Name: שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 21 s
Description: למדו להשתמש ברובוטים להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבוני ממברנה במזופאזות ליפידיות. שלושה רובוטים מסחריים מדגימים שיפור במהירות, דיוק ושחזור בניסויים קריסטלוגרפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ישנם רב שתרמו לעבודה זו ורובם מן הקרום המבני ופונקציונלית קבוצת ביולוגיה, שניהם חברים בעבר ובהווה. לכולנו להרחיב את התודה וההערכה החמה שלנו. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מקרן מדע אירלנד (07/IN.1/B1836), המכונים הלאומיים לבריאות (GM75915, P50GM073210 וU54GM094599), ועלות הפעולה CM0902 FP7.

<ol><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712(2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501(2011).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Bio.l+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Autom.+Sci.+Eng%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination%3A+use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li>
<li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II%3A+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li>
<li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li>
<li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001(2012).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה וידאו שהראינו כיצד להשתמש ברובוט כדי להגדיר באופן אוטומטי בניסויי התגבשות טווה בצלחות זכוכית כריך 96-כן באמצעות mesophase lipidic חלבון עמוס. הרובוטים משמשים בעבודה זו תוכננו במיוחד כדי כוללים מזרק זכוכית תזוזה חיובית למסירה מדויקת ושחזור של כרכי nanoliter של mesophase הצמיג והדביק, כפי שתוארו במקור 7. דיוק ותכונות חשובות של רובוט. עם זאת, מאפיינים אלה הם רק טובים כמו מידה וסדירות שביצועי רובוט מוערכים וכיול מתבצע. למותר לציין כי ביצועים של הרובוט צריכים להיות מוערכים ואילו צלחות בודדות שהקימו. אין זה ראוי להניח שהרובוט יתפקד ללא רבב ולעזוב את הרובוט לפעול ללא התערבות. המפעיל קשובים ומצוות צריך להיות בקופהition לציין על ידי צליל או מראה כשמשהו לא עובד כמו שצריך וכדי לתקן אותו באופן מיידי. בנוסף, כל צלחת יש לבדוק בקפידה על ידי עין אחידות בתכנים גם בהקדם הצלחת היא חתומה ולפני זה הוא לשים בצד לניסויי התגבשות. זה צריך לדרוש רק כמה שניות כדי לבצע וניתן לעשות זאת תוך הצלחת הסמוכה נטענת. שם לב, למשל, שבארות מסוימות לא מלאו כראוי עשוי להדגיש את העובדה שבקצה מחלק מסוים מזרז שאינו מתפקד כהלכה. צריכה מסירה של mesophase לראות כדי להיות לא סדיר, הפריט הפגום הרלוונטי היית צריך להיות מתוקן באופן מיידי. בכך שציין בנושאים אלה וביצוע ההתאמות הרלוונטיות במהלך הגדרה תהיה לחסוך זמן וחומרים, כולל שומנים ובעל ערך חלבון קרום. אם imager משמש למעקב אחר גידול גביש, דיוק ויכולים גם להיות במעקב במהלך הדמיה. לדוגמה, בעיות שיטתיות עם טיפה או בולוסמיקום על ידי imager מצביע על כך שמשהו לא בסדר ושפעולה מתקנת איפשהו במעלה זרם בפרוטוקול היא זקוק. באינטרסים של ביצועים אמינים ולכן הרובוט חייב להיות מכויל על לוח זמנים קבוע ולפי צורך. כיולים צריכים לכלול נפח מזרז וmesophase נמסר כמו גם מיקום בולוס ופזיז בבאר. ברור, בכל המקום האפשרי כיול צריך להיעשות באמצעות כרכים וחומרים דומים לאלה שיהיו בשימוש בניסויים שנערכו בתקופה המכוסית בתרגיל בקרת האיכות. חשוב כמו כיול כך גם הוא שיש במלאי אספקה ​​נאותה של חלקי רובוט ואספקה. כישלונות קטסטרופליים ובלתי צפויים, חסימות וקריסות יכולות לקרות ואכן קורים. במקרה כזה, שזמין טיפ מסירת החלפה מאיצה, למשל, אולי זה אומר שהכנת חלבון קרום יקרה מאוד משמשת כמו שצריך ולא מתבזבז. חלק מהיתרונות של רובוט כולל את העובדה שזה יעבוד למעשה ברציפות וכי היא אינה סובלת מאו &#39;מתלונן על &quot;עייפות. רובוט יכול לשמש גם בתנאים שאינם נחשבים ידידותי לאדם, כמו בחושך, תחת תאורה נשלטת ותנאים סביבתיים, ובקצוות של טמפרטורה. הרובוטים הפגינו במאמר זה היו כל שימוש בתנאי סביבה ב~ 20 ° C. עם זאת, ישנם חלבונים ופרויקטים הדורשים טמפרטורות שאינן סביבה, אור מבוקר 11,12 וחמצון או סביבת הפחתת 13. כל אלה ניתן לדאוג גם ל, בקלות יחסית, כאשר רובוט התגבשות משמש. במאמר וידאו יופיטר מוקדם יותר הפגנו כמה ניסויי התגבשות ידי בשיטה טווה מוגדרים ידני 1. ההיקף המינימאלי של mesophase שניתן לוותר מהימן ביד מוגבל בy handedness חזותי חדות והיציב של האדם שהציב את הניסויים. מניסיוננו, כרכים של mesophase נמוך כמו 100 nl מטופלות בקלות. אנחנו יודעים ממעבדה אחת שבה נפח ברירת המחדל חלק ידני הוא כ 40 nl. עם זאת, כמויות קטנות יותר במידה ניכרת הן אפשריות באמצעות רובוט. בנפרד, יש לנו הראינו כי נפחי mesophase נמוך כמו 550 picoliters ניתן לוותר רובוט 14. שמהעבודה היה ברור שהמזעור נוסף על ידי רובוט הוא אפשרי שאם ייושם, יוביל לירידה גדולה בכמות חלבון קרום יקר הנדרש לביצוע ניסוי התגבשות. במאמר זה וידאו, שלושה רובוטים זמינים מסחרי שמשו להפגין התגבשות חלבון קרום תפוקה גבוהה באמצעות mesophases lipidic. הראשונה שבן פותחה בקבוצת MS &amp; FB מבוסס על ניסיוננו להקים ניסויים באופן ידני, כמתואר ביופיטר 1712 1. זה instrument יש לנו היכרות עם ביותר ואת חלק הארי של המאמר הנוכחי מוקדש לשימוש בו. שני הרובוטים האחרים היו בהפגנה בטרשת הנפוצה וקבוצת FB בזמן כתיבת המאמר והקטעים הרלוונטיים נכלל כאן באינטרסים של שלמות. כל שלושה הרובוטים מאוד להשתמש באותה המערכת mesophase מחלק, תכונה החיונית שבם היא מזרק זכוכית תזוזה חיובית 5,7. הם נבדלים באופן משמעותי ביותר בכל קשורים לאספקה ​​מזרזת. רובוטי 1 ו 2 יכולים לוותר מזרז במקביל ל8 בארות, טור אחד בצלחת התגבשות בכל פעם. בניגוד לכך, 3 רובוט dispenses כל 96 הפתרונים הנחפזים בפעולה אחת. רובוט 2 הוא הכלי היחיד עם טיפים חד פעמים נחפזות ניפוק. יש יתרונות וחסרונות הקשורים למכשירים השונים שתלויים ביישום המסוים, אלה לא הרחיבו על כאן. די לומר שכל השלוש העבודות והפיקו גבישים שליחלבוני mbrane ידי בשיטה טווה. הצעדים הבאים בתהליך הכולל של קביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה macromolecular הם לקציר ולגבישי cryo-מגניבים מצלחות שהוקמו כמתואר במאמר זה וידאו ולהקליט ועקיפים רנטגן תהליך מהם. נושאים אלה מכוסים במאמרי יופיטר נפרדים בסדרה 1,15 זה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> רכיבים </td></tr><tr><td> Brayer (רולר) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 50820937 </td><td> כלי </td></tr><tr><td> מזרקי גז הדוק </td><td> המילטון </td><td> 81030 </td><td> כלי </td></tr><tr><td> coverslips זכוכית </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> חד פעמי </td></tr><tr><td> לוחות זכוכית </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> חד פעמי </td></tr><tr><td> Gryphon LCP רובוט </td><td> האמנות רובינס </td><td> NA </td><td> כלי </td></tr><tr><td> בטווה רובוט </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> כלי </td></tr><tr><td> מחברת מעבדה </td><td> שונה </td><td> NA </td><td> כלי </td></tr><tr><td> יתוש LCP רובוט </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> כלי </td></tr><tr><td> קלטת spacer כפול מקל מחורר </td><td> סונדרס התאגיד (חור אגרוף-) </td><td> אישית </td><td> חד פעמי </td></tr><tr><td> פתרונות נחפזים </td><td> שונה </td><td> שונה </td><td> מגיב </td></tr><tr><td> מים מטוהרים </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> מגיב </td></tr><tr><td> גשם-X </td><td> טיפול ברכב פגז </td><td> 80199200 </td><td> מגיב </td></tr><tr><td> טיפי מזרק </td><td> המילטון </td><td> 7770-020 (מד 22) </td><td> כלי </td></tr><tr><td> רקמות </td><td> שונה </td><td> שונה </td><td> חד פעמי </td></tr><tr><td> מימייה </td><td> שונה </td><td> NA </td><td> מגיב </td></tr></tbody></table>

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בmesophases lipidic

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

מחקרי פונקצית מבנה של חלבוני קרום להפיק תועלת רבה מצורך ברזולוציה גבוהה מבני 3-D זמינים מהסוג הניתן באמצעות קריסטלוגרפיה של קרן ה-X macromolecular (MX). מרכיב חיוני של MX הוא אספקה ​​קבועה של אידיאלי גבישים עקיפים באיכות. בטווה או שיטת lipidic מעוקב שלב (LCP) לגיבוש חלבוני קרום הוא אחת מכמה שיטות זמינות לגיבוש חלבונים בממברנה. היא עושה שימוש בmesophase bicontinuous לגדול בה גבישים. כשיטה, יש לו כמה צלחות מרהיבות של מנוח ומשך תשומת לב רבה עם קבוצות מחקר רבות שמתעניייינות כעת בשימוש בו. אחד האתגרים הקשורים בשיטה הוא שmesophase האירוח הוא מאוד צמיג ודביק, מזכיר משחת שיניים עבה. לפיכך, מחלקו באופן ידני באופן לשעתק בנפחים קטנים לתוך בארות התגבשות דורשת מיומנות, סבלנות ויד יציבה. פרוטוקול לעושה juרח שפותח בממברנה הביולוגיה מבנית ותפקודית (MS &amp; FB) הקבוצה 1-3. מאמרי וידאו יופיטר המתארים את השיטה הם 1,4 זמין. הגישה הידנית להגדרה בטווה ניסויים יש יתרונות ברורים עם יישומים מיוחדים, כגון אופטימיזציה של גביש וderivatization. זה אולם סובל מלהיות שיטת תפוקה נמוכה. הנה, אנחנו מדגימים את פרוטוקול לביצוע ניסויים בהתגבשות טווה כמו רובוט. רובוט מציע את היתרונות של מהירות, דיוק, דיוק, מזעור ולהיות מסוגל לעבוד ברציפות במשך תקופות ממושכות תחת מה יכול להיחשב כתנאים עוינים כמו בחושך, באווירת צמצום או בטמפרטורות נמוכות או גבוהות. בטווה רובוט, כאשר משתמשים בו כראוי, יכול לשפר את הפרודוקטיביות של מבנה חלבון קרום ומחקר פונקציה מאוד על ידי קידום גיבוש שהוא אחד מהצעדים האיטיים בצינור קביעת מבנה כללי. במאמר זה וידאו, אנו מדגימים את השימוש בשלושה רובוטים זמינים מסחרי שיכול לוותר mesophase האינטגרלי לצמיג ודביק בcrystallogenesis טוו. הרובוט הראשון פותח בMS &amp; FB קבוצת 5,6. שני האחרים הפכו לאחרונה זמינים ונכללים כאן לשלמות. סקירה של הפרוטוקול המכוסה במאמר זה מוצגת באיור 1. כל המניפולציות שבוצעו בטמפרטורת חדר (~ 20 מעלות צלזיוס) בתנאי הסביבה.

במסמך מתואר גישה רובוטית להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בmesophases lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular ה-X. שלושה רובוטים המסוגל להתמודד mesophase הצמיג ודביק חלבון העמוס האינטגרלי לשיטה הם הציגו.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

מחקרים של קשרי מבנה-תפקוד בחלבוני ממברנה מפיקים תועלת רבה מזמינותן של מבנים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה, מהסוג המסופק באמצעות...

שלום וברוכים הבאים לקבוצת הביולוגיה המבנית והתפקודית של ממברנות. שמי מרטין קאפרי (Martin Caffery). זהו מאמר נוסף בסדרה של מאמרי JoVE על גבישבון של חלבוני ממברנה לקביעת מבנה באמצעות שיטת ה-in meso או שיטת הפאזה הקובית הליפידית (lipidic cubic phase).במאמר הראשון, JoVE 1 7 1 2, הדגמנו כיצד מכינים את הפאזה הקובית העמוסה בחלבון וכיצד מחלקים ידנית את פאזת ה-misa הצמיגית והדביקה לתוך פלטות זכוכית מסוג "סנדוויץ'" לצורך ניסויי גבישה. מאמר וידאו זה יתאר שיטות לשימוש ברובוט לגבישה in meso. רובוט מציע יתרונות של מהירות, דיוק, מיניאטוריזציה ויכולת לעבוד לפרקי זמן ממושכים בתנאים לא נוחים, כגון בחושך או בטמפרטורות נמוכות.שימוש נכון ברובוטים יכול לשפר משמעותית את הפרודוקטיביות של מחקר על מבנה ותפקוד של חלבוני ממברנה. במאמר וידאו זה, אנו מדגימים את השימוש בשלושה רובוטים הזמינים מסחרית. הרובוט הראשון פותח בקבוצת הביולוגיה המבנית והפונקציונלית של הממברנה, והוא מתואר בפירוט במקור מספר אחת.שניים אחרים הפכו לזמינים רק לאחרונה ונכללו כאן למען השלמות. הכנת פלטת הגבישה להגדרה של ניסוי גבישה רובוטי מתחילה בהכנת פלטת הבסיס של פלטת גבישת סנדוויץ' הזכוכית המתוארת בפירוט במקור; ראשית יש לסלילז (siloize) את פלטת הבסיס, ולאחר מכן יש להחיל על הפלטה את המפריד המחורר בעל הדבקה כפולה היוצר את הבארות. החומרים הדרושים לכך מוצגים כאן.הם כוללים פלטת בסיס זכוכית להתגבשות, מחשוף מרווח דורן מנוקב לתמיסת הגבשה, גלגלת או בראייר, נייר סופג וכלי כימי עם מים מזוקקים. הפלטה מונחת על נייר סופג על גבי משטח העבודה. מספר טיפות של תמיסתו מופעלות ולאחר מכן מפוזרות באופן אחיד על פני שטח הפלטה בעזרת נייר סופג.שוטפים את הפלטה מתמיסת הסיליקציה העודפת על ידי טבילה מלאה בכלי כימי עם מים. מוציאים את הפלטה מהכלי ומניחים אותה על נייר סופג יבש. מניחים את הצד שעבר סיליקציה כלפי מעלה ומייבשים את פניו החשופים בניגוב קל בעזרת ניירות סופג.בשלב הבא, מסירים את כיסוי ההגנה מהספייסר המנוקב בעל הדבק הכפול ומצמידים את הספייסר למשטח הסיליליזציה של לוחית הזכוכית. חשוב שהספייסר ימוקם כהלכה על לוחית הבסיס, כך שהפינה השמאלית העליונה ושני הצדדים הסמוכים של הספייסר והלוחית יהיו חופפים. משתמשים בגלגלת או בבראייר (brayer) כדי להחליק את הספייסר על לוחית הבסיס וליצור ביניהם אטם הדוק.בסוגריים, נציין כי פלטות מופרדות (siloized plates) הכוללות ספייסרים מחוררים זמינות לרכישה מסחרית כפי שמתואר בסעיף המקורות. לאחר הכנת פלטת הבסיס לגביש, נמשיך כעת להגדרות ולשימוש ברובוט ה-in meso. כפי שיצוין בהמשך, אנו מדגימים את השימוש בשלושה רובוטים מסוג in meso.בכל המקרים המוצגים, הרובוטים מותקנים ונעשה בהם שימוש בחדר עם בקרת טמפרטורה המכוון ל-20 °C. ה-meso robot one, הראשון מסוג meso robot שמוצג בסרטון זה, פותח במעבדתו של ה-PI וכעת הוא זמין למסחר. פרטים מלאים ניתן למצוא בסעיף המקורות.החומרים והציוד הדרושים להקמת ניסוי התגבשות באופן רובוטי מוצגים כאן. אלו כוללים מחברת מעבדה, תמיסת חלבון, שהוכנה טרי כפי שמתואר במאמר Jo מספר 1 7 1 2 ונשמרת במזרק Hamilton. פלטות בסיס סיליקוניות עם מפרידים וזכוכית כיסוי תואמת, בקבוק מים ונייר ספיגה, והרובוט in miso.המבט הראשון הוא של הרובוט כאשר הסיפון שלו פנוי. המבט הבא הוא של הרובוט כשהוא כולל את תחנת החנייה של המכשיר להלחות, את לוח הבסיס לגבישב ובלוק בארי בארי (deep well block) המכיל תמיסות משקיעות. נתחיל את ההגדרה על ידי הנחת לוח הבסיס על סיפון הרובוט.יש לו פלטפורמה משלו, המסומנת בבירור עם מיקומי בארות לצורך יישור לוח הבסיס. יש לסמן את הלוח בבירור לצורכי זיהוי. בלוק 96 הבארים המכיל תמיסות משקיעות מקובע בפלטפורמה משלו על סיפון הרובוט, לצד לוח ההתגבשות.את הבלוק פותחים על ידי קילוף זהיר של מכסה הפלסטיק העליון. זרם הלחות מהמכשיר להלחות מופנה כך שיזרום מעל ומעל פני לוח הבסיס שעל סיפון הרובוט. את הרובוט מאתחלים בהתאם להוראות היצרן.לא נדגים זאת כאן בפירוט, מכיוון שהפרוטוקולים המדויקים ישתנו עם הזמן. בעיקרון, במהלך השלב הראשוני (initialization), זרוע חלוקת ה-mease ברובוט מקבלת נקודות ייחוס בשלושה כיוונים אורטוגונליים: x, Y ו-Z. לאחר מכן, שלב ה-meza המועמס בחלבון בתוך מזרק Hamilton עם מחט חלוקה מחובר לזרוע אחת של הרובוט; פרטים מלאים על אופן הכנת שלב ה-meza והמזרק מתוארים במאמר JoVE 1712 ובמקור מספר 1. כעת יש להתאים את קצה המחט של מזרק החלוקה לתחתית ולמרכז הבאר העליונה ביותר בפינה השמאלית של פלטת ההתגבשות. הדבר תואם למזהה באר A1, כאשר הפעולה הראשונה היא התאמה לתחתית באר A1.פעולה זו מבוצעת על ידי התאמת הגובה או קואורדינטת Z של זרוע החלוקה, תוך מעקב אחר המרחק של קצה המחט מקו הבסיס של הבאר. ניתן לקבוע שהקצה נוגע בדיוק בתחתית הבאר על ידי הזזת הפלטה ביד מצד לצד על הפלטפורמה, תוך התאמה קלה מאוד של גובה זרוע החלוקה; קואורדינטת Z של זרוע החלוקה שבה הקצה נוגע בפלטה מוזנת למחשב. החלוקה מתוכננת להתבצע כאשר קצה המחט נמצא במרחק של מספר מיקרומטרים מעמדת Z ייחוס זו, המקבילה לפני השטח של פלטת הבסיס. לאחר מכן, הרובוט מופעל כדי לעבור סדרת שלבים המונחים על ידי המשתמש, במטרה למקם את קצה המחט במרכז באור A1.קואורדינטות ה-XY של נקודת הייחוס של זרוע הדיספנסिंग, שבה קצה הטיפ ממוקם במרכז, שמורות במחשב השולט ברובוט. הן משמשות להגדרת המרכז של שאר הבארים בלוחית. לאחר הגדרת קואורדינטות ייחוס אלו במחשב, זרוע הדיספנסिंग מונחית לחזור לעמדת ההתחלה שלה, תוך ביצוע ה priming למזרק.כעת יש להכין (prime) את מזרק החלוקה. פעולה זו מבוצעת כדי להבטיח שתמיסת mease טרייה תמלא את מחט החלוקה ושהבאר הראשונה בלוח תקבל את הכמות המלאה של mease. בתוכנה המפעילה את הרובוט קיימת פקודת priming להפעלת תהליך זה.פעולה זו גורמת לבוכנה במזרק להתקדם בשלבים תחת בקרת המשתמש. בזמן שפעולה זו מתרחשת, קצה המחט נבדק כדי לראות אם נוצרה פאזה של בועות או חומר; פאזה כזו מוסרת באמצעות נייר ספיגה. בכך נשלם תהליך ההכנה (priming) להפעלת הרובוט.הרובוט מוכן כעת להפעלה במצב אוטומטי להבדילו מהפעלת ההרצה. תוכנית Robot XAP מתחילה סבב של שלבי שטיפה שבו קצות הפי펫 להגשת המשקיף בזרוע השנייה של הרובוט נשטפים ומוכנים לשאיבת תמיסות משקיף מבלוק הבארות העמוקות; הפעלת פונקציית ההגשה ברובוט מניעה את הטעינה הרצופית של הבארות בתמיסות חלבון, תחילה בשמונה בארות בכל פעם, ולאחריהן תמיסות משקיף בין ההגשות. זרוע הגשת החלבון חוזרת לעמדת חנייה שבה קצה המחט מונח בספוג לח כדי למנוע את התייבשות החלבון שבקצה.בדרך כלל, הערכים המשמשים בניסיוני גבישה המבוצעים בקבוצה לביולוגיה מבנית ותפקודית במערכת ממברנה הם 50 nanoliters של mease ו-800 nanoliters של תמיסת משקיע. התוכנית המפעילה את הרובוט בהדגמה זו הוגדרה כך ששתי הזרועות נעות בו-זמנית.בדרך זו, ניתן להשלים את מילוי פלטת 96 בארות בנמד ומשקיף תוך חמש דקות. מיד עם מילוי הפלטה וחזרת זרועות הרובוט לעמדות החניה שלהן, מוציאים את הפלטה ממשטח הרובוט ומניחים אותה על משטח יציב ושטוח.מניחים בעדינות זכוכית כיסוי מעל ללוח הבסיס, במגע עם השטח הדביק העליון של המפריד. חשוב לוודא שכל 96 הבארות מכוסות במלואן, שזכוכית הכיסוי מיושרת בניצב ללוח הבסיס וששום חלק מזכוכית הכיסוי אינו חורג מטביעת העקבות של לוח הבסיס. משתמשים בגלילה או בבנייזר כדי ליצור אטום הדוק ואחיד בין זכוכית הכיסוי למפריד.בשלב זה יש לבחון את הפלטה כדי לוודא שההכנה בוצעה כראוי. המטרה היא לראות מראה הדומה לביצת חביתה במחבת. בכל באר, החלמון של הביצה תואם לשלב המזה (meza).חלבון הביצה הוא תמיסת המשקיעה, ושפת המחבת היא היקף ההתגבשות. באופן אידיאלי, שלושתם קונצנטריים. הפלטה מוכנה כעת להצבה באזור אחסון בעל טמפרטורה מבוקרת לצורך גדילת הגבישים.אם אין צורך בהכנת פלטות נוספות, יש להסיר את בלוק המשקיע ממשטח הרובוט, לאטום אותו כראוי ולהחזירו לאחסון. את המזרק המכיל את ה-mease מסירים מזרוע ההגשה של הרובוט, ומפרקים את חלקיו השונים, כולל מחט ההגשה וה-ferial. יש לשטוף אותם בזהירות במתנול ולייבש אותם כהכנה לשימוש הבא ברובוט Meso two mosquito LCP.סרטון הווידאו הבא מציג את הרובוט mosquito LCP שניתן להשתמש בו בהקמה של ניסויי קריסטליזציה in meso. הוא כולל מערכת לדיספנסינג של פאזה meph הדומה לזו שתוארה קודם לכן במאמר זה. עם זאת, ברובוט אחד, המשקיף (precipitant) מועבר באמצעות טיפים חד-פעמיים.המכשיר עצמו מוצג כאן. הוא כולל משטח שעליו מונחים פלטת ההתגבשות ובלוק המשקיע, תא עם חלונות לבקרת לחות. במבט זה, החלונות של תא הלחות פתוחים, וניתן לראות סליל עם קצות פיפטה (tips), זרוע חלוקה למדידה, וחיישן מבוסס לייזר לקביעת מיקומו של מחט חלוקת פאזת ה-meph.פלטפורמה מוגבהת שעליה מונחת פלטת ההתגבשות ופלטפורמה שקועה להחזקת בלוק מסך המשקיעים. ברצף זה, הרובוט עבר סדרת פעולות אתחול בעת הדלקת המכשיר. תוכנת תכנות משמשת להגדרת המכשיר לעבודה עם פלטות התגבשות ובלוקים של משקיעים ספציפיים, ולהזרקת נפחים קבועים של תמיסות ומשקיעים ברצף מוגדר.פרטים אלו מסופקים על ידי היצרן ולא יוצגו כאן. הגדרת פלטת התגבשות באמצעות הרובוט מתחילה באופן הבא: מזרק Hamilton המצויד במחט ומלא בתמיסת חלבון מוכן כפי שתיאור לעיל תחת "in meso robot one" וב-JoVE 1 7 1 2. המזרק מקובע במיקומו תחת זרוע החלוקה של הרובוט.קואורדינטות x ו-y של המחט במזרק ההגשה נקבעות באמצעות חיישן הלייזר המותקן על הפלטפורמה. זהו שלב חשוב הנדרש כדי להבטיח שה-mease יוגש במדויק למרכזו של כל באר בלוח ההתגבשות. בלחיצת כפתור בלוח הבקרה, המזרק מוכן להזרמת ה-mease מקצה המחט.לאחר מכן מסירים את השאריות שנחרטו באמצעות טישיו, כהכנה להטענת הבארות באמצעות הרובוט לפני הצבת פלטת הגבישה על משטח הרובוט. מרטיבים את פני השטח של הפלטפורמה בכמה טיפות מים כדי להחזיק את הפלטה במקומה. באמצעות קפילרה, מסירים את המכסה המגן מהפלטה ומניחים את הפלטה בחוזקה על הפלטפורמה שלה כדי להבטיח היצמדות טובה.על הפלטפורמה קיימים שלושה סימני ייחוס שמעליהם ממרכזים את שלוש בארות הפינה כדי להבטיח מיקום נכון של הפלטה ביחס לקצה מחט החלוקה, כעת המכשיר מוכן להתחיל במחזור הגדרה. שלב זה מתחיל בצעד הטרייה שני, שבו מחלקים Mease על פלטת זכוכית קטנה מיד לפני מעבר לטעינת הפלטה ב-mease טרי. ברצף זה, אנו רואים את הרובוט טוען תחילה mease לעמודה אנכית של שמונה בארות על הפלטה, ולאחר מכן משתמש בקצוות חד-פעמיים כדי לחלק תמיסת משקיעה מעל גוש ה-mease.תהליך זה חוזר 11 פעמים לאורך הפלטה עד שכל הבארים מלאות. התהליך כולו אורך כחמש דקות. בסרטון זה, נעמדו 50 nanoliters של Mease ו-800 nanoliters של תמיסת משקיע לכל באר.את הפלטה הממולאת מוציאים מפלטפורמת הרובוט המוצב על השולחן. מניחים את זכוכית הכיסוי ואוטמים את הפלטה בעזרת bra כפי שתואר לעיל ב-miso robot one. כעת ניתן להניח את הפלטה, המסומנת כראוי, בסביבה בטמפרטורה מבוקרת לצמיחת גבישים ב-Meso robot three, ה-Griffin LCP.סרטון וידאו זה מציג את הרובוט Griffin LCP בשימוש להקמה של ניסויי גביש במדיום (in meso crystallization). ה-Griffin כולל מערכת חלוקה של פאזת הלביד (lipid phase) דומה לזו שתוארה לעיל עבור רובוט מספר אחת. במקרה זה, עם זאת, כל 96 תמיסאות המשקיעות מחולקות בו-זמנית.המכשיר עצמו מוצג כאן. הוא כולל משטח שעליו מונחים פלטת ההתגבשות ובלוק המשקיע, זרוע חלוקה מדויקת וראש פיפטינג Phoenix 96. לצורך חלוקת תמיסות משקיעות, פעולת הרובוט מוצגת ברצף הסרטון האחרון הזה.ראש ה-96 טיפים נטען תחילה בתמיסת משקיע. ניתן להגדיר השהיה כדי להקל על שאיבת משקיעים צמיגיים. שלב ה-MEA מועבר באופן רציף ל-96 הבארות בתהליך שארכו כדקה.לבסוף, ראש ה-96 פיפטיות מחלק את כל 96 תמיסות המשקיעה בו-זמנית מעל בולוסי של פאזת MEA בבארות ההתגבשות. תהליך טעינת הפלטה כולו מסתיים תוך שתי דקות. הפלטה המלאה מוסרת ממשטח הרובוט, נאטמת באמצעות זכוכית כיסוי ומוצבת באחסון בתנאי טמפרטורה מבוקרים לצורך צמיחת הגבישים.השלבים הבאים בתהליך הכולל של קביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה של מקרו-מולקולות הם קציר וקירור קריוגני של הגבישים, והקלטה ועיבוד של עקיפת קרני X מהם. נושאים אלו מכוסים במאמרים נפרדים בסדרה זו.

use-robot-for-high-throughput-crystallization-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בזאת הוא תיאר את ההליך מיושם קבוצת מבניים ותפקודיים ביולוגיה קאפרי ממברנה להגדיר באופן ידני ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

הפרוטוקולים מתארים את הצעדים החיוניים לקבלת איכות עקיפה גבישים של חלבון ממברנה החל הכינון מחדש של החלבון בשלב מעוקב lipidic (LCP), מציאת התנאים הראשוניים עם LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני, הגדרת ניסויים התגבשות LCP וקריסטלים קציר .

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Bicelles הם תערובות שומנים / amphiphile כי לשמור על חלבונים בממברנה (הפרלמנט) בתוך bilayer השומנים אבל יש שלב התנהגות ייחודית המאפשרת תפוקה גבוהה סינון על ידי רובוטים התגבשות. טכניקה זו ייצרה בהצלחה מספר ברזולוציה גבוהה מבנים משני מקורות פרוקריוטים ו האיקריוטים. וידאו זה מתאר פרוטוקולים ליצירת תערובת lipidic bicelle, המאגדת חברי פרלמנט לתוך התערובת bicelle, הקמת crystallizations ניסויים (באופן ידני, כמו גם רובוט) וקריסטלים קצירת מן המדיום.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

במסמך מתואר נהלים המיושמים בממברנה קבוצת ביולוגיה המבנית ופונקציונלית לגבישי חלבון קרום קציר וcryo-מגניב שגודלו בשלבים עוקבים וספוג lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן קאפרי.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

מערכות אוטומטיות, פרוטוקולים עבור הכנת כמות גדולה של מסכי שגרתית ו nanoliter טיפות התגבשות לניסויים דיפוזיה אדי תיאר, דנו.

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

הפרוטוקול המוצג מתאר גישה פשוטה לסינון תנאי התגבשות חלבונים וגדילת גבישים באמצעות צלחת דיאליזה בעלת תפוקה גבוהה של 96 בארות. השימוש בשפופרות דיאלייזר לגידול בקנה מידה גדול של מיקרו-גבישים מודגם גם עבור קריסטלוגרפיה טורית ויישומי MicroED.

התגבשות חלבון בתפוקה גבוהה באמצעות מיקרודיאליזה

פרוטוקול זה מפרט סינון התגבשות בתפוקה גבוהה, החל מהכנת 1,536 לוחות מיקרו-אסאי ועד לסוף חלון זמן ניסיוני של 6 שבועות. פרטים כלולים על הגדרת הדגימה, ההדמיה המתקבלת וכיצד משתמשים יכולים לבצע ניתוחים באמצעות ממשק משתמש גרפי התומך בבינה מלאכותית כדי לזהות במהירות וביעילות תנאי התגבשות מקרומולקולרית.

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

הערכת דו ממדי (2D) ניסויים התגבשות להקמת מערכי חלבון הורה הממברנה היא משימה קריטית מאוד קשה קריסטלוגרפיה אלקטרונים. כאן אנו מתארים את הגישה שלנו ההקרנה וזיהוי 2D גבישים של חלבונים בממברנה קטן בעיקר בטווח של 15 - 90kDa.

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

מבנה 3-D של מולקולה מספק הבנה ייחודית של כמה פונקציות מולקולה. השיטה העיקרית לקביעת המבנה ברזולוציה כמעט אטומי הוא רנטגן קריסטלוגרפיה. כאן, אנו להדגים את השיטות הקיימות לקבלת גבישים תלת ממדי של מקרומולקולה נתון זה מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

למדו להשתמש ברובוטים להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבוני ממברנה במזופאזות ליפידיות. שלושה רובוטים מסחריים מדגימים שיפור במהירות, דיוק ושחזור בניסויים קריסטלוגרפיים.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

גלה סרטונים נוספים