ידי-צנטריפוגה אולטרה כמו בשלב 1.3 ו supernatant המכיל solubilized 2 מורכבים MalFGK נאסף ומטוהר כמו בשלב 1.4, אך ללא דיאליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Furtheטיהור r מושגת על ידי כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל במאגר TSGD על Superdex 200 HR 10/300 עמודה בקצב זרימה של 0.5 מ&quot;ל / דקה. </li></ol> 3. הכנת פוספוליפידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה שומנים כוללים coli לחלץ מומס בכלורופורם מופרדים ל1000 aliquots nmol בשפופרות microfuge מתברגות. הממס מתאדה תחת זרם עדין של חנקן והתייבש עוד לילה בתא ייבוש ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרט השומנים מומס בחיץ TS בריכוז 5 nM סופי וvortexed נמרץ וsonicated. השומנים המומסים יופיעו קצת אטומים בשל insolubility הכללי שלהם במאגר TS מימי, אבל הם צריכים להישאר בהשעיה. DDM מתווסף לריכוז סופי של 0.5% (~ 10 מ&quot;מ), שבפתרון הופך ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת השומנים ממוקמת באמבט מים ודופק sonicated ל5 פעמים ל~ 5 שניות. תערובת השומנים מאוחסנת ב 4 ° C למקסימום של פיפי 1יא. </li></ol> 4. הכנת ביו חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 10-15 מ&quot;ל (נפח יבש) Bio-חרוזים ממוקם לתוך צינור מ&quot;ל 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החרוזים נשטפים ברציפות עם 50 מ&quot;ל של מתנול 100%, 95% אתנול, milliQ H 2 O, ולבסוף חיץ TS (פעמים כל אחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזי השטף הם מאוחסנים ב 4 ° C ב~ חיץ 10 מ&quot;ל TS. </li></ol> 5. כינון Nanodisc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSP מדולל במאגר TSGD בריכוז הסופי של ~ 7 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(~ 0.3 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ 2 מתוך 2 nmol מורכב MalFGK מטוהרים מעורבבים בחלבון: יחס שומנים של 1:3:60 או 1:3:400 במאגר TSGD: MSP. הריכוז הסופי הוא 6 MalFGK 2, MSP 18 מיקרומטר ושומני 360 מיקרומטר (1:3:60) או 2.4 מ&quot;מ (שומני 1:3:400) מיקרומטר. הנפח הסופי הוא 300 μl. ריכוז DDM הסופי הוא 0.08% (~ 1.6 מ&quot;מ). הריכוז הסופי של גליצרול תלוי בכמות השומנים הוסיפו אך נשאר סביב 5-10% v / נ </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ 50 μl של השעית יו חרוז מתווסף לצינור ואת התערובת הוא מודגרות הלילה על שולחן נדנדה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את החרוזים מכילים משקעים על ידי כוח הכביד ופתרון pipetted דרך קצה צר להימנע מחרוזי Bio ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדול משקעים יוסרו על ידי-צנטריפוגה אולטרה ב100.000 XG במשך 20 דקות. הדסקיות מטוהרות על ידי כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל כמו בשלב 2.4 בTSG10 חיץ. ברים המכילים את הדיסקים הם נקווים וaliquot צריך להיות מחדש הזריק באותה עמודת סינון ג&#39;ל כדי לבחון את היציבות של ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את הדיסקים המטוהרים ניתן לאחסן ב -70 מעלות צלזיוס במשך תקופה ממושכת של זמן. בעקבות הפשרה על קרח, את הדיסקים צריכים להיות כפופים לצנטריפוגה אולטרה כמו בשלב 5.5 להסיר פוטנציאל משקעים. Aliquot צריך להיות מנותח על ידי כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל על מנת להבטיח שצבירה או משקעים משמעותיים לא התרחשה במהלך ההפשרהתהליך. </li></ol> 6. ג&#39;ל אלקטרופורזה יליד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מיקרומטר של nanodiscs (~ 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הם נותחו על ידי ילידי 6, 7 (טריס-HCl pH 8.8, 4-12%) על מנת להעריך את איכות הכינון מחדש (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכריכה של זכר (1 מיקרומטר) לMalFGK 2 המורכבים-לשחזר בnanodiscs גם מוערך על ידי-PAGE ילידים (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אלקטרופורזה, ג&#39;ל מוכתם בCoomassie כחול למשך 10 דקות, וdestained ל~ 1 שעה. </li></ol> 7. פיזור אור דינמי (DLS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nanodiscs מטוהר על ידי כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל כמו בשלב 2.4 בTSG10 חיץ באמצעות Superdex 200 HR 10/300 עמודה בקצב זרימה של 0.1 מ&quot;ל / דקה. ברים המכילים nanodiscs הם נקווים ומרוכזים ל~ 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עם מסנן צנטריפוגלי Amicon. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם מסונן פעמים (0.22 מיקרומטר לסנן) לפני הניתוח על ידי DLS באמצעותDynaPro nanostar מכשיר (וויאט טכנולוגיה) בנפח קובט פנימי μl 1 קוורץ. נתונים מותאמים באמצעות דינמיקת התוכנה (וויאט טכנולוגיה) כדי להעריך את הקוטר ומשקל מולקולרי של החלקיקים. </li></ol> 8. מדידות ATPase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילות של ATPase MalFGK nanodiscs 2-משוחזר נקבעה באמצעות בדיקת colorimetric 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מיקרומטר של דיסקים מטוהרים וmM ATP 1 מעורבב עם כמויות הולכות וגדלות של זכר וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. השחרור של פוספט האורגני נמדד ב660 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכמות של פוספט שוחרר בהשוואה לעקומת סטנדרט שנוצרה עם פתרון אחיד זרחן. </li></ol> 9. נציג תוצאות את nanodiscs מטוהר על ידי כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל (איור 2 א, משמאל). הכרומתוגרמה מראה כי הרוב המכריע של ד המשוחזרelute ISCS (עקבות שחורות) כשיא יחיד, ואילו דיסקים שנעשו עם שומנים עודפים (אדומות עקבות) elute בנפח החלל וכסדרה של פסגות רחבות. איכות nanodiscs מנותחת נוסף על ידי אלקטרופורזה ג&#39;ל יליד וספקטרוסקופיה פיזור אור הדינמית (DLS). דיסקים כראוי משוחזרים נודדים כלהקה חדה בג&#39;ל ואילו אלה משוחזרים בנוכחות עודפת של שומנים להעביר כלמרוח (2A איור, מימין). ניתוח על פי DLS מראה כי האוכלוסייה היא הומוגנית הדיסק עם קוטר ממוצע של 11.4 ננומטר (איור 2 ב &#39;). הדיסקים המשוחזרים יש משקל מולקולרי לכאורה של 215 kDa מבוסס על קירוב DLS. דגימות מחדש בנוכחות של שומנים עודפים הציג מופצים באופן נרחב רדיוס סביב 100 ננומטר, שהוא אופייני לדוגמאות הלא הומוגנית. האיכות של 2 המורכבים MalFGK מוערכת על ידי אלקטרופורזה היליד ג &#39;ופעילותה על ידי ATPaseמדידות (איור 3). זכר החלבון המחייב מלטוז נקשר עם זיקה גבוהה ל2 טרנספורטר MalFGK 9, 10. שימוש הלא denaturing אלקטרופורזה ג&#39;ל, ניתן לזהות מורכב בין הזכר וMalFGK 2 (איור 3 א). הגירוי של פעילות MalK 2 ATPase ידי זכר הוא שמוצג באיור 3 ב. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. תרשים זרימה אופייני לפרוטוקול הכינון מחדש. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. בקרת איכות של תכשיר nanodisc. א ניתוח סינון ג&#39;ל (Superdex 200 HR 10/300 טור) של nanodiscs מחדש בשיעור נמוך שומנים (1/3/60; עקבות שחורות) או יחס שומנים גבוה (1/3/400; עקבות אדומות). ג&#39;ל אלקטרופורזה יליד אותה הכנת דיסק. מולסמני משקל ecular בkDa הם ציינו. ניתוח ב &#39;פיזור אור הדינמי של אותו תכשיר דיסק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ניתוח MalFGK החלקיקים 2-nanodisc. א ניתוח שינוי ג&#39;ל לזכר דגר עם כמויות הולכות וגדלות של חלקיקי MalFGK 2-nanodisc. פעילות ב ATPase של MalFGK 2-nanodisc חלקיקים כפונקציה של ריכוז גברי.

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
<li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li>
<li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li>
<li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li>
<li>Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li>
<li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li>
<li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li>
<li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li>
<li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li>
<li>Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li>
<li>Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+%28BBA%29%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li>
<li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מתארים הליך פשוט לכינון מחדש של טרנספורטר מלטוז לnanodiscs. טרנספורטר הוא ATPase הפעיל והאינטראקציה עם זכר השותף מחייב המסיס ניתן ליצור מחדש (איור 3). הכינון מחדש המוצלח של טרנספורטר לnanodiscs לפתוח את הדרך לניתוח biophysical וביוכימיים נוספים. מעניין במיוחד יהיה הניתוח השיטתי את פעילות תחבורת מלטוז בחומר הניקוי וMalK ATPase, יפוזום וnanodiscs. מובילי ABC לשנות תצורות במהלך מחזור התחבורה אבל התרומה של שומנים לשינויים קונפורמציה אלה יישארו כדי להיחקר. <p c...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 50K מסנן צנטריפוגלי </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> עקוב הפרוטוקול של היצרן לשימוש נכון </td></tr><tr><td> Bio-חרוזי SM-2 כושר ספיג </td><td> Bio-Rad </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> חיידק שומנים כלל </td><td> שומני פולאר AVANTI </td><td> 100500C </td><td> מומס בכלורופורם, לטפל לפי צורך ממס אורגני </td></tr><tr><td> Ni sepharose HP שרף </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון סטנדרטי זרחן </td><td>סיגמה אולדריץ </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים ספציפיים I. טבלה. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> הרכב </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DDM המניות </td><td> 10% w / v DDM </td><td> Resuspend במים וחנות milliQ ב -20 ° C </td></tr><tr><td> 2 מניות MalFGK </td><td> 1-2 מ&quot;ג / מ&quot;ל 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ&quot;מימ NaCl 10% גליצרול v / v 0.03% w / v DDM </td><td> חנות ב -70 ° C לאחר טיהור </td></tr><tr><td> MSP המניות </td><td> 10-15 מ&quot;ג / מ&quot;ל 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ&quot;מימ NaCl 10% גליצרול v / v </td><td> חנות ב -70 ° C לאחר טיהור ב&lt; 1 aliquots המ&quot;ל ולהימנע ממחזורים מוגזמים הקפאה / פשרה </td></tr><tr><td> מניית פוספוליפידים </td><td> 5 nM E. coli סך שומנים 0.5% w / v (10 מ&quot;מ) DDM 50 mM טריס-HCl, 7.9 pH 50 mM NaCl </td><td> חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך השבוע 1 </td></tr><tr><td> TS חיץ </td><td> 50 mM טריס-HCl, 7.9 pH 50 mM NaCl </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 חיץ </td><td> 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ&quot;מימ NaCl 10% גליצרול v / v </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 חיץ </td><td> 50 mM טריס-HCl, pH8 100 המ&quot;מימ NaCl 20% גליצרול v / v </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> חיץ TSGD </td><td> 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ&quot;מימ NaCl 10% גליצרול v / v 0.03% w / v DDM </td><td> חנות ב 4 ° C ולהוסיף DDM ממש לפני השימוש </td></tr><tr><td colspan="3"> טבלה השנייה. פתרון מתכונים. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר abc לחלקיקי ליפידים nanodisc

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodisc הוא חלקיק discoidal (~ 10-12 ננומטר גדול) שחלבוני קרום מלכודת תיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. Nanodisc היא אופציה אטרקטיבית במיוחד ללימוד חלבונים בממברנה, במיוחד בהקשר של יחסי גומלין יגנד לרצפטור. השיטה החלוצית שSligar ועמיתים מתבססים על המאפיינים של amphipathic מהונדס מאוד סליל חלבון פיגום נגזר מאפוליפופרוטאין A1. הפנים ההידרופובי של חלבון פיגום אינטראקציה עם רשתות הלוואי acyl השומן של bilayer השומנים ואילו אזורי הקוטב להתמודד בסביבה המימית. אנליזות של חלבוני קרום בnanodiscs יש יתרונות משמעותיים על פני יפוזום מפני החלקיקים קטנים, הומוגנית ומסיסים במים. בנוסף, שיטות ביוכימיות וbiophysical השמורים בדרך כלל לחלבונים מסיסים יכולות להיות מיושם, ומשני הצדדים של הקרום. בפרוטוקול החזותי הזה, אנו מציגים כינון מחדש צעד אחר צעד וגם characטרנספורטר terized חיידקי ABC, 2 המורכב גברי MalFGK. ההיווצרות של הדיסק היא תהליך הרכבה עצמית שתלוי באינטראקציות הידרופוביות המתרחשות במהלך ההסרה ההדרגתית של חומר הניקוי. אנו מתארים את הצעדים החיוניים ואנו מדגישים את החשיבות של בחירה נכון יחס חלבון לשומנים בדם, במטרה לצמצם את ההיווצרות של אגרגטים וחלקיקים גדולים יותר polydisperse יפוזום דמויים. איכות פשוט שולטת כגון כרומטוגרפיה ג&#39;ל סינון, ג&#39;ל אלקטרופורזה יליד וספקטרוסקופיה פיזור האור דינאמי להבטיח כי את הדיסקים כבר מחדש כראוי.

Nanodiscs הם חלקיקי discoid קטנים המשלבים חלבונים בממברנה לתיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. אנו מספקים פרוטוקול חזותי המציג את שילוב צעד אחר הצעד של טרנספורטר MalFGK2 לתוך דיסק.

שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשלב נשא מסוג A, b, C. במקרה זה, נשא המלטוז malf GK two, לתוך חלקיקי ננו-דיסק (nano disk) של ממברנה ממיסים. דבר זה מושג תחילה על ידי ערבוב חלבון פיגום הממברנה MSP, עם הנשא והכמות המתאימה של ליפידים במיסלים של דטרגנט.השלב השני הוא הוספת חרוזי פוליסטירן וערבוב עדין של התערובת במנער (rocker) למשך הלילה; הדטרגנט נספג בהדרגה על גבי החרוזים, מה שמאפשר את היווצרות חלקיקי הננו-דיסק. לאחר מכן, החרוזים מוסרים באמצעות שיקוע. השלב הסופי הוא הפרדת הדיסקים שנוצרו כהלכה מאגרגטים ומחלבוני פיגום (scaffold proteins) שלא הורכבו, באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל.לבסוף, איכות הדיסקים מוערכת באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל טבעי (native gel electrophoresis) או ספקטרוסקופיה של פיזור אור. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון ליפוזומים, הוא שחלבונים ממברנליים ודיסקים הם מסיסים לחלוטין בתמיסה מימית. בנוסף, הדומיינים החלבוניים נגישים כעת משני הצדדים.מכיוון שכעת אין יותר מדור של ממברנה, תוך שימוש בחלבוני פיגום של ממברנה באורכים שונים, יכולתי ללכוד ולחקור את מצבי הרצועה השונים של חלבוני ממברנה. חשוב מכך, שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הפרוטאומיקה של ממברנות, כגון זיהוי של שותפי קישור חדשים של נשאי a, b, C. למעשה, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות רחב יותר לעבר הטיפול הרפואי, שכן היא יכולה לסייע בגילוי של מפעילים או מעכבים של חלבוני ממברנה וקולטנים.למרות ששיטה זו נראית פשוטה, יש לנקוט משנה זהירות בבחירת היחס הנכון בין החלבון לליפידים. בדרך כלל, מי שאינם בקיאים בשיטה זו מתקשים בחישוב היחס המולרי הנכון או בביצוע הבקרות המתאימות להבטחת איכות ההכנה. לפיכך, הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה מאוד עבור סטודנטים חדשים ללימוד השלבים השונים והקשיים הפוטנציאליים.כדי להתחיל, גדלו MSP עם תג hexa histidine בזן e coli BL 21 DE3 מהפלסמיד P MSSP 1D1; גרו את ייצור החלבון כאשר הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 nanometers היא כ-0.5 למשך שלוש שעות ב-37 degrees Celsius, ואספו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-5,000 Gs למשך 10 דקות ב-4 degrees Celsius. השעיו את המשקע בבופר TSG 10 המכיל 100 micromolar PMSF; פרקו את התאים באמצעות French press שלוש פעמים ב-8,000 PS.I. הסירו את החומר הבלתי מסיס על ידי סנטריפוגציה ב-5,000 Gs למשך 10 דקות ב-4 degrees Celsius. לאחר מכן, בודדו את הפракציה המסיסה המכילה את ה-MSP באמצעות אולטרסנטריפוגציה ב-125,000 Gs למשך 45 דקות.טהרו את ה-MSP באמצעות כרומטוגרפיית ניקל קלטינג תוך שימוש ב-1.5 מיליליטר בערך של nickel seros high performance בבופר TSG 10. שטפו את המזהמים באמצעות בופר TSG 10 המכיל 50 millimolar ILE. לאחר דיאליזה, אלוטו את ה-MSP באמצעות בופר TSG 10 המכיל 600 millimolar I midaz.ניתן לשמור את החלבון המטוהר בבופר TSG 10 MSP בטמפרטורה של 70- מעלות צלזיוס ובריכוז חלבון של כ-10 עד 15 mg/mL. קומפלקס MALF GK 2, בעל תג His בקצה ה-C של MAL K, מובע מהפלסמיד PED 22 FG K שגודל במאבקי e coli מסוג BL 21 DE 3. ייצור החלבון מופעל כאשר הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 nm היא כ-0.5, באמצעות 0.2% L-Arabs למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לאחר ליזיס של התאים וסנטריפוגציה.כפי שנעשה קודם לכן, נשעה את משקע הממברנה בבופר TSG 20 עד לריכוז סופי של חמישה מיליגרם למילליטר. לאחר מכן, נמיס את החומר בעזרת GDM בריכוז 1% משקל לנפח למשך שלוש שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין. נסיר את החומר הבלתי מסיס באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה, כפי שבוצע בניקוי של MAL FTK two.לאחר מכן, אספו את העליון (supernatant) המכיל את קומפלקס mal FTK two המומס, וטהרו אותו שוב באמצעות כרומטוגרפיית ניקל קלטורית. טהרו את הקומפלקס עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל (gel filtration chromatography) בבופר TSGD בעזרת עמודה מסוג SUEx 200, HR ten three hundred בקצב זרימה של 0.5 milliliters per minute. להכנת פוספוליפידים, תמצית ליפידים כוללת של e coli המומסת בכלורופורם מופרדת ל-1000 מנות של anomal בשפופרות מיקרו-צנטריפוגה עם פקק הברגה; אידו את הממס תחת זרם עדין של חנקן ויבשו עוד יותר למשך לילה בוואקום.ייבשו כעת, המיסו את שכבת השומנים בבופר TS בריכוז סופי של five NMO, ערבלו במיקסר (vortex) בעוצמה ולאחר מכן בצעו סוניקציה בפולסים חמש פעמים למשך כחמש שניות. השומנים המומסים ייראו עכורים מעט בשל חוסר המסיסות הכללי שלהם בבופר TS מימי, אך הם צריכים להישאר בתמיסה. הוסיפו DDM עד לריכוז סופי של 0.5%. בשלב זה, התמיסה תהפוך שקופה; הניחו את תערובת השומנים במקלח מים ובצעו סוניקציה בפולסים חמש פעמים למשך כחמש שניות.ניתן לשמור את תערובת הליפידים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שבוע לכל היותר. להכנת ה-bio beads, העבירו כ-10 עד 15 milliliters של bio beads למבחנה של 50 milliliter. ראשית, שטפו את החרוזיים ב-50 milliliters של 100%methanol.הניחו לחרוזים לשקוע בכבידה ולאחר מכן שפכו בעדינות את התמיסה. חזרו על התהליך פעם אחת עם methanol, ולאחר מכן פעמיים עבור 95%Ethanol, מי milli Q ובסוף TS buffer. התחילו את ה-nano discrete constitution על ידי דילול של MSP ב-TSGD buffer לריכוז סופי של כ-7 mg/mL או 0.3 mM.כדי להבטיח ניסוי מוצלח, חשוב לבחור את היחסים הנכונים של הליפידים והחלבונים שיעורבבו יחד. ערבבו בערך two M של purified malf GK two complex ביחס של חלבון ל-MS P לליפיד של 1:3:60 בבफर TSGD לנפח סופי של 300 µL. כאן, מוכנה גם דגימה של עודף ליפידים ביחס של 1:3:400 כביקורת שלילית. הוסיפו למבחנה 50 µL של תמיסת bio bead והדגרירו את התערובת למשך לילה על שולחן נדנדה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, שקיעו את החרוזים באמצעות כבידה. לאחר שהחרוזים שקעו, שאבו את התמיסה באמצעות טיפ צר כדי להימנע ככל האפשר מהסעת bio beads.הסר משקעים גדולים באמצעות אולטראצנטריפוגציה ב-100,000 GS למשך 20 דקות. המשך בטיהור הדיסקים באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל כפי שבוצע קודם לכן בבופר TSG 10. לאחר מכן, הזרק Eloqua לאותה עמודת סינון ג'ל כדי לבחון את יציבות התכשיר.לאחר מכן, אגדו את הפראקציות המכילות את הדיסקים. את איכות ההכנה מעריכים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נטיבי (native gel electrophoresis). נתחו ריכוז של one micromolar של ננו-דיסקים כדי להעריך את איכות השחזור.העריכו גם את קישור ה-mal E למתחם mal ftk two ששוחזר בתוך ננו-דיסקים. לאחר אלקטרופורזה, צבעו את הג'ל ב-kumasi blue למשך 10 דקות ובצעו הסרת צבע למשך כשעה. לביצוע פיזור אור דינמי או DLS, טהרו תחילה את הננו-דיסקים באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל כפי שנעשה קודם לכן, תוך שימוש בעמודה מסוג SUEx 200 HR ten three hundred בקצב זרימה של 0.1 milliliters per minute.אגדו את הפראקציות המכילות nano discs, ורכזו אותן לכ-10 mg/mL באמצעות מסנן צנטריפוגי AmCon. לאחר מכן, סננו את הדגימה פעמיים. בצעו ניתוח בשיטת DLS באמצעות מכשיר dynapro nano star בנפח פנימי של 1 µL בכוורית קוורץ (quartz cuvette).באמצעות תוכנה דינמית להערכת הקוטר והמשקל המולקולרי של החלקיקים, קבעו את פעילות ה-ATPase של דיסקים ננומטריים משוחזרים של mal FTK 2 באמצעות בדיקה כולורמטרית. ראשית, ערבבו 1 µM של דיסקים מטוהרים ו-1 mM של ATP עם כמויות עולות של mal e. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות.לאחר מכן, מדדו את שחרור הפוספט anorganic באורך גל של 660 ננומטר. השוו את כמות הפוספט ששוחחר לעקומת סטנדרט שהופקה באמצעות תמיסת סטנדרט של זרחן. את הnano discs מטהרים באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל.הכרומטוגרמה מראה כי רוב הדיסקים שהורכבו מחדש נשטפים כפיסגה בודדת, בעוד שדיסקים שהוכנו עם עודף ליפידים נשטפים בנפח המת >, וכסדרה של פיסגות רחבות; איכות הכנת הדיסקים נותחית בהמשך באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נטיב (native gel electrophoresis) – דיסקים שהורכבו מחדש עם כמות מוגבלת של ליפידים נעים כפס רחב וחד בג'ל הנטיב, בעוד שאלו שהורכבו מחדש בנוכחות עודף ליפידים נעים כמריחות. ניתוח באמצעות DLS מראה כי אוכלוסיית הדיסקים היא הומוגנית עם רדיוס ממוצע של 5.0 nanometers. בהתבסס על קירוב ה-DLS, לדיסקים שהורכבו מחדש יש משקל מולקולרי נראה של 215 kilodaltons; דגימות שהורכבו מחדש בנוכחות עודף ליפידים מציגות רדיוסים בעלי התפלגות רחבה סביב 100 nanometers, דבר האופייני לדגימות שאינן הומוגניות.הפעילות של קומפלקס MAL FTK two מוערכת על ידי מדידת קצב הידרוליזת TP והזיקה לשותפים למעורבות כגון חלבון קושר המלטוז, MAL E. חלבון MAL E נקשר בזיקה גבוהה לנשא MAL FTK two באמצעותת אלקטרופורזה של ג'ל לא דנטורנטי. ניתן לזהות קומפלקס בין MAL E לבין MAL FTK two; כאן מוצגת העמדה של פעילות MAL KA TPA על ידי MAL E כפונקציה של ריכוז MAL E.הכנת הננו-דיסק היא פשוטה יחסית, אך סטיות קטנות מהתנאים האופטימליים עלולות להוביל לצבירה (aggregation) בלתי הפיכה של חלבונים; לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בפחות משני ימים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור את חשיבות הבחירה ביחס נכון בין החלבון לליפידים, שכן כמות עודפת של ליפידים תוביל להיווצרות של חלקיקים גדולים דמויי ליפוזומים בעלי פולי-דיספרסיות. בשל כך, חיוני לנתח בקפידה את איכות החומר המשוחזר באמצעות טכניקות שאינן סינון ג'ל, כגון ספקטרוסקופיה של פיזור אור, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית, או באופן פשוט יותר, אלקטרופורזה של ג'ל נטיבי (native gel electrophoresis).זכרו, כי סוג הפוספוליפיד המרכיב את הדיסק, כמו גם סוג חלבון הפיגום של הממברנה (membrane scaffold protein), עשויים להשפיע על יעילות השחזור. לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שקיבלתם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק ננו-דיסקים ממיסים והומוגניים המכילים את חלבון הממברנה שבחרתם. בהצלחה בניסוייכם.

a-step-step-method-for-reconstitution-an-abc-transporter-into

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הליכים לכינון מחדש של אב טיפוס ערוץ אשלגן מתח מגודרת לממברנות שומנים בדם מלא מתוארים. הערוצים המשוחזרים מתאימים למבחנים ביוכימיים, הקלטות חשמל, הקרנת יגנד ומחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים. שיטות אלה עשויות להיות יישומים כלליים למחקרים המבניים ותפקודיים של חלבוני קרום אחרים.

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

נתמכת solid, נטול חלבון, כפול פוספוליפיד bilayer ממברנות (DLBM) יכולה להיהפך מורכב ודינמי, השומנים nanotube רשתות, יכול לשמש מלמטה למעלה 2D, דגמי רשתית תוך-פלזמית.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

היתוך מיטוכונדריאלי הוא תגובה הוםוסטטית חשובה הבסיסית לדינמיקה המיטוכונדריאלית. מתואר כאן היא מערכת איסוף חוץ תוך כדי לימוד היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שיכול לפתור רצועה קרום, עגינה, המיתוך, ופתיחת נקבוביות. הרב-תכליתיות של גישה זו בחקר מערכות קרום התא נדון.

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

כאן אנו מתארים ייצור ואפיון של חומרים ביו-אקטיביים המכילים ננו-דיסקים. ננודיסקים של Amphotericin B נלקחים כדוגמה לתיאור הפרוטוקול בצורה מדורגת.

ניסוח ואפיון חומר ביו-אקטיבי המכיל ננודיסקים

פרוטוקול זה מתאר מערך להתגבשות של טרנספורטר הסטרול ABCG5/G8. ABCG5/G8 משוחזר לאופניים לצורך התגבשות טיפה תלויה. הפרוטוקול אינו דורש חומרים או מצעים מיוחדים, מה שהופך אותו לנגיש וקל להתאמה בכל מעבדה לקביעת מבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.

התגבשות ABCG5/G8 בסביבת ביצלה ליפידית לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.

בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

מחקר זה מתאר את ההליך לשיקום חלבון הממברנה הרגיש לחומצה ב-TWIK, ערוץ K+ 2 (משימה 2) לננו-דיסקים. ההרכבה המוצלחת אושרה על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרון חד-חלקיק, שהניב ממוצעים דו-ממדיים מוגדרים היטב.

טכניקה לייצוב חלבוני ממברנה בננו-דיסקים

למד לשלב את הטרנספורטר MalFGK2 בננודיסקים לחקר חלבוני ממברנה. השיטה משלבת חלבוני scaffold, ליפידים וכרומטוגרפיית סינון ג'ל ליצירת חלקיקים יציבים ומסיסים למחקר ביוכימי.

שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

גלה סרטונים נוספים