מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מכשיר מיקרופלואידי, המצופה בתאי אנדותל. זה מושג על ידי ייצור תחילה של התבנית המיקרופלואידית. השלב השני הוא יצירת ערוץ PDMS.

לאחר מכן, תאי האנדותל נזרעים לתוך המכשיר. השלב האחרון הוא תרבית התאים בתוך המכשיר. בסופו של דבר, מכשירים מיקרופלואידיים מצופים תאי אנדותל משמשים להצגת אינטראקציות בין תאים במבחנה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא בכך שהיא מספקת לחוקר בקרה הדוקה על התנאים הביולוגיים והביופיזיים ותואמת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציות הביופיזיות של תאים במחלות המטולוגיות, ניתן ליישם אותה גם על תופעות כמו ביולוגיה של לויקוציטים, גרורות סרטניות וביולוגיה של תאי גזע המטופויאטיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהתנאים צריכים להיות מבוקרים היטב כדי להצליח בישיבה מוצלחת.

כהכנה לייצור יוצר מסכת צילום על ידי הגשת תמונת עיצוב בעזרת מחשב של מכשיר המיקרופלואיד לספק מסכות חיצוני. לאחר קבלתה, המסכה מורכבת משכבת כרום על זכוכית סודה ליים. כאן רוחב התעלה המיקרו-נוזלית הוא 30 מיקרון.

כדי להתחיל בייצור המכשיר המיקרופלואידי, יש לנקות פרוסת סיליקון חשופה עם פיראנה למשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף במים נטולי יונים למשך 10 שניות. לאחר מכן טבלו את פרוסת הסיליקון בחומצה הידרופלואורית למשך 30 שניות, ושטפו במים נטולי יונים למשך כ-10 שניות. לאחר מכן, באמצעות ספין קוטר ספין מיקרו כימיה SU 8 20 25 התנגדות צילום על הפרוסה לגובה של 30 מיקרון באמצעות מהירות סיבוב של 3000 סיבובים לדקה.

הנח את הוופל המצופה SU 8 20 25 על פלטה חמה המוגדרת בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לגרש עודפי ממס. תנור אינו מומלץ לשלב זה. כעת, הנח את מסכת הצילום מעל הפרוסה וחשוף לאור UV בתוחם מסכה כדי להצליב את התנגדות הצילום SU 8 20 25.

לאחר קישור צולב, הניחו את הוופל בחזרה על הפלטה החמה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות נוספות. כדי להאיץ עוד יותר את הפילמור של התנגדות צילום SU 8 20 25. לאחר מכן טבלו את הוופל במפתח SU 8, המורכב בעיקר מ-P-G-M-E-A למשך ארבע דקות.

פעולה זו תסיר את תמונת SU 8 20 25 הלא מקושרת. להתנגד. שטפו את הוופל החדש שפותח עם 100% אלכוהול איזופרופיל למשך 10 שניות, ולאחר מכן יבשו באמצעות חנקן בלחץ, או על ידי מתן אפשרות לממס להתאדות מהרקיק במכסה אדים נקי למשך מספר דקות. כעת, הדביקו את הוופל המיובש למרכז צלחת הפטרי, והקפידו להניח את הסרט בשולי הוופל.

לבסוף, פיפטה 500 מיקרוליטר של מעיל סיגמא על הוופל. מכסים את צלחת הפטרי במכסה ואז מערבבים את המנה כדי להבטיח ציפוי מלא של הוופל. הסר את המכסה והניח לוופל להתייבש מספר דקות עד שכל הממס יתאדה.

לאחר ערבוב פולימר PDMS וחומר ריפוי ביחס משקל של 10 לאחד למשקל, הסר בועות אוויר באמצעות חומר ייבוש ואקום למשך מספר דקות עד שעה, תלוי בחוזק מערכת הוואקום הזמינה. לאחר הסרת כל בועות האוויר, שפכו את התערובת לתבשיל כך שהרקיק ומשטח המנה יכוסו. ליצור גיליון PDMS בעובי של כחמישה מילימטרים.

צור גם חתיכה דקה וחסרת תכונות של PDMS בעובי של מילימטר אחד. לאחר מכן מרפאים את התערובת בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמש בסכין או באזמל כדי לחתוך סביב הוופל ולהסיר מספר התקנים מיקרופלואידיים PDMS.

ואז חותכים את הסדין כדי לבודד מכשירים בודדים. חותכים את גיליון ה- PDMS מעט גדול יותר מהמכשיר המיקרופלואידי. כעת השתמש בסגן סיכה, חד קרן האריס או מכשיר דומה כדי ליצור חורי כניסה ויציאה במכשיר המיקרופלואידי.

לאחר מכן, יש לנקות את משטחי המכשיר המיקרופלואידי ואת הסדין באמצעות סקוטש. לאחר מכן השתמש במנקה פלזמה כדי לחשוף את משטחי המכשיר המיקרופלואידי ויריעת ה-PDMS לפלזמת חמצן למשך 30 שניות. פלזמת החמצן יוצרת מינים תגובתיים על פני השטח החשופים של ה-PDMS, אשר נקשרים כאשר הם באים במגע פיזי.

לאחר מכן, מלאו מזרק מיליליטר אחד המצויד במחט נקודתית קהה בגודל 20 עם 50 מיקרוגרם למיליליטר. פיברונקטין מפלזמה אנושית ב-PBS מתאים אז לאורך צינור מעל המחט. הכנס חתיכת צינור דק יותר לחתיכת הצינור הראשונה כדי ליצור התאמת חיכוך בין שני חלקי הצינור.

לאחר מכן חבר את הקצה השני של פיסת הצינור הדקה יותר לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי. הפעילו לחץ על המזרק כדי למלא את התעלות לחלוטין בתמיסת פיברונקטין וליצור טיפה קטנה של 100 מיקרוליטר ביציאת התחזית כדי להבטיח שהתעלות יישארו רטובות. כעת, דגרו את המכשיר המיקרופלואידי באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 60 דקות.

לאחר הדגירה, חבר מזרק טרי מלא ב-PBS למחט הנקודה הקהה. הפעל לחץ כדי לשטוף את המכשיר המיקרופלואידי עם PBS. הכן 500,000 עד 2 מיליון תאים למיליליטר של תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים, או שיש במצע גידול אנדותל עם 8% דקסטרן.

תוספת של דקסטרן מגדילה את הסבירות שהתאים יידבקו ויתרבו בהצלחה בתוך המכשיר המיקרופלואידי. מזרק נקי מילוי המצויד במחט נקודתית קהה וצינור רחב יותר עם מתלה התא ומחבר אורך צינור ארוך יותר באורך של כמטר אחד. חשוב לוודא שהצינור מתאים היטב כדי למנוע דליפה בין חיבורים כלשהם.

יש להניח את הצינור בתמיסת תאים, וודא שאין בועות במזרק או באף אחד מהצינורות כדי לייעל את ביצועי המערכת. זה קריטי בשלב זה למנוע נזילות או בועות להיכנס למערכת. כל דליפה של תמיסה או נוכחות של בועות במדיה תמנע ישיבה מוצלחת של תאי אנדותל.

לאחר שכל הבועות סולקו וכל אורך הצינור מוכן עם תרחיף תאים, הנח את המזרק על המשאבה והצמד את הקצה השני לכניסה המיקרופלואידית. משאבת המזרק מוגדרת באותו גובה כמו המכשיר המיקרופלואידי. האורך הארוך של הצינור מפותל בזהירות בתוך החממה כדי להבטיח שהתאים והמדיה מתחממים כראוי לפני שהם באים במגע עם המכשיר.

לאחר מכן מחדירים את תרחיף התאים למכשיר המיקרופלואידי בקצב זרימה נפחי של 1.23 מיקרוליטר לדקה למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני במערכת שלנו. קצב השפעת הנפחי של 1.23 מיקרוליטר לדקה מתאים למהירות אמצע הזרם של מילימטר לשנייה בערוצים הקטנים ביותר. זה מתקרב למתח גזירה של אגורה אחת לסנטימטר רבוע בערוצים אלה באמצעות דם מלא.

לאחר השלמת עירוי תרחיף התאים, השתמש באותה משאבת מזרק ובצינורות ארוכים עם מזרק גדול יותר כדי להחדיר מצע גידול טרי למשך יומיים עד שמונה ימים בקצב של 1.23 מיקרוליטר לדקה. כאשר שכבת התא החד-שכבתית נמצאת ברמת המפגש הרצויה, הזרקת דם או תרחיף תאים למערכת לצורך ניסויים. כאן, המכשיר המיקרו-נוזלי מוצג לפני אנדותליזציה.

המכשיר המיקרופלואידי הוחדר בצבעי מאכל כדי להמחיש את הגודל, קנה המידה והעיצוב הכללי של המכשיר המחקה את הפיזיולוגיה של כלי הדם. מיקרוסקופיה של ברייטפילד חושפת אנדותליזציה של מכשיר מיקרופלואידי. תמונה זו נרכשה פחות מ-48 שעות לאחר הזריעה באמצעות הפרוטוקול המתואר, טכניקת הזלוף האופטימלית מאפשרת לתאי אנדותל לתרבית באופן שוטף את כל המשטח הפנימי של המערכת המיקרופלואידית.

תוך 24 עד 48 שעות מזריעת התאים. כפי שמוצג בתמונה קונפוקלית זו, הגידול המיקרו-וסקולרי על שבב עם תעלות מיקרו מתקרב לגודל של 30 מיקרון של נימים פוסט-נימיים האתר של רוב אירועי החסימה המיקרו-וסקולריים של תאי מגל. בניסוי זה, דם מלא מחולים בריאים מוזרק למיקרו-כלי דם על מכשיר שבב בתנאים לא מחומצנים.

סרטון זה מראה שזרימת הדם המלא במערכת המיקרופלואידית האנדותל שלנו היא סדירה, חלקה ורציפה ללא אזורים של חסימת מיקרו-ערוצים. כאן, דם מלא מחולים עם מחלת תאי חרמש מוזרק למיקרו כלי דם במכשיר שבב. בתנאים לא מחומצנים נראים שינויים משמעותיים בזרימת הדם עם חסימות מלאות הקיימות במספר ערוצים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא להכניס בועות אוויר בעת החלפת צינורות. המכשיר המוגמר תואם למיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתן להתאים אותו לבדיקות פלואורסצנטיות מסורתיות. טכניקה זו סוללת את הדרך להמטולוגים ניסיוניים לערוך ניסויים באמצעות תאים בודדים בסביבה ביופיזית והמודינמית מבוקרת.

בלי בועות.