שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

שלום וברוכים הבאים לקבוצת הביולוגיה המבנית והפונקציונלית של הממברנה. שמי מרטין קפרי. זהו עוד אחד בסדרת מאמרים JO על התגבשות חלבוני ממברנה לקביעה מובנית בשיטת הפאזה המעוקבת של מזו או ליפיק פאזה.

במאמר הראשון, JoVE 1 7 1 2, הדגמנו כיצד מכינים את הפאזה המעוקבת העמוסה בחלבון וכיצד פאזת המיסה הצמיגה והדביקה מחולקת ידנית לצלחות סנדוויץ' מזכוכית לניסויי התגבשות. מאמר וידאו זה יתאר שיטות לשימוש ברובוט התגבשות מזו. רובוט מציע את היתרונות של מהירות, דיוק, מזעור מדויק ויכולת לעבוד לתקופות ממושכות בתנאים לא נוחים כמו בחושך או בטמפרטורות נמוכות.

רובוטים בשימוש נכון יכולים לשפר מאוד את הפרודוקטיביות של מבנה חלבון הממברנה ומחקר התפקוד. במאמר וידאו זה, אנו מדגימים את השימוש בשלושה רובוטים זמינים מסחרית. הרובוט הראשון פותח בקבוצת הביולוגיה המבנית והפונקציונלית של הממברנה, והוא מתואר בפירוט בהתייחסות הראשונה.

השניים האחרים הפכו לזמינים רק לאחרונה וכלולים כאן להשלמה. הכנת לוחית ההתגבשות לביצוע ניסוי התגבשות באופן רובוטי מתחילה בהכנת לוחית הבסיס של לוחית ההתגבשות של כריך הזכוכית המתוארת בפירוט בהתייחס ללוחית הבסיס חייבת להיות מבודדת תחילה ויש ליישם את מרווח המקל הכפול המחורר שיוצר את הבארות על הצלחת. החומרים הדרושים לכך מוצגים כאן.

הם כוללים לוחית בסיס להתגבשות זכוכית, תמיסת מרווח מקל כפול מחוררת, רקמות נייר רולר או ברייר וכוס מי UE. הצלחת מונחת על מגבת נייר על ספסל. מורחים כמה טיפות של תמיסה שקטה ואז מופצים באופן שווה על פני הצלחת עם רקמת נייר.

הצלחת נשטפת מתמיסת עודף על ידי טבילתה במלואה בכוס מים. הצלחת מוסרת מהכוס המונחת על מגבת נייר יבשה. הצד המבודד כלפי מעלה והמשטח החשוף שלו מיובש על ידי ניגוב קל במגבות נייר.

לאחר מכן, כיסוי המגן על מרווח המקל הכפול המחורר מוסר והמרווח מוחל על המשטח המבודד של לוחית הזכוכית. חשוב שהמרווח ימוקם כראוי על לוחית הבסיס עם הפינה השמאלית העליונה ושני הצדדים הסמוכים של המרווח והצלחת במקביל. רולר או ברייר משמשים כדי לשטח את המרווח על לוחית הבסיס וליצירת אטימה הדוקה ביניהם.

בסוגריים, נציין כי לוחות מבודדים עם מרווחים מחוררים זמינים מסחרית כמתואר בסעיף ההתייחסות. לאחר שהכנו את לוחית הבסיס להתגבשות, אנו עוברים לאחר מכן להתקנה ולשימוש ברובוט המזו. כפי שצוין בהמשך, אנו מדגימים את השימוש בשלושה ברובוטים מזו.

בכל המקרים המוצגים הרובוטים מוגדרים ומשמשים בחדר מבוקר טמפרטורה המוגדר על 20 מעלות צלזיוס ברובוט מזו אחד, הרובוט הראשון במזו שהודגם בסרטון זה. המאמר פותח במעבדה של PI וזמין כעת באופן מסחרי. פרטים מלאים ניתן למצוא בסעיף העיון.

החומרים והציוד הנדרשים להקמת ניסוי התגבשות באופן רובוטי מוצגים כאן. הם כוללים מחברת מעבדה, מסה עמוסה בחלבון, שהוכנה טרייה כמתואר בג'ו של סעיף 1 7 1 2 ומאוחסנת במזרק המילטון. לוחות בסיס מבודדים עם מרווחים וזכוכית כיסוי תואמת, בקבוק מים וטישו, ורובוט המיסו.

המבט הראשון הוא של הרובוט עם הסיפון שלו פנוי. התצוגה הבאה היא של הרובוט עם תחנת פארק מכשיר אדים, לוחית בסיס התגבשות ובלוק באר עמוק המכיל פתרונות משקעים. אנו מתחילים את ההתקנה על ידי הנחת לוחית הבסיס על סיפון הרובוט.

יש לו פלטפורמה משלו, המסומנת בבירור במיקומי באר למטרות יישור לוחית הבסיס. יש לסמן את הצלחת בבירור למטרות זיהוי. בלוק 96 הבארות המכיל פתרונות משקעים מאובטח בפלטפורמה משלו על סיפון הרובוט ליד לוחית ההתגבשות.

הבלוק נפתח על ידי קילוף בזהירות של מכסה התקרה הפלסטי שלו. זרם הלחות ממכשיר האדים מופנה לזרום מעל ולרוחב לוחית הבסיס על סיפון הרובוט הגדרת הרובוט. הרובוט מאותחל על ידי ביצוע הוראות היצרן.

לא נדגים זאת בפירוט כאן מכיוון שהפרוטוקולים המדויקים ישתנו עם הזמן. בעיקרו של דבר מה שקורה במהלך האתחול הוא שזרוע חלוקת המזה על הרובוט מסופקת עם מיקומי ייחוס בשלושה כיוונים אורתוגונליים, x, Y ו-Z.לאחר מכן, שלב המזה העמוס בחלבון במזרק המילטון עם מחט חלוקה מחובר לזרוע אחד הרובוטים פרטים מלאים כיצד להכין את שלב המזה והמזרק מתוארים בג'ו של סעיף 1 7 1 2 ובהתייחסות אחת, כעת יש ליישר את קצה המחט של מזרק החלוקה עם החלק התחתון ומרכז הבאר העליונה בפינה השמאלית של לוחית ההתגבשות. זה מתאים למזהה באר A אחד שמתיישב עם החלק התחתון של באר A אחד כסדר העסקים הראשון.

זה נעשה על ידי התאמת הגובה או קואורדינטת Z לאחר חלוקת הזרוע תוך כדי צפייה עד כמה קצה המחט קרוב לתחתית הבאר. ניתן לשפוט את העובדה שהקצה רק נוגע בתחתית הבאר על ידי הזזת הצלחת ביד מצד לצד על הרציף תוך התאמה קלה כל כך של גובה זרוע החלוקה, קואורדינטות Z של זרוע המחלק היכן שהקצה נוגע בצלחת מוזנת למחשב מחלק מתוכנת להתרחש עם קצה המחט כמה מיקרומטרים ממצב Z התייחסות זה, המתאים למשטח לוחית הבסיס. לאחר מכן הרובוט מופעל כדי לעבור סדרה של שלבים המתבקשים על ידי המשתמש למקם את קצה המחט במרכז באר A.

קואורדינטת ה-XY הייחוס של זרוע החלוקה שבה הקצה מרוכז מאוחסנת במחשב השולט ברובוט. הוא משמש להגדרת מרכז הבארות הנותרות בצלחת. לאחר הגדרת קואורדינטות הייחוס הללו במחשב, הזרוע המחלק מקבלת הוראה לחזור למצב ההתחלה שלה, ולהפעיל את המזרק.

את מזרק החלוקה. זה נעשה כדי להבטיח שמיסה טרייה תמלא את מחט החלוקה ושהבאר הראשונה בצלחת תקבל את מלוא השלמת הנוזל שלה. יש פקודת תחול בתוכנית שמפעילה את הרובוט המופעל.

זה גורם לבוכנה במזרק להתקדם צעד בשליטת המשתמש. בזמן שזה קורה, קצה המחט נבדק כדי להופיע שלב מזה מוחצן מוסר עם רקמה. זה משלים את תהליך ההתחלה של הפעלת הרובוט.

הרובוט מוכן כעת להפעלה במצב אוטומטי ומתחיל את הריצה. תוכנית רובוט XAP יוזמת סבב של שלבי שטיפה שבהם קצות חלוקת המשקעים על הזרוע השנייה של הרובוט נשטפים ומוכנים לשאוב תמיסות משקעים מבלוק הבאר העמוק המפעיל את פונקציית החלוקה על הרובוט מפעיל את תנועה, העמסה רציפה של בארות עם שמונה בארות עמוסות חלבון בכל פעם, ואחריו פתרונות משקעים בין משלוחים. זרוע חלוקת המחט חוזרת למצב חניה שבו קצה המחט מונח בספוג לח כדי למנוע את התייבשות הנוזל בקצה.

לרוב, הערכים המשמשים בניסויי התגבשות שבוצעו בקרום. קבוצת הביולוגיה המבנית והפונקציונלית היא 50 ננוליטר של מיזה ו-800 ננוליטר של תמיסת משקעים. התוכנית שמפעילה את הרובוט בהדגמה זו הוגדרה כך ששתי הזרועות נעות בו זמנית.

באופן זה ניתן להשלים את הטעינה של צלחת 96 באר עם משקעים ומשקעים תוך חמש דקות. מיד הצלחת מתמלאת וזרועות הרובוט חזרו לעמדות החניה. הצלחת מוסרת מסיפון הרובוט ומונחת על משטח מוצק ושטוח.

זכוכית כיסוי מונחת בעדינות על גבי לוחית הבסיס במגע עם המשטח הדביק העליון של המרווח. חשוב לוודא שכל 96 הבארות מכוסות במלואן, שזכוכית הכיסוי מיושרת בריבוע עם לוחית הבסיס ושאף אחת מזכוכית הכיסוי לא משתרעת מעבר לטביעת הרגל של לוחית הבסיס. רולר או ברייר משמשים ליצירת אטימה הדוקה ואחידה בין זכוכית הכיסוי למרווח.

יש לבדוק את הצלחת בשלב זה כדי לוודא שההתקנה התנהלה כמו שצריך. מה שמחפשים זה ביצה מטוגנת במראה מחבת. בכל באר, עול הביצה מתאים לשלב המזא.

חלבון הביצה הוא תמיסת המשקעים, וקצה התבנית הוא היקף ההתגבשות. ובכן, באופן אידיאלי, שלושתם קונצנטריים. הצלחת מוכנה כעת להצבה באזור אחסון מבוקר טמפרטורה לגידול גבישים.

אם אין להקים לוחות נוספים, יש להסיר את גוש המשקעים מסיפון הרובוט, לאטום אותו כראוי ולהחזיר אותו לאחסון. המזרק המכיל את הנוזל מוסר מזרוע החלוקה של הרובוט, מפרק את חלקיו השונים, כולל מחט חלוקה ופריאה. נשטף בזהירות עם מתנול ומיובש לקראת השימוש הבא ברובוט Meso שני יתושים LCP.

סרטון הווידיאו הבא מציג את רובוט ה-LCP נגד יתושים שניתן להשתמש בו בהקמה של ניסויי התגבשות מזו. הוא משלב מערכת חלוקת שלב meph דומה לזו שתוארה קודם לכן במאמר זה. עבור רובוט אחד, לעומת זאת, המשקעים מחולקים באמצעות טיפים חד פעמיים.

המכשיר עצמו מוצג כאן. הוא כולל סיפון שעליו לוחית ההתגבשות ובלוק המשקעים מציבים תא עם חלון לבקרת הלחות. בתצוגה זו, החלונות בתא הלחות נפתחו סליל עם קצות חלוקה, זרוע חלוקת נוזל, חיישן מבוסס לייזר לקביעת מיקום מחט חלוקת שלב ה-meph.

פלטפורמה מוגבהת שעליה יושבת לוחית ההתגבשות פלטפורמה שקועה להחזקת בלוק המסך המשקע. ברצף זה, הרובוט ראה עובר רצף אתחול של פעולות כאשר המכשיר מופעל. תוכנת תכנות משמשת להגדרת המכשיר לעבודה עם לוחות התגבשות מסוימים ובלוקי משקעים, ולחלוקת נפחים מוגדרים של משקעים ומשקעים ברצף מוגדר.

פרטים כאלה מסופקים על ידי היצרן ולא יוצגו כאן. השימוש ברובוט להקמת צלחת התגבשות מתחיל כדלקמן, מזרק המילטון שלם עם מחט ומלא במיסה עמוסה בחלבון מוכן כמתואר לעיל תחת רובוט מזו אחד ובג'ו של 1 7 1 2. המזרק מהודק במקומו מתחת לזרוע החלוקה של הרובוט.

קואורדינטות ה-X וה-y של המחט במזרק המחלק נקבעות באמצעות חיישן הלייזר המותקן על הסיפון. זהו שלב חשוב הנדרש כדי להבטיח שהמזה יחולק במדויק במרכז כל באר על צלחת ההתגבשות. בלחיצת כפתור בלוח הבקרה, המזרק מוכן להוציא את הנוזל מקצה המחט.

לאחר מכן מסירים את הריס המוחצן עם טישו כהכנה לשימוש ברובוט להעמסת בארות לפני הרכבת לוחית ההתגבשות על סיפון הרובוט. משטח הפלטפורמה מרטיב בכמה טיפות מים כדי להחזיק את הצלחת במקומה. על ידי נימי, כיסוי המגן מוסר מהצלחת והצלחת מונחת על הפלטפורמה שלה בחוזקה כדי להבטיח היצמדות טובה.

ישנם שלושה נאמנים על הרציף שעליהם מרוכזות שלוש הבארות הפינתיות בקרוב כדי להבטיח מיקום נכון של הצלחת ביחס לקצה המחט המחלקת, המכשיר מוכן כעת להיכנס למחזור התקנה. זה מתחיל בשלב הכנה שני שבו מיז מוחלק על צלחת זכוכית קטנה מיד לפני שהוא עובר להעמיס את הצלחת במייז טרי. ברצף זה, אנו רואים את הרובוט טוען תחילה עם מייז, עמודה אנכית של שמונה בארות על הצלחת, ולאחר מכן משתמש בקצוות החד פעמיים כדי לחלק תמיסת משקעים על גבי בולוס המיזה.

תהליך זה חוזר על עצמו 11 פעמים לאורך הצלחת עד למילוי כל הבארות. התהליך כולו אורך כחמש דקות. בסרטון הספציפי הזה, קליפ 50 ננוליטר של Mease ו-800 ננוליטר של תמיסת משקעים חולקו לכל באר.

הצלחת המלאה מוסרת מפלטפורמת הרובוט המונחת על ספסל. זכוכית הכיסוי מוחלת והצלחת אטומה בחזייה כמתואר לעיל תחת רובוט מיסו אחד. כעת ניתן למקם את הצלחת המסומנת כראוי בסביבה מבוקרת טמפרטורה לגידול גבישים ברובוט Meso 3, ה-Griffin LCP.

סרטון וידאו אחרון זה מציג את רובוט ה-Griffin LCP בשימוש בניסויי התגבשות מזו. הגריפין משלב מערכת חלוקת שלב meph דומה לזו שתוארה לעיל עבור רובוט אחד. במקרה זה, לעומת זאת, כל 96 פתרונות המשקעים מחולקים בו זמנית.

המכשיר עצמו מוצג כאן. הוא כולל סיפון שעליו יושבים לוחית ההתגבשות ובלוק המשקעים, זרוע חלוקת מיז וראש קצה פיניקס 96. לחלוקת פתרונות משקעים, הרובוט בפעולה מוצג ברצף הווידאו הסופי הזה.

ראש הקצה 96 נטען תחילה בתמיסת משקעים. עיכוב מוגדר על ידי המשתמש מסופק כדי להקל על שאיפת משקעים צמיגים. שלב ה-MEA מחולק ברצף ל-96 הבארות בתהליך שלוקח כדקה אחת.

לבסוף, ראש הקצה 96 מחלק את כל 96 תמיסות המשקעים בו זמנית על גבי בולוסים של פאזה MEA בבארות ההתגבשות. כל תהליך טעינת הצלחת הושלם תוך שתי דקות. הצלחת המלאה מוסרת מסיפון הרובוט והצלחת נאטמת בזכוכית כיסוי ומונחת באחסון בתנאי טמפרטורה מבוקרים לצמיחת גבישים.

השלבים הבאים בתהליך הכולל של קביעה מובנית על ידי קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית הם לקצור ולקרר בהקפאה את הגבישים, ולתעד ולעבד מהם עקיפה של קרני רנטגן. נושאים אלה מכוסים במאמרי דרושים נפרדים בסדרה זו.