תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי באתרו הכלאה

המטרה הכוללת של הליך זה היא למפות בדיקות DNA לכרומוזומי פוליטן יתושים באמצעות הכנת כרומוזום בלחץ גבוה, ואחריו הכלאה פלואורסצנטית אוטומטית ב-C 2 והדמיה אוטומטית. זה מושג על ידי הכנת ממרחי כרומוזומים פוליטניים בשיטת לחץ גבוה. השלב הבא של ההליך הוא הכנת בדיקות פלואורסצנטיות על ידי תיוג DNA גנומי אחורי עם הפלואורוכרום באמצעות פרוטוקול תרגום ניק.

השלב השלישי הוא ביצוע הכלאה פלואורסצנטית ב-C 2 באמצעות מערכות צביעת שקופיות אוטומטיות. השלב האחרון הוא סריקה וצילום כרומוזומים מסומנים באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית אוטומטית. בסופו של דבר, תמונות יכולות להראות לוקליזציה של בדיקת DNA עם תווית פלואורסצנטית על כרומוזום הפולי

היתרון העיקרי של טכניקה זו או שיטות קיימות, כמו פרוטוקול היברידיזציה ידני סטנדרטי באתרו הוא שפרוטוקול המיפוי הפיזי בעל התפוקה הגבוהה ביותר מייצר תוצאות עקביות יותר ומפחית באופן דרמטי את זמן הפעולה המעשית. פרוטוקול זה מתחיל בניתוח נקבות חצי כבידה ונקבות בסביבות 25 שעות לאחר הזנת הדם כדי לאסוף את השחלות שלהן כאשר הן בשלב השלישי של כריסטופר. בשלב זה, האזור השקוף עם תאי האחות בתוך הזקיקים צריך להיות בעל צורה עגולה, לאסוף שחלות מחמש נקבות ולקבע אותן ב-500 מיקרוליטר של תמיסת רעש רכב שונה.

לאחר מכן ניתן לאחסן אותם בטמפרטורת החדר עד 24 שעות או יותר במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, רגע לפני ביצוע שקופיות חיתוך שחלות, הכינו תמיסת רעש לרכב וחומצה פרופיונית של 50%. הניחו כל זוג שחלות בטיפה של תמיסת רעש רכב טרייה על שקופית נטולת אבק מתחת למיקרוסקופ דיסקציה.

פצלו את השחלות בעזרת מחט הניתוח. העבירו את כל חלקי השחלה לשש שקופיות נקיות עם 50% חומצה פרופיונית. הפרד את הזקיקים זה מזה באמצעות מחטי ניתוח.

לאחר מכן נגב את כל הטישו שנותר במגבת נייר. הוסיפו טיפה נוספת של 50% חומצה פרופונית והמתינו שלוש עד חמש דקות. האגדה, הזקיקים יושבים ב-50% חומצה פרופונית במשך שלוש עד חמש דקות משפרת משמעותית את התפשטות הכרומוזומים.

לאחר מכן, מרחו פתק כיסוי והמתינו דקה נוספת כדי להפיץ את הגרעינים. עטפו את השקופית בנייר פילטר ופלסטיק. הגדר דרמל בין שלושה ל-5,000 סל"ד, ובמשך כדקה סובב קלות קצה דרמל מסתובב כנגד החלקת הכיסוי.

אשר את איכות ההתפשטות במיקרוסקופ פאזה והחל את הדרמל זמן רב יותר במידת הצורך, כדי לשטח את הכרומוזומים. הנח פתק כיסוי שני בסמוך לראשון, ואז סנדוויץ' את החלקות הכיסוי במיקרוסקופ נוסף. החלק לאחר מכן, עטוף את השקופיות עם יריעת פלסטיק ועם נייר פילטר, הנח את שקופיות העטיפה בסגן כדי לסחוט את השקופיות בין 85 ל -120 אינץ 'פאונד.

לאחר שיטוח הכרומוזומים בכל ששת השקופיות, פרקו את השקופיות והסירו את השקופיות הנוספות כדי לשטח עוד יותר את הכרומוזומים. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות במערכת הכלאה של דנטורציה של מגלשות. לאחר מכן, טבלו שקופית בחנקן נוזלי למשך 15 שניות לפחות או עד שהבעבוע נפסק.

לאחר מכן הסר במהירות את החלקת הכיסוי בעזרת סכין גילוח והנח מיד את השקופית באתנול קר של 50% למשך חמש דקות. חזור על תהליך זה עבור כל שקופית ברצף. ייבשו את המגלשות באמבט 70%a 90% ו-100% אתנול.

טבלו אותם בכל אמבטיה למשך חמש דקות. לבסוף, לאחר שהמגלשות מתייבשות באוויר, הן מוכנות לדגים לצביעה. מכשיר אוטומטי מבצע את רוב השלבים בהליך למעט תיוג הבדיקה.

אז לפני טעינת המכשיר, הכינו את הגשושית הפלואורסצנטית על ידי תיוג ה-DNA בחזרה עם הפלואורוכרום באמצעות פרוטוקול תרגום NIC מסחרי עם הגשושית מוכנה, טען את השקופיות והריאגנטים לשקופיות האוטומטיות. מערכת מכתים ותכנת את המערכת לבצע את השלבים הבאים. ראשית, ספק 800 מיקרוליטר של XPBS אחד למשך 20 דקות.

שנית, יבש את המגלשות. שלישית, תקן את השקופיות עם 450 מיקרוליטר של פורמלין 4% ב-XPBS אחד למשך דקה אחת. לאחר מכן שטפו את השקופיות עם 100% אתנול למשך שנייה אחת, פעמיים ולמשך שתי דקות.

לאחר אמבט האתנול, יש לייבש שוב את המגלשות. כעת מחממים את המגלשות ב-45 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות כדי למנוע בעבוע. לאחר מכן יש למרוח 20 מיקרוליטר של בדיקת ה-DNA, ואחריה טיפת שמן מינרלי והחלקת כיסוי הבאה בטבע, הכרומוזומים ב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן הגדר את המגלשות להכלאה ב-42 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות. לאחר הגדרת ההכלאה המחמירה שוטפת במשך שתי דקות ב-42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן ארבע מריחות רצופות של שנייה אחת של שני XSSC וייבוש. לאחר מכן יש למרוח 800 מיקרוליטר של 0.4 XSSC בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות פעמיים, ולאחר מכן שטיפה אחת נוספת ושני XSSC בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

כעת מרחו את הכתם 50 מיקרוליטר יו-יו ואחריו שמן מינרלי והחלקות כיסוי. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז הסר את החלקות הכיסוי.

שטפו את המגלשות בשני XSSC ארבע פעמים למשך שנייה אחת בכל כביסה וייבשו את המגלשות. לבסוף, מרחו 15 מיקרוליטר של מגיב זהב ממושך נגד דהייה על כל שקופית והצמידו פתקי כיסוי חדשים. הפעל את מערכת הסריקה האוטומטית של אקורד פלוס, החל מאספקת החשמל של אולימפוס U-R-F-L-T לנורת הלוגן.

לאחר מכן המחשב, ולבסוף המיקרוסקופ עם חיבור למצלמה. כעת פתח תחילה את חבילת תוכנת הדואט, הגדר סריקה מוקדמת של פי 10. לחץ על הלחצן המקוון, הזן מזהה אירוע חדש והקצה מזהה שקופית.

לחץ על הנקודה שכותרתה bf. זוהי אפשרות השדה הבהיר. בחר אפשרות סריקה ל-10 x סריקה מוקדמת.

בחר 2, 500 x עיגול, 10, 000 x עיגול או מלבן. לחץ על Set and Run. ואז, בסדר, עקוב אחר ההנחיות כדי להתאים את הסריקה כראוי ולאחר מכן לחץ על סיום.

כדי להתחיל את הסריקה, לחץ על הכרטיסייה הראשית כדי לחזור למסך הראשי. כעת לחץ על הכפתור הלא מקוון, מצא את מזהה המקרה ומזהה השקופית שהוקצו. ולחץ במצב לא מקוון.

סרוק בקופסה השחורה באזור השמאלי העליון. לחץ על חץ ובחר 10 x סריקה מוקדמת. השתמש בחצים כדי לעבור על התמונות הסרוקות לאחר מציאת תמונה מעניינת.

לחץ פעמיים על המסך באמצע האזור הממוקד ולחץ על הצמד. פעולה זו תמקד תמונה לצילום מאוחר יותר לאחר בחירת כל היעדים. לחץ לחיצה ימנית על כל תמונה, לחץ על סווג בחר 10 x סריקה מראש ובחר polytan.

חזור לתפריט הראשי והגדר את הסריקה המוקדמת של 40x. בחר שוב במצב מקוון ובחר שקופית. שנה את BF ל-ffl ושנה את שם המשימה כדי לבקר שוב ב-dash X 40 dash rg.

שנה את הקטע ממש מתחת להגדרה האחרונה כדי לבקר שוב במקף הכל. לאחר מכן הפעל את התוכנית ופעל לפי ההנחיות. כדי להגדיר את האוטומציה, לחץ על לחצן התחל תצוגות תואמות כדי להתאים תמונות של 10 x ו- 40x.

לחץ על סיום כדי להתחיל את הסריקה. לאחר שתסיים, לחץ על סיווג והסתכל על התמונות. הכנות של כרומוזומי פוליטן של תאי אחות שחלות מאנומליה נשית בגמביה נעשו בטכניקת הלחץ הגבוה.

שיטה זו אינה פוגעת או משנה את רוב מבנה הכרומוזום. הוא משטח כרומוזומים כפופים ובכך חושף רצועות עדינות נסתרות שאינן נראות בתכשירים רגילים. הכרומוזום נבדק עם שיבוטי DNA אחוריים שהתקבלו מהספרייה האחורית של האנומליה S Gambia and Tam.

הספרייה נוצרה מזכר ונקבה ראשונים בזחל כוכב של זן המזיק האנומלי S Gambia. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מיפוי פיזי אוטומטי בתפוקה גבוהה על מנת להקל על התפתחות מהירה של מכלולי גנום מבוססי כרומוזומים.