הקמת מיקרוביאלית תרבויות העשרה האיקריוטים מ שכבתית כימית אנטארקטיקה אגם והערכת פוטנציאל קיבוע פחמן

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיק תרביות העשרה של פרוטיסטים מאגם בוני (Lake Bonnie) באנטארקטיקה, ולמדוד קיבוע פחמן כחלק ממדד ראשוני למגוון מטבולי. דבר זה מושג תחילה על ידי דגימה של עומקי מים באגם בוני התואמים לשיאים ידועים של פרוטיסטים ופיטופלנקטון. דגימות מי האגם מוחדרות לאחר מכן למסבי גידול שונים ומודגרות בתא גידול המצויד בווסת טמפרטורה ובתאורה למשך ארבעה עד שישה שבועות.

ניתן להוביל את התרביות לפי הצורך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס. השלב הבא הוא מיצוי ליזטים תאיים גולמיים מתרביות ההעשרה. השלב הסופי של הליך זה הוא הערכת פוטנציאל קיבוע הפחמן בליזט התאי באמצעות בדיקה רדיואיזוטופית לפעילות של ribulose one five Bisphosphate, carboxylase, oxygenase, או Rubis co.

בסופו של דבר, תרביות העשרה של פרוקריוטיים מראות שונות בפוטנציאל קיבוע הפחמן בקהילת הפרוקריוטיים הטבעית. שיטה זו יכולה לסייע לנו במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לאקולוגיה מיקרובית של אגמים. לדוגמה, תפקידם של איקריוטיים מיקרוביים במחזור הפחמן בשלבים שונים באגמים אנטארקטיים מובחנים (stratified).

למרות שדגימת עמוד מים עבור דורות עוקבים של תרביות העשרה היא טכניקה נפוצה, שיטה זו כוללת התאמות להפעלה בסביבה קרה במיוחד, שבה עלולים להתרחש סיבוכים בלתי צפויים. רעיון זה לשיטה עלה במוחי לראשונה כאשר חשבתי על דרכים לבחון את בדיקת ה-Redisco בדגימות מאגמים טבעיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הדגימה קשה לדמיין מכיוון שאתרי הדגימה נמצאים בסביבה הזרה לחוקרים רבים.

דגימות נאספות מאגם בוני, אחד מאגמים רבים המכוסים בקרח באופן קבוע הנמצאים בעמקי מקמורדו היבשים באנטארקטיקה. יום אחד לפני דגימת עמוד המים, יש לבחור ולהכין את אתר הדגימה. הדבר יאפשר לשכבות המופרדות של עמוד המים להיווצר מחדש לאחר ההפרעה שנגרמה מהקידוח ומהמסת חור הקרח. זהו את מיקום אתר הקידוח באמצעות GPS כדי לגשת לעמוד המים.

התחילו בקידוח חור דרך הקרח באמצעות מקדח Jiffy Ice המחובר למתואר Jiffy flight באורך ארבעה אינץ' ולביט חיתוך, כדי למנוע את קיפאון המקדח בתוך החור. השתדלו להימנע מקידוח אל תוך המים הנוזליים על ידי עצירת הקידוח כ-4 עד 6 אינץ' מעל לראש עמודת המים. יש להרחיב את חור הקידוח מקוטר של ששה אינץ' לשתי רגליים לצורך הדגימה.

פעולה זו מתבצעת באמצעות המהם של חור בדגם של ים חם, המזרים פוליאתילן גליקול מחומם דרך חור בצינור נחושת. ההמסה נמשכת בדרך כלל עד 18 שעות ביום שלפני דגימת עמודת המים. ודאו שכל הציוד הנדרש וכלי אחסון הדגימות מורכבים באתר הדגימה.

חומרי הדגימה כוללים בקבוק NICU בנפח של 5 עד 10 ליטר, כננת עם כבל מכויל לעומק, מספר מספיק של בקבוקי דגימה לכל עומק דגימה, שליח (messenger) וקירור להובלת הדגימות. יש להתחיל בדגימה מוקדם בבוקר, בסביבות השעה 5:00, שכן סינון מי האגם צריך להסתיים ביום הדגימה. השתמשו במדגמ קין (kin sampler) המחובר לכננת ידנית מכויילת.

אסוף דגימות מים של ליטר אחד עד חמישה ליטרים מהעומקים הרצויים למחקר זה. עומקי הדגימה הם שישה מטרים, 15 מטרים ו-18 מטרים, הנמדדים ממפלס המים הסימטרי של ה-PI בחור ice hole. אחסן את דגימות האגם בצידניות והעבר אותן מאתר הדגימה למעבדה השטחית.

באמצעות מזחלת המחוברת ל-A TV, יש לעבד או לייצב את הדגימות במעבדת השטח. מיד לאחר הדגימה, יש להתחיל בגידול של תרביות העשרה ברגע שהדגימות הובאו למעבדת השטח. רכזו 0.5 עד ליטר אחד של מי אגם על פילטרים בקוטר 47 מילימטר ובגודל נקבים של 0.45 מיקרון.

מסנני פוליאתר-סולפון (POLYETHERS sulfone) תוך שימוש בסינון עדין. אם נדרש לבחון את הגיוון של הקהילה הטבעית, סננו דגימה שנייה על גבי מסנן בקוטר 47 מילימטרים עם גודל נקבים של 0.45 מיקרון.

הקפאה מהירה של מסנני פוליאתר-סולפון (POLYETHERS sulfone) בתוך חנקן נוזלי. העבירו כל מסנן לשפופרת פלקון (falcon tube) סטרילית בנפח 50 מיליליטר המכילה כ-20 מיליליטר של מי אגם מסוננים, שנאספו מאותו עומק דגימה של המסנן.

העבירו את תרחיף התאים לבקבוק תרבית תאים סטרילי ריבוע בן 25 סנטימטרים לצורך העשרה במצעי גידול שונים. הכינו מספר חזרות עבור כל עומק דגימה. הוסיפו לכל בקבוק תרבית 50 x תמיסות סטריליות של מצעי הגידול הבאים: bold basil, medium, BG 11 ו-F two.

אם נדרש גידול של אורגניזמים מיקסוטרופיים, הכינו שני כלי F two מועשריים והוסיפו שניים עד שלושה גרגרי אורז סטריליים לאחד מבקבוקי תרבית הדגירה, בטמפרטורה נמוכה וקרינה נמוכה במדגרת גידול עם בקרת טמפרטורה למשך ארבעה שבועות לפחות לפני המשלוח למעבדה בארה"ב. העבירו את תרביות ההעשרה לשפופרות Falcon סטריליות בנפח 50 מיליליטר. בקשו בטופס הבקשה למשלוח שיוקרו דרישות המשלוח "לא להקפיא" ו"לשמור בקירור". עם ההגעה לארה"ב, העבירו 5 מיליליטר מכל תרבית העשרה לתוך 45 מיליליטר של מצע גידול מתאים בבקבוק של 125 מיליליטר.

בקבוק ארלמיי (erlenmeyer) סטרילי סגור עם ספוג סטרילי. לצורך תחזוקת תרביות העשרה כתרביות עומדות בתא גידול סביבתי בטמפרטורה מבוקרת של 4°C, העבירו תרביות בבקיעה למצע טרי מדי 30 יום. כדי להתחיל את הליך מיצוי הליזט התאי, סננו חמישה ליטרים של תרבית העשרה דרך מסנן watman GFF בקוטר 25 מילימטר באמצעות ואקום עדין.

בשלב הבא, גזרו את המסנן לארבעה עד חמישה חלקים באמצעות מספרי פלדה סטריליים. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להעביר את החלקים לשפופרת עם פקק הברגה בנפח 2 mL, המלאה עד לחמישית מגובהה בנפח של 0.1 millimeter diameter.

خرזי זירקוניה-סיליקה. הוסף 1.25 milliliters של תמיסת סניקה (extraction buffer) למסנן אל תוך המבחנה ולאחר מכן פחס את התאים באמצעות מכשיר mini bead beader למשך 30 שניות בהגדרת מהירות 48, ולאחר מכן הנח על קרח למשך דקה אחת. חזור על פעולת ה-bead beating שנית פעמיים נוספות, עם דגירה של דקה אחת על קרח בין סבבי ה-bead beating למניעת חימום של הדגימה בצנטריפוגה.

סננו את תרחיף הסינון למשך שתי דקות ב-3000 ×g בטמפרטורה של 4°C, כדי ליצור פלטה רפויה של סיבי מסנן GFF ושאריות דפנות תאים. הסירו מנה של 200 µL מהמשקע והטבילו אותה ב-800 µL של 90% אצטון קר במיוחד.

העבירו את שאר ה-snat למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter. מדדו את הכלורופיל A הניתן למיצוי בספקטרופוטומטר באורכי גל של 664 nanometers ו-647 nanometers. צנטריפוגו את ה-SUP natant שנותר למשך שתי דקות ב-15,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.

העבירו את ה-S לפ menutupול מיקרו-צנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מיליליטר, תוך הימנעות מהמשקע של ממברנות תאיות בלתי ממיסות ומשארי סיבי מסנן GFF. ניתן כעת להשתמש בליסאט תאי ממיס זה במבחן פעילות ה-rubis carboxylase, שיודגם בהמשך. כדי להתחיל במבחן זה, העבירו 125 מיקרוליטר מכל ליסאט ממיס לפ menutupול מיקרו-צנטריפוגה עם מכסה הברגה בנפח 1.5 מיליליטר שקוילר על קרח.

עבור דגימות ביקורת שלילית, הוסף 125 µL של ליזט מסיס למבחנה מיקרו-צנטריפוגה עם פקק הברגה בנפח 1.5 mL, אך אל תוסיף סובסטרט. בהמשך, בצע תגובות כפולות עבור כל הדגימות והביקורות השליליות. הכן 10 mL של באפר מדידה (assay buffer), טרי, וקרר על קרח.

מדוד כמות מספיקה של תמיסת באפר הבדיקה עבור כל הדגימות והבישורים השליליים לשפופרת של חמישה מיליליטר. מעתה ואילך, יש לבצע את כל השלבים תחת מcoprote

הסר 10 µL של באפר המבחן המכיל C 14 ודלל אותו במיליליטר אחד של באפר מבחן על ידי הפיכה. כדי לערבב, הוסף 100 µL של התערובת המדוללת לשלושה מיליליטרים של תערובת סנסיליזציה (scintillation cocktail) מסוג bios safe two בבקבוק סנסיליזציה (scintillation vial) והפוך לערבוב. מדוד את ספירות ה-C 14 באמצעות מונה Beckman LS 6, 500; ספירות הסנסיליזציה חייבות להיות מעל 18,000 counts per minute לפני המשך המבחן.

לאחר הוספה של כמות מספקת של נתרן ביקרבונט המסומן ב-C 14 לבתח הפרוטוקול (assay buffer), העבירו את מבחנות התגובה למקלח יבש (dry bath), המוגדר מראש ל-25 °C, והדגירו למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של בתח פרוטוקול לליזטים והדגירו ב-25 °C למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, הוסיפו ריבולוז ביספוספאט לכל דגימה והניחו לתגובה להתבצע למשך חמש עד 10 דקות ב-25 °C.

כדי לעצור את התגובה, הוסף 100 µL של חומצה פרוביוטית 100% וסבב בצנטריפוגה במשך שעה אחת במהירות של 2000 ×g כדי להוציא C 14 שאינו מקושר. לבסוף, העבר את הנפח הכולל של הדגימות לבקבוקוני סינCילציה המכילים שלושה מיליליטרים של תמיסת ספירה (scintillation counting cocktail) מסוג bios. Safe 2, וקבע את מספר הספירות לדקה של החומצה היציבה.

תוצרי קצה על ידי ספירה של נצנוץ (scintillation counting). גידול העשרה שימש לבידוד פרוטיסטים פוטוטרופיים ומיקסוטרופיים חדשים המותאמים לקור מאגם בוני (Lake Bonnie) באנטארקטיקה משלושה עומקים. סוגים שונים של מצעי גידול שימשו לבחירה של מגוון רחב יותר של אורגניזמים: מצע Bold's, מצע BBMF two si, מצע ימי ומצע BG 11.

ריכוז החומרים המזינים והקרינה הפעילה פוטוסינתטית, או PAR, המוצגים בטבלה זו מייצגים את התנאים בעת איסוף הדגימות. בדיקה ויזואלית של תרביות ההעשרה באמצעות מיקרוסקופ אור גילתה כי בתרבייות שלטו פרוטיסטים פוטוטרופיים, כפי שהעיד נוכחותו של פיגמנט כלורופיל ברוב התאים. התרביויות הכילו גם מגוון של מורפולוגיות תאים, בהתאם לעומק הדגימה ממנו נלקח האינוקולום ולסוג המצע ששימש בתרבית.

שיעורים מקסימליים של פעילות קרבוקסילאז המזורזת על ידי האנזים rubis נמדדו בתרביות המועשרות כמדד לקיבוע פחמן. שפע פוטנציאלי של כלורופיל a נוטר לניטור כהערכה של ביומסה של פרוטיסטים פוטוטרופיים, כפי שמוצג כאן.

על אף שכל התרביות גודלו תחת אותה טמפרטורה, משטר תאורה ופוטנציאל קיבוע פחמן, קיים שוני ניכר בביומסה הפוטוטרופית בין תרביות ההעשרה. פעילות rubis O מקסימלית נצפתה בתרביות העשרה ארבע ושש שגודלו במצע BBM ובתרביות העשרה 13 ו-14 שגודלו במצע BG 11. לעומת זאת, תרביות 1921 ו-23 שהועשרו במצע גידול F two הראו פעילות קרבוקסילאז מקסימלית שהייתה נמוכה פי 4 עד 34.

הבדלים אלה לא נבעו מרמות ביומסה נמוכות יותר בשני תרביתי ה-F, שכן פעילות הקרבוקסילאזה בוטאה על בסיס כלורוּפיל a. יתרה מכך, ניתוח מתאם פירסון גילה כי פעילות ה-rubis co לא הייתה במתאם עם ריכוז הכלורוּפיל a. תרביתי ה-BBM הוחדרו במי אגם מעומק של שישה מטרים ו-15 מטרים.

בפורום חמישה של ההעשרה נמדדו רמות הכלורופיל A הגבוהות ביותר, בעוד שבכל שאר התרביות נצפה כלורופיל a נמוך יחסית, ללא קשר לפעילות אנזים ה-rubis. לאחר השליטה בטכניקה, דגימת האגם אורכת כשעתיים. בהתאם למספר הדגימות שנלקחות, גם בדיקת הקרבוקסילאז אורכת כשעתיים כאשר היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון בדיקת פעילות אנזים הטרוטרופית, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון בעומקו של האגם מופיעים אורגניזמים הטרוטרופיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן איסוף דגימות מהאגם, העשרתן להפקה ובדיקת פעילות rubis carboxylase.