בדיקה קלינית הסרת חוט השדרה במודל של עכברים של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS)
17 במרץ 2012
במודל של עכברים של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) נבחן קלינית התנהגותית. כתנאי ניתוח immunohistological נלווה להכנת חוט השדרה מתואר בפירוט.
שלום, שמי לאר טרנר. אני פוסט-דוקטורנט במחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת אינגהאם, גרמניה. היי, שמי לין גונדה.
אני סטודנט לרפואה ואני מבצע את עבודת הגמר שלי במעבדה זו. היום נדגים לכם את הבדיקה הקלינית של SODG 93, מודל עכבר לטרשת צדית (ALS). יתר על כן, נדגים את מבחן התפקוד המוטורי באמצעות מבחן הרוטור, ובנוסף, מבחן תפקוד מוטורי נוסף של אחיזת חוט תלוי, וזאת כדי לבצע ניתוח אימונולוגי.
לאחר בדיקה תפקודית של עכברי ה-a s, הליך נחוץ כולל את הסרת חבל השדרה, עצב ה-STIC ושריר ה-gastroc. אנו מעוניינים להדגים את ההליך הכירורגי הזה בפירוט, ובסוף נציג מספר ממצאים אימונולוגיים לדוגמה. ובכן, כעת נתחיל קודם כל בבדיקה הקלינית.
זהו עכבר מסוג wild type בעל תנועה חופשית, שאינו מראה תסמינים קליניים כלשהם, כגון רעד בשרירים או שיתוק, לפי מערכת הסיווג הקלינית שלנו. מצב כזה יקבל ציון ארבע. זהו עכבר טרנסגני עם ALS.
בשלב מוקדם של המחלה, נצפית רעד חמור של הגפה האחורית הימנית המסווג כ-SCORE שלושה E. הפרעות הליכה חמורות מסווגות את החיה כ-score שתיים. גרירה של גפה אחורית אחת לפחות מסווגת כציון קליני one. במבחן תליית התיל (Hanging wire test), מוערכת עוצמה שרירית גסה. כל עכבר מונח על תיל המיוצר בהתאמה אישית (CustomMade) וסובב בזהירות למצב הפוך מעל כפתור המכוסה בקש.
לאחר אימון שלושה פעמים רצופות של לפחות 180 seconds, נמדד הזמן עד לנפילה (latency to falls). לכל עכבר ניתנים עד שלושה ניסיונות להחזיק במכסה ההפוך למשך מקסימום של 180 seconds, והתקופה הארוכה ביותר נרשמת. בהשוואה לעכבר מסוג תיל לבן בצד ימין, העכבר הטרנסגני עם הפלאקים בצד שמאל חלש מאוד ונופל מהמכסה לפני הגעה למקסימום.
מכשיר ה-Rotor rod משמש למדידת קואורדינציה מוטורית, שיווי משקל ויכולת למידה מוטורית. ביצועים טובים דורשים רמה גבוהה של קואורדינציה סנסורי-מוטורית. המכשיר מורכב מציר מסתובב המונע על ידי מנוע ונשלט באמצעות מחשב, וחמישה נתיבים עבור חמישה עכברים.
נפילות של העכברים מזוהות באופן אוטומטי על ידי לחץ על לוח הפלסטיק התחתון. לאחר אימון של שלושה פעמים רצופות של לפחות 180 שניות במהירות קבועה של 15 סיבובים לדקה, נמדד הזמן שבו בעל חיים יכול להישאר על הרוטט המסתובב. כל בעל חיים עובר שלושה ניסיונות, וההשהיה הארוכה ביותר ללא נפילה נרשמת.
העכבר מסוג הפרא (wild type) הבריא בצד שמאל רץ ללא קושי על מוט הסיבוב (rotor rod). לעומת זאת, לעכבר הטרנסגני a s mo בצד ימין יש קשיים חמורים אפילו רק להישאר על מוט הסיבוב, והוא מחליק ממנו לאחר זמן קצר, כפי שנצפה מאחור. ניתן לראות את קשיי הריצה החמורים של עכבר ה-retre השמאלי.
בהשוואה לעכבר wire tap בריא, הוא אינו מסוגל לעמוד בקצב המהירות של מוט הרוטור ואינו יכול לדחוף כלפי מעלה עם גפי ה-HIN. על מנת לבצע ניתוח אימונוכימי של חוט השדרה, יש להקריב את בעלי החיים. חשוב מאוד להקפיד תמיד על הנחיות מקומיות לביצוע תקין של ניסויים בבעלי חיים.
בהקשר זה, בסקירה פשוטה מאוד זו של עמוד השדרה והרקמות הסובבות אותו, מוצגים המבנים האנטומיים העיקריים. נניח את בעל החיים על צדו הבטני ונתחיל להכין את השרירים מהשק הגבי. לאחר הסרת רקמת השריר, נגיע לעמוד השדרה העוטף את חוט השדרה.
לאחר שהבעל חיים הוקרב והועבר לו פירפורפוזציה (ביומיסור) עם תמיסה המכילה פאראפורמליד, ניתן להוציא את חוט השדרה. בעל החיים מונח על שולחן ניתוחים וגפיו מקובעים לצדדים כדי לחשוף את גבו של העכבר. בעל החיים נרטב כדי להשטיח את הפרווה ולהקל על חיתוך העור הבא.
לשם כך, יש להשתמש בסכין מנתחים (סקלפל) חדה. יש להקפיד למתוח את העור לשני הצדדים. כדי להקל על החיתוך, יש להכין את שריר הרגל.
יש לחתור גם את עורם. לאחר השלמת חיתוך העור, יש להזיזו בעדינות הצידה. לאחר הסרת שרירי הרגל ועצב ה-sciatic באמצעות פינצטה, נמשיך להתקרב לחוט השדרה ונניח את בעל החיים על שולחן ניתוחים חדש.
כעת ניתן לזהות בקלות את הגולגולת, הצוואר, השרירים ועמוד השדרה. לאחר זיהוי כל המבנים הללו, ניתן להמשיך בקלות לשלב הבא. יש להסיר את שרירי הצוואר ואת רצועת ה-nu.
היזהרו לא לחתוך עמוק מדי ולהוביל לעמוד השדרה. בשלב הבא, השרירים הפרה-ורטברליים (paravertebral) מוסרים לחלוטין כדי לחשוף את עמוד השדרה. כדי לגשת לעמוד השדרה, יש לבצע מספר כריתות.
אנו מתחילים מהחלק הצווארי של עמוד השדרה, כולל המפרק האטלנטו-אוקסיפיטלי. כדי לבצע את הלמינקטומיה, עלינו לחתוך את הקשת הוורטברלית כדי שנוכל להסיר את כל הזקיפות מהגוף הוורטברלי. כפי שהוסבר קודם לכן, הלמינקטומיה מתחילה בחיתוך של הקשתות הוורטברליות.
לאחר מכן ניתן להסיר את ה-laina. שוב, יש להיזהר לא לפגוע בחוט השדרה שכן יש להסיר רבויות נוספות של ral. השימוש במספריים זוויתיים ובביצוע חתכים במספר קשתות חולייים משני הצדדים בו-זמנית הוא מועיל מאוד.
לאחר מכן, משוך את הזקיפים הגביים (dorsal processes) כדי להסיר לחלוטין את למינות החוליה (vertebral lamine) כפי שניתן לראות בתקריב. שים לב כי יש להחדיר את המספריים בזהירות בחלק הלטרלי ביותר של תעלת השדרה. יש להסיר את החלקים הלטרליים שנותרו של עמוד השדרה כדי להקל על הסרתו המלאה של חוט השדרה בשלב מאוחר יותר.
נקודות ציון אנטומיות של חוט השדרה הן מה שנקרא הגבששים הצוואריים והמותניים. לאחר סיום הכריתה של חוט השדרה כולו, וודאו שאתם חותכים גם את כל השורשים הבטניים של חוט השדרה ומשחררים אותו מהקרום הקשיח של הקרומים העוטפים. לאחר מכן, חוט השדרה הצווארי נחתך.
הסרה של חבל השדרה תחדש מהכיוון הקרניאלי. יש לגעת בחבל השדרה בזהירות רבה כדי לא לפגוע ברקמה, שכן הדבר עלול לגרום להגבלות חמורות בניתוח אימונוכימי מאוחר יותר. הסרת חבל השדרה תימשך הלאה ברמת החזה ותמשיך אל החלק הלומברי.
כעת נבצע חיתוך נוסף בצד של ה-cauda equina. כעת אנו יכולים לשחרר אותה לחלוטין. כאן ניתן לראות את חוט השדרה מונח ממש לצד מיקומו המקורי בעמוד ה-RAL.
בסופו של דבר, הדגימה מוכנסת לתמיסת קיבוע של Paraform Hyde. כדוגמה קלאסית לאנליזה אימונוהיסטוכימית של חוט השדרה, ניתן להשתמש בנוגדן המזהה choline acetyltransferase כדי לזהות נוירונים מוטוריים בקרן הקדמית של חוט השדרה. כאן ניתן לראות מספר רב של נוירונים מוטוריים בבעל wild type בריא.
בניגוד לכך, חיה טרנסגנית עם ALS בשלב סופי מראה מספר קטן בהרבה של נוירונים מוטוריים בקרן הקדמית (Anterior horn). בצפייה במאמר הווידאו זה, הייתם אמורים ללמוד את הבדיקה הקלינית הבסיסית של דגם העכבר SOD1-G93 לטרשת צדית שרירית.
שתי בדיקות התנהגות מוטורית הודגמו: מבחן הרוטור ומבחן תליית התיל. בדיקות אלו מספקות אפשרות טובה להערכת תפקוד מוטורי בסיסי. הן קלות לביצוע, רגישות לגילוי ליקויים מוטוריים ויעילות מבחינת זמן.
החלק המרכזי של סרטון זה מורכב מהדגמה של טכניקת ההכנה של חוט השדרה. ניתן, כמובן, ליישם טכניקה זו על כל מודל מחלה אחר בעכברים, והיא מהווה שלב חיוני לצורך ניתוח אימונוכימי מאוחר יותר של הפתולוגיה של המחלה בחוט השדרה. תודה שצפיתם.
אנו מקווים שמאמר וידאו זה יסייע לכם בניסויים העתידיים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן מודל עכברי לטרשת נשיתית צדית (ALS) באמצעות הערכות קליניות והתנהגותיות. הכנת חוט השדרה מפורטת כתנאי מוקדם לאנליזה אימונוהיסטולוגית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגותי
- אימונוהיסטולוגיה
רקע
- סקלרוזיס צידית נטרפית (ALS) היא מחלה נוירודגנרטיבית.
- מודלים של עכברים חיוניים לחקר מנגנוני ה-ALS.
- בדיקות התנהגותיות מסייעות בהערכת התפקוד המוטורי במודלים אלו.
- ניתוח אימונוהיסטולוגי מספק תובנות לגבי פתולוגיה של חוט השדרה.
מטרת המחקר
- להערכה קלינית והתנהגותית של מודל עכבר ל-ALS.
- להכנת דגימות של חוט השדרה לצורך ניתוח נוסף.
- להדגמת מבחני תפקוד מוטורי הרלוונטיים למחקר על ALS.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקה קלינית של מודל העכבר SODG 93.
- הערכת תפקוד מוטורי באמצעות מבחני רוטור.
- מבחני אחיזה בחוט תלוי להערכת מיומנויות מוטוריות.
- הכנה אימונוהיסטולוגית של דגימות חוט השדרה.
תוצאות עיקריות
- הדגמה מוצלחת של מבחני תפקוד מוטורי במודל העכבר.
- שיטות הכנה מפורטות לניתוח של חוט השדרה.
- תובנות לגבי המאפיינים ההתנהגותיים של המודל.
- בסיס למחקרי אימונוהיסטולוגיה נוספים.
מסקנות
- מודל העכבר מספק כלי בעל ערך למחקר של ALS.
- הערכות התנהגותיות הן קריטיות להבנת התקדמות המחלה.
- ניתוח אימונוהיסטולוגי ישפר את הידע על הפתולוגיה של ALS.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות קליניות והתנהגותיות חסונות במודל העכבר ל-ALS מסוג SOD1 (G93A) מאפשרות הערכה כמותית של גירעונות מוטוריים והתקדמות המחלה, ובכך תומכות בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובהפחתת סיכונים מכניסטיים. שילוב של דירוג סטנדרטי ואנליזה אימונוהיסטוכימית מספק ביטחון חיזוי למחקר תרגומי ולמיון תיקי פיתוח. יכולות אלו מהוות בסיס לקידום מותאם-סיכונים של טיפולים חדשניים ל-ALS בצינורות פיתוח פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מערכות דירוג מוטוריות כמותיות מאפשרות בחינה אובייקטיבית של היפותזות טיפוליות במודלים של ALS.
- פנוטיפיקה התנהגותית מבהירה מנגנוני מחלה ותומכת בתיקוף פונקציונלי של מטרות.
- נקודות קצה קליניות סטנדרטיות מקלות על הביטחון החזוי ועל תיעדוף הפורטפוליו עבור תוכניות למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- בדיקות תפקוד מוטורי מתוקפות (rotarod, תיל תלייה) מספקות תוצאות הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב לסריקת תרכובות.
- פלטים כמותיים תומכים בסטנדרטיזציה של הבדיקה וב可השוואה בין מחקרים שונים.
- נקודות קצה התנהגותיות והיסטולוגיות מאפשרות הערכה מהימנה של התערבויות מועמדות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ניתוח אימונוהיסטוכימי של רקמת חוט השדרה מתאם בין ממצאים פרה-קליניים לבין סמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה.
- רציפות מהפנוטיפ ההתנהגותי להיסטופתולוגיה תומכת בדיוק תרגומי.
- אפיון מקיף של המודל מכוון החלטות קידום מותאמות סיכון בפורטפוליו של מחלות ALS.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
תהליך עבודה זה מגשר בין השלבים של גילוי מוקדם, זיהוי מועמדים (lead identification) ותיקוף פרה-קליני במחקר של ALS, באמצעות שילוב של נקודות קצה התנהגותיות, קליניות והיסטולוגיות.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשרת בדיקת השערות והפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות הערכות מוטוריות והיסטולוגיות כמותיות.
- סריקה: מספקת נקודות קצה התנהגותיות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות ומערכות ניקוד להשוואה סטטיסטית איתנה.
- מחקר תרגומי: מתאימה פלטי פרה-קליניים לסמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה לצורך רצף קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר עבור מודלים של ALS ומחלות ניווניות של מערכת העצבים הקשורות אליה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות עבור ALS.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפנוטיפ התנהגותי ובהכנת רקמות כירורגית.
- דורש גישה למכשור ייעודי לבדיקות מוטוריות ולניתוח היסטולוגי.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת בין צוותים לגבי דירוג ופרוטוקולי בדיקה.
- ניתן להתאמה למודלים אחרים של מחלות נוירודגנרטיביות עם תיקוף מתאים.
- תלוי בהיצמדות להנחיות רווחת בעלי חיים וכללים אתיים למחקרים פרה-קליניים.
