שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

שלום וברוכים הבאים לקבוצת הביולוגיה המבנית והתפקודית של ממברנות. שמי מרטין קאפרי (Martin Caffery). זהו מאמר נוסף בסדרה של מאמרי JoVE על גבישבון של חלבוני ממברנה לקביעת מבנה באמצעות שיטת ה-in meso או שיטת הפאזה הקובית הליפידית (lipidic cubic phase).

במאמר הראשון, JoVE 1 7 1 2, הדגמנו כיצד מכינים את הפאזה הקובית העמוסה בחלבון וכיצד מחלקים ידנית את פאזת ה-misa הצמיגית והדביקה לתוך פלטות זכוכית מסוג "סנדוויץ'" לצורך ניסויי גבישה. מאמר וידאו זה יתאר שיטות לשימוש ברובוט לגבישה in meso. רובוט מציע יתרונות של מהירות, דיוק, מיניאטוריזציה ויכולת לעבוד לפרקי זמן ממושכים בתנאים לא נוחים, כגון בחושך או בטמפרטורות נמוכות.

שימוש נכון ברובוטים יכול לשפר משמעותית את הפרודוקטיביות של מחקר על מבנה ותפקוד של חלבוני ממברנה. במאמר וידאו זה, אנו מדגימים את השימוש בשלושה רובוטים הזמינים מסחרית. הרובוט הראשון פותח בקבוצת הביולוגיה המבנית והפונקציונלית של הממברנה, והוא מתואר בפירוט במקור מספר אחת.

שניים אחרים הפכו לזמינים רק לאחרונה ונכללו כאן למען השלמות. הכנת פלטת הגבישה להגדרה של ניסוי גבישה רובוטי מתחילה בהכנת פלטת הבסיס של פלטת גבישת סנדוויץ' הזכוכית המתוארת בפירוט במקור; ראשית יש לסלילז (siloize) את פלטת הבסיס, ולאחר מכן יש להחיל על הפלטה את המפריד המחורר בעל הדבקה כפולה היוצר את הבארות. החומרים הדרושים לכך מוצגים כאן.

הם כוללים פלטת בסיס זכוכית להתגבשות, מחשוף מרווח דורן מנוקב לתמיסת הגבשה, גלגלת או בראייר, נייר סופג וכלי כימי עם מים מזוקקים. הפלטה מונחת על נייר סופג על גבי משטח העבודה. מספר טיפות של תמיסתו מופעלות ולאחר מכן מפוזרות באופן אחיד על פני שטח הפלטה בעזרת נייר סופג.

שוטפים את הפלטה מתמיסת הסיליקציה העודפת על ידי טבילה מלאה בכלי כימי עם מים. מוציאים את הפלטה מהכלי ומניחים אותה על נייר סופג יבש. מניחים את הצד שעבר סיליקציה כלפי מעלה ומייבשים את פניו החשופים בניגוב קל בעזרת ניירות סופג.

בשלב הבא, מסירים את כיסוי ההגנה מהספייסר המנוקב בעל הדבק הכפול ומצמידים את הספייסר למשטח הסיליליזציה של לוחית הזכוכית. חשוב שהספייסר ימוקם כהלכה על לוחית הבסיס, כך שהפינה השמאלית העליונה ושני הצדדים הסמוכים של הספייסר והלוחית יהיו חופפים. משתמשים בגלגלת או בבראייר (brayer) כדי להחליק את הספייסר על לוחית הבסיס וליצור ביניהם אטם הדוק.

בסוגריים, נציין כי פלטות מופרדות (siloized plates) הכוללות ספייסרים מחוררים זמינות לרכישה מסחרית כפי שמתואר בסעיף המקורות. לאחר הכנת פלטת הבסיס לגביש, נמשיך כעת להגדרות ולשימוש ברובוט ה-in meso. כפי שיצוין בהמשך, אנו מדגימים את השימוש בשלושה רובוטים מסוג in meso.

בכל המקרים המוצגים, הרובוטים מותקנים ונעשה בהם שימוש בחדר עם בקרת טמפרטורה המכוון ל-20 °C. ה-meso robot one, הראשון מסוג meso robot שמוצג בסרטון זה, פותח במעבדתו של ה-PI וכעת הוא זמין למסחר. פרטים מלאים ניתן למצוא בסעיף המקורות.

החומרים והציוד הדרושים להקמת ניסוי התגבשות באופן רובוטי מוצגים כאן. אלו כוללים מחברת מעבדה, תמיסת חלבון, שהוכנה טרי כפי שמתואר במאמר Jo מספר 1 7 1 2 ונשמרת במזרק Hamilton. פלטות בסיס סיליקוניות עם מפרידים וזכוכית כיסוי תואמת, בקבוק מים ונייר ספיגה, והרובוט in miso.

המבט הראשון הוא של הרובוט כאשר הסיפון שלו פנוי. המבט הבא הוא של הרובוט כשהוא כולל את תחנת החנייה של המכשיר להלחות, את לוח הבסיס לגבישב ובלוק בארי בארי (deep well block) המכיל תמיסות משקיעות. נתחיל את ההגדרה על ידי הנחת לוח הבסיס על סיפון הרובוט.

יש לו פלטפורמה משלו, המסומנת בבירור עם מיקומי בארות לצורך יישור לוח הבסיס. יש לסמן את הלוח בבירור לצורכי זיהוי. בלוק 96 הבארים המכיל תמיסות משקיעות מקובע בפלטפורמה משלו על סיפון הרובוט, לצד לוח ההתגבשות.

את הבלוק פותחים על ידי קילוף זהיר של מכסה הפלסטיק העליון. זרם הלחות מהמכשיר להלחות מופנה כך שיזרום מעל ומעל פני לוח הבסיס שעל סיפון הרובוט. את הרובוט מאתחלים בהתאם להוראות היצרן.

לא נדגים זאת כאן בפירוט, מכיוון שהפרוטוקולים המדויקים ישתנו עם הזמן. בעיקרון, במהלך השלב הראשוני (initialization), זרוע חלוקת ה-mease ברובוט מקבלת נקודות ייחוס בשלושה כיוונים אורטוגונליים: x, Y ו-Z. לאחר מכן, שלב ה-meza המועמס בחלבון בתוך מזרק Hamilton עם מחט חלוקה מחובר לזרוע אחת של הרובוט; פרטים מלאים על אופן הכנת שלב ה-meza והמזרק מתוארים במאמר JoVE 1712 ובמקור מספר 1. כעת יש להתאים את קצה המחט של מזרק החלוקה לתחתית ולמרכז הבאר העליונה ביותר בפינה השמאלית של פלטת ההתגבשות. הדבר תואם למזהה באר A1, כאשר הפעולה הראשונה היא התאמה לתחתית באר A1.

פעולה זו מבוצעת על ידי התאמת הגובה או קואורדינטת Z של זרוע החלוקה, תוך מעקב אחר המרחק של קצה המחט מקו הבסיס של הבאר. ניתן לקבוע שהקצה נוגע בדיוק בתחתית הבאר על ידי הזזת הפלטה ביד מצד לצד על הפלטפורמה, תוך התאמה קלה מאוד של גובה זרוע החלוקה; קואורדינטת Z של זרוע החלוקה שבה הקצה נוגע בפלטה מוזנת למחשב. החלוקה מתוכננת להתבצע כאשר קצה המחט נמצא במרחק של מספר מיקרומטרים מעמדת Z ייחוס זו, המקבילה לפני השטח של פלטת הבסיס. לאחר מכן, הרובוט מופעל כדי לעבור סדרת שלבים המונחים על ידי המשתמש, במטרה למקם את קצה המחט במרכז באור A1.

קואורדינטות ה-XY של נקודת הייחוס של זרוע הדיספנסिंग, שבה קצה הטיפ ממוקם במרכז, שמורות במחשב השולט ברובוט. הן משמשות להגדרת המרכז של שאר הבארים בלוחית. לאחר הגדרת קואורדינטות ייחוס אלו במחשב, זרוע הדיספנסिंग מונחית לחזור לעמדת ההתחלה שלה, תוך ביצוע ה priming למזרק.

כעת יש להכין (prime) את מזרק החלוקה. פעולה זו מבוצעת כדי להבטיח שתמיסת mease טרייה תמלא את מחט החלוקה ושהבאר הראשונה בלוח תקבל את הכמות המלאה של mease. בתוכנה המפעילה את הרובוט קיימת פקודת priming להפעלת תהליך זה.

פעולה זו גורמת לבוכנה במזרק להתקדם בשלבים תחת בקרת המשתמש. בזמן שפעולה זו מתרחשת, קצה המחט נבדק כדי לראות אם נוצרה פאזה של בועות או חומר; פאזה כזו מוסרת באמצעות נייר ספיגה. בכך נשלם תהליך ההכנה (priming) להפעלת הרובוט.

הרובוט מוכן כעת להפעלה במצב אוטומטי להבדילו מהפעלת ההרצה. תוכנית Robot XAP מתחילה סבב של שלבי שטיפה שבו קצות הפי펫 להגשת המשקיף בזרוע השנייה של הרובוט נשטפים ומוכנים לשאיבת תמיסות משקיף מבלוק הבארות העמוקות; הפעלת פונקציית ההגשה ברובוט מניעה את הטעינה הרצופית של הבארות בתמיסות חלבון, תחילה בשמונה בארות בכל פעם, ולאחריהן תמיסות משקיף בין ההגשות. זרוע הגשת החלבון חוזרת לעמדת חנייה שבה קצה המחט מונח בספוג לח כדי למנוע את התייבשות החלבון שבקצה.

בדרך כלל, הערכים המשמשים בניסיוני גבישה המבוצעים בקבוצה לביולוגיה מבנית ותפקודית במערכת ממברנה הם 50 nanoliters של mease ו-800 nanoliters של תמיסת משקיע. התוכנית המפעילה את הרובוט בהדגמה זו הוגדרה כך ששתי הזרועות נעות בו-זמנית.

בדרך זו, ניתן להשלים את מילוי פלטת 96 בארות בנמד ומשקיף תוך חמש דקות. מיד עם מילוי הפלטה וחזרת זרועות הרובוט לעמדות החניה שלהן, מוציאים את הפלטה ממשטח הרובוט ומניחים אותה על משטח יציב ושטוח.

מניחים בעדינות זכוכית כיסוי מעל ללוח הבסיס, במגע עם השטח הדביק העליון של המפריד. חשוב לוודא שכל 96 הבארות מכוסות במלואן, שזכוכית הכיסוי מיושרת בניצב ללוח הבסיס וששום חלק מזכוכית הכיסוי אינו חורג מטביעת העקבות של לוח הבסיס. משתמשים בגלילה או בבנייזר כדי ליצור אטום הדוק ואחיד בין זכוכית הכיסוי למפריד.

בשלב זה יש לבחון את הפלטה כדי לוודא שההכנה בוצעה כראוי. המטרה היא לראות מראה הדומה לביצת חביתה במחבת. בכל באר, החלמון של הביצה תואם לשלב המזה (meza).

חלבון הביצה הוא תמיסת המשקיעה, ושפת המחבת היא היקף ההתגבשות. באופן אידיאלי, שלושתם קונצנטריים. הפלטה מוכנה כעת להצבה באזור אחסון בעל טמפרטורה מבוקרת לצורך גדילת הגבישים.

אם אין צורך בהכנת פלטות נוספות, יש להסיר את בלוק המשקיע ממשטח הרובוט, לאטום אותו כראוי ולהחזירו לאחסון. את המזרק המכיל את ה-mease מסירים מזרוע ההגשה של הרובוט, ומפרקים את חלקיו השונים, כולל מחט ההגשה וה-ferial. יש לשטוף אותם בזהירות במתנול ולייבש אותם כהכנה לשימוש הבא ברובוט Meso two mosquito LCP.

סרטון הווידאו הבא מציג את הרובוט mosquito LCP שניתן להשתמש בו בהקמה של ניסויי קריסטליזציה in meso. הוא כולל מערכת לדיספנסינג של פאזה meph הדומה לזו שתוארה קודם לכן במאמר זה. עם זאת, ברובוט אחד, המשקיף (precipitant) מועבר באמצעות טיפים חד-פעמיים.

המכשיר עצמו מוצג כאן. הוא כולל משטח שעליו מונחים פלטת ההתגבשות ובלוק המשקיע, תא עם חלונות לבקרת לחות. במבט זה, החלונות של תא הלחות פתוחים, וניתן לראות סליל עם קצות פיפטה (tips), זרוע חלוקה למדידה, וחיישן מבוסס לייזר לקביעת מיקומו של מחט חלוקת פאזת ה-meph.

פלטפורמה מוגבהת שעליה מונחת פלטת ההתגבשות ופלטפורמה שקועה להחזקת בלוק מסך המשקיעים. ברצף זה, הרובוט עבר סדרת פעולות אתחול בעת הדלקת המכשיר. תוכנת תכנות משמשת להגדרת המכשיר לעבודה עם פלטות התגבשות ובלוקים של משקיעים ספציפיים, ולהזרקת נפחים קבועים של תמיסות ומשקיעים ברצף מוגדר.

פרטים אלו מסופקים על ידי היצרן ולא יוצגו כאן. הגדרת פלטת התגבשות באמצעות הרובוט מתחילה באופן הבא: מזרק Hamilton המצויד במחט ומלא בתמיסת חלבון מוכן כפי שתיאור לעיל תחת "in meso robot one" וב-JoVE 1 7 1 2. המזרק מקובע במיקומו תחת זרוע החלוקה של הרובוט.

קואורדינטות x ו-y של המחט במזרק ההגשה נקבעות באמצעות חיישן הלייזר המותקן על הפלטפורמה. זהו שלב חשוב הנדרש כדי להבטיח שה-mease יוגש במדויק למרכזו של כל באר בלוח ההתגבשות. בלחיצת כפתור בלוח הבקרה, המזרק מוכן להזרמת ה-mease מקצה המחט.

לאחר מכן מסירים את השאריות שנחרטו באמצעות טישיו, כהכנה להטענת הבארות באמצעות הרובוט לפני הצבת פלטת הגבישה על משטח הרובוט. מרטיבים את פני השטח של הפלטפורמה בכמה טיפות מים כדי להחזיק את הפלטה במקומה. באמצעות קפילרה, מסירים את המכסה המגן מהפלטה ומניחים את הפלטה בחוזקה על הפלטפורמה שלה כדי להבטיח היצמדות טובה.

על הפלטפורמה קיימים שלושה סימני ייחוס שמעליהם ממרכזים את שלוש בארות הפינה כדי להבטיח מיקום נכון של הפלטה ביחס לקצה מחט החלוקה, כעת המכשיר מוכן להתחיל במחזור הגדרה. שלב זה מתחיל בצעד הטרייה שני, שבו מחלקים Mease על פלטת זכוכית קטנה מיד לפני מעבר לטעינת הפלטה ב-mease טרי. ברצף זה, אנו רואים את הרובוט טוען תחילה mease לעמודה אנכית של שמונה בארות על הפלטה, ולאחר מכן משתמש בקצוות חד-פעמיים כדי לחלק תמיסת משקיעה מעל גוש ה-mease.

תהליך זה חוזר 11 פעמים לאורך הפלטה עד שכל הבארים מלאות. התהליך כולו אורך כחמש דקות. בסרטון זה, נעמדו 50 nanoliters של Mease ו-800 nanoliters של תמיסת משקיע לכל באר.

את הפלטה הממולאת מוציאים מפלטפורמת הרובוט המוצב על השולחן. מניחים את זכוכית הכיסוי ואוטמים את הפלטה בעזרת bra כפי שתואר לעיל ב-miso robot one. כעת ניתן להניח את הפלטה, המסומנת כראוי, בסביבה בטמפרטורה מבוקרת לצמיחת גבישים ב-Meso robot three, ה-Griffin LCP.

סרטון וידאו זה מציג את הרובוט Griffin LCP בשימוש להקמה של ניסויי גביש במדיום (in meso crystallization). ה-Griffin כולל מערכת חלוקה של פאזת הלביד (lipid phase) דומה לזו שתוארה לעיל עבור רובוט מספר אחת. במקרה זה, עם זאת, כל 96 תמיסאות המשקיעות מחולקות בו-זמנית.

המכשיר עצמו מוצג כאן. הוא כולל משטח שעליו מונחים פלטת ההתגבשות ובלוק המשקיע, זרוע חלוקה מדויקת וראש פיפטינג Phoenix 96. לצורך חלוקת תמיסות משקיעות, פעולת הרובוט מוצגת ברצף הסרטון האחרון הזה.

ראש ה-96 טיפים נטען תחילה בתמיסת משקיע. ניתן להגדיר השהיה כדי להקל על שאיבת משקיעים צמיגיים. שלב ה-MEA מועבר באופן רציף ל-96 הבארות בתהליך שארכו כדקה.

לבסוף, ראש ה-96 פיפטיות מחלק את כל 96 תמיסות המשקיעה בו-זמנית מעל בולוסי של פאזת MEA בבארות ההתגבשות. תהליך טעינת הפלטה כולו מסתיים תוך שתי דקות. הפלטה המלאה מוסרת ממשטח הרובוט, נאטמת באמצעות זכוכית כיסוי ומוצבת באחסון בתנאי טמפרטורה מבוקרים לצורך צמיחת הגבישים.

השלבים הבאים בתהליך הכולל של קביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה של מקרו-מולקולות הם קציר וקירור קריוגני של הגבישים, והקלטה ועיבוד של עקיפת קרני X מהם. נושאים אלו מכוסים במאמרים נפרדים בסדרה זו.