שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשלב טרנספורטר A, b, C. במקרה זה, טרנספורטר המלטוז מאלף GK שניים לחלקיקי ננו דיסק ממברנה מסיסים. זה מושג על ידי ערבוב תחילה של חלבון פיגום הממברנה MSP, עם הטרנספורטר והכמות הנכונה של שומנים בחומר הניקוי mycells.

השלב השני הוא הוספת חרוזי פוליסטירן וכדי לנדנד בעדינות את התערובת למשך הלילה, חומר הניקוי נספג בהדרגה על החרוזים, ומאפשר היווצרות חלקיקי דיסק הננו. לאחר מכן, החרוזים מוסרים על ידי משקעים. השלב האחרון הוא להפריד את הדיסקים שנוצרו כהלכה מאגרגטים וחלבוני פיגומים לא מורכבים על ידי כרומטוגרפיה של סינון ג'ל.

לבסוף, איכות הדיסקים מוערכת על ידי אלקטרופורזה ג'ל מקורית או ספקטרוסקופיה של פיזור אור. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות כמו ליפוזומים, הוא שחלבוני הממברנה והדיסקים מסיסים לחלוטין בתמיסה מימית. בנוסף, תחומי החלבון נגישים כעת משני הצדדים.

מכיוון שעכשיו אין יותר תא ממברנה באמצעות חלבוני פיגום ממברנה באורכים שונים, הצלחתי ללכוד ולחקור את מצבי הרצועה השונים של חלבוני הממברנה. והכי חשוב, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפרוטאומי של הממברנה, כגון זיהוי שותפי קישור חדשים של טרנספורטרים a, b, C. למעשה, ההשלכות של טכניקה זו מתרחבות עוד יותר לכיוון הטיפול מכיוון שהיא יכולה לסייע בגילוי מפעילים או מעכבים של חלבוני ממברנה וקולטנים.

למרות ששיטה זו נראית פשוטה, יש לנקוט משנה זהירות בבחירת יחס השומנים החלבוני הנכון. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו תוך שהם נאבקים בחישוב יחס התבנית הנכון או ביצוע הבקרה הנכונה המבטיחה את איכות התכשיר. לכן, הדגמה ויזואלית של שיטה זו שימושית מאוד לתלמיד חדש ללמוד את השלבים השונים והקשיים הפוטנציאליים.

כדי להתחיל גרו הקסה היסטידין מתויג MSP בזן אי קולי BL 21 DE שלוש מהפלסמיד P MSSP 1D ייצור חלבון מושרה אחד כאשר הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 ננומטר היא כ-0.5 למשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס, קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב-5,000 Gs למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השהה מחדש את הגלולה במאגר TSG 10 המכיל 100 כיני PMSF מיקרומולריות, התאים בלחיצה צרפתית שלוש פעמים ב-8,000 PS. אני מסיר את החומר הבלתי מסיס על ידי צנטריפוגה ב-5,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן בודד את החלק המסיס המכיל את ה-MSP על ידי אולטרה-צנטריפוגה ב-125,000 גרם למשך 45 דקות.

טהר את ה-MSP על ידי כרומטוגרפיה של ניקל כלאט באמצעות כ-1.5 מיליליטר של סרוס ניקל ביצועים גבוהים במאגר TSG 10. שטפו את המזהמים עם מאגר T SG 10 המכיל 50 מילי-מולרית אליטה ILE. ה-MSP עם מאגר TSG 10 המכיל 600 מילי-מולרי I midaz לאחר דיאליזה.

ניתן לאחסן את החלבון המטוהר ב-TSG 10 buffer MSP במינוס 70 מעלות צלזיוס וריכוז חלבון של כ-10 עד 15 מיליגרם למיליליטר. קומפלקס MALF GK two, המתויג בקצה C של MAL K, מתבטא מפלסמיד. PED 22 FG K שגדל בזן אי קולי BL 21 DE שלושה גורמים לייצור חלבון כאשר הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 ננומטר היא כ-0.5 עם 0.2% ליטר ערבים למשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס לאחר ליזיס תאים וצנטריפוגה.

כמו קודם, אנו משעים את גלולת הממברנה במאגר TSG 20 לריכוז סופי של חמישה מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, יש להמיס את החומר במשקל של 1% לנפח GDM למשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס בניעור עדין. הסר את החומר הבלתי מסיס על ידי אולטרה-צנטריפוגה באשר לטיהור MAL FTK שתיים.

לאחר מכן אסוף את הסופרנטנט המכיל את קומפלקס ה-FTK השני המסיס וטהר שוב עם כרומטוגרפיה של ניקל. לטהר עוד יותר את הקומפלקס על ידי כרומטוגרפיה של סינון ג'ל במאגר TSGD על SUEx 200, HR עשר שלוש מאות עמודות בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. להכנת פוספוליפידים, תמצית שומנים כוללת של אי קולי המומסת בכלורופורם מופרדת ל-1000 חריגות בצינורות מיקרופיש של מכסה בורג מאדים את הממס תחת זרם עדין של חנקן ונוסעים הלאה בן לילה בוואקום.

ייבוש לאחר מכן, ממיסים את סרט השומנים במאגר TS בריכוז סופי של חמישה NMO ומערבולת נמרצת ואז דופק סוניקט חמש פעמים למשך כחמש שניות. השומנים המומסים ייראו מעט אטומים בשל חוסר המסיסות הכללי שלהם במאגר TS מימי, אך עליהם להישאר בתרחיף. הוסף DDM לריכוז סופי של 0.5%בשלב זה, התמיסה תתבהר למקם את תערובת השומנים באמבט מים ולפעום סוניקט חמש פעמים למשך כחמש שניות.

ניתן לאחסן את תערובת השומנים בארבע מעלות צלזיוס למשך שבוע לכל היותר. להכנת חרוזי הביו הניחו כ-10 עד 15 מיליליטר חרוזי ביו לתוך צינור של 50 מיליליטר. ראשית, שטפו את החרוזים עם 50 מיליליטר של 100% מתנול.

הניחו לחרוזים להתיישב בכוח הכבידה ואז שפכו בעדינות את התמיסה. חזור על התהליך פעם אחת עבור מתנול ולאחר מכן פעמיים כל אחד עבור 95% אתנול מילי-Q מים ולבסוף מאגר TS. התחל במבנה ננו בדיד על ידי דילול MSP במאגר TSGD לריכוז הסופי של כשבעה מיליגרם למיליליטר או 0.3 מילימולר.

כדי להבטיח ניסוי מוצלח, חשוב לבחור את היחסים הנכונים של שומנים וחלבונים שיש לערבב יחד. מערבבים כשני M של מלף מטוהר GK שני קומפלקסים ביחס חלבון ל-MS P לשומנים של אחד לשלושה עד 60 במאגר TSGD לנפח סופי של 300 מיקרוליטר כאן, דגימה של עודף שומנים ביחס של אחד לשלושה ל-400 מוכנה גם כבקרה שלילית ב-50 מיקרוליטר של תרחיף חרוז ביו לצינור ודוגרים את התערובת למשך הלילה על שולחן נדנדה בארבע מעלות צלזיוס למחרת, משקע את החרוזים על ידי כוח הכבידה. לאחר שהחרוזים התייצבו, צינור בתמיסה דרך קצה צר כדי להימנע מכמה שיותר חרוזי ביו

הסר משקעים גדולים על ידי אולטרה-צנטריפוגה בטמפרטורה של 100, 000 GS למשך 20 דקות. המשך לטהר את הדיסקים על ידי כרומטוגרפיה של סינון ג'ל כפי שבוצע קודם לכן במאגר TSG 10. לאחר מכן, הזריק Eloqua על אותו עמוד סינון ג'ל כדי לבדוק את יציבות התכשיר.

לאחר מכן אסוף את השברים המכילים את הדיסקים. איכות התכשיר מוערכת על ידי אלקטרופורזה ג'ל מקורית. לנתח מיקרו-מולרית אחת של דיסקות ננו כדי להעריך את איכות הבנייה מחדש.

העריכו גם את הקישור של mal E ל-mal ftk שני קומפלקסים ששוחזרו בדיסקות ננו. לאחר אלקטרופורזה, יש לצבוע את הג'ל בכחול קומאסי למשך 10 דקות ולעכב כשעה. כדי לבצע פיזור אור דינמי או DLS יש לטהר תחילה דיסקי ננו על ידי כרומטוגרפיה של סינון ג'ל כמו קודם, באמצעות SUEx 200 HR עשר שלוש מאות עמודות בקצב זרימה של 0.1 מיליליטר לדקה.

מאגדים שברים המכילים דיסקות ננו, ומתרכזים לכ-10 מיליגרם למיליליטר עם מסנן צנטריפוגלי AmCon. לאחר מכן סנן את הדגימה פעמיים. בצע ניתוח על ידי DLS באמצעות מכשיר dynapro nano star בנתוני התאמה של קוורץ בנפח פנימי של מיקרוליטר אחד.

באמצעות התוכנה הדינמית כדי להעריך את הקוטר והמשקל המולקולרי של החלקיקים, קבע את פעילות ה-A TPAs של שני דיסקי ננו משוחזרים של FTK באמצעות מבחן מטרי של צ'ול. ראשית יש לערבב מיקרוטולר אחד של דיסקים מטוהרים ומילימולר אחד של TP עם כמויות הולכות וגדלות של mal e. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן מדוד את שחרור הפוספט האנאורגני ב-660 ננומטר. השווה את כמות הפוספט המשתחררת לעקומה סטנדרטית שנוצרת עם תמיסה סטנדרטית של זרחן. דיסקי הננו מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה של סינון ג'ל.

הכרומטוגרמה מראה שרוב הדיסקים המשוחזרים נפלטים כשיא יחיד, בעוד שדיסקים העשויים עם עודפי שומנים נפלטים בנפח הריק, וכסדרה של פסגות רחבות, איכות הכנת הדיסק מנותחת עוד יותר על ידי דיסקיות אלקטרופורזה של ג'ל מקורי שהורכבו מחדש עם כמות מוגבלת של ליפידים נודדים כרצועה חדה על הג'ל המקורי, ואילו אלה שנוצרו מחדש בנוכחות עודף שומנים נודדים כמריחות. ניתוח של DLS מראה שאוכלוסיית הדיסק הומוגנית עם רדיוס ממוצע של 5.0 ננומטר. בהתבסס על קירוב DLS, לדיסקים המשוחזרים יש משקל מולקולרי לכאורה של 215 קילודלטון דגימות שהורכבו מחדש בנוכחות עודפי שומנים מציגות רדיוסים מפוזרים בסביבות 100 ננומטר, מה שאופייני לדגימות לא הומוגניות.

הפעילות של קומפלקס MAL FTK 2 מוערכת על ידי מדידת קצב הידרוליזה TP והזיקה לשותפים אינטראקטיביים כגון חלבון קושר המלטוז, MAL E, חלבון קושר המלטוז. MAL E נקשר עם זיקה גבוהה לטרנספורטר MAL FTK שני באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל שאינו דנטור. ניתן לזהות קומפלקס בין MAL E ל-MAL ftk שתיים, הגירוי של פעילות MAL KA TPA על ידי MAL E מוצג כאן כפונקציה של ריכוז MAL e.

יצירת דיסק הננו היא פשוטה יחסית, אך סטיות קטנות מהתנאים האופטימליים עלולות להוביל לצבירת חלבונים בלתי הפיכה לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך פחות מיומיים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את החשיבות של בחירת יחס שומנים חלבוני נכון מכיוון שכמות עודפת של שומנים תוביל לייצור של חלקיקים גדולים דמויי ליפוזום. זה חיוני לנתח בקפידה את איכות החומר המחודש באמצעות טכניקות אחרות מלבד סינון ג'ל, כגון ספקטרוסקופיה של פיזור אור, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית, או פשוט יותר אלקטרופורזה של ג'ל מקומי.

זכרו, סוג הפוספוליפיד המשלב את הדיסק כמו גם חלבון פיגום הממברנה יכול לתרום ליעילות הבנייה מחדש. לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שהבנת היטב כיצד ליצור ננו-דיסקים מסיסים והומוגניים המכילים את חלבון הממברנה שבחרת. בהצלחה בניסויים שלך.