כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

מטרתו של הליך זה היא לבצע מדידה כמותית של כושר ההישרדות (fitness) של תרבויות מיקרוביאליות במקביל ובקנה מידה גנומי, באופן מדויק ובתפוקה גבוהה. הדבר מושג תחילה על ידי הקמת ספריית מערך של מושבות מיקרוביאליות בפלטות של 96 בארות וגידול התרבית עד לרוויה. לאחר מכן, התרביות הרוויות מדוללות במים ולאחר מכן מונחות בנקודות (spotted) על פלטות אגר מוצקות.

לאחר מכן, צלחות האגר המוצקות מצולמות באופן מחזורי ועד להגעה לרוויה בצמיחת המושבה המיקרוביאלית. לבסוף, התצלומים של מהלך הזמן של צמיחת כל תרבית מומרים למדדים כמותיים של צפיפות תאים, ועקומות הצמיחה שנצפו מסוכמות יחד עם מודלים של צמיחה ומדדים כמותיים של כשירות (fitness) מיקרוביאלית. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המהוות ראיות לאינטראקציות גנטיות, על ידי הדגמה כי לשבטים מיקרוביאליים יש רמות כשירות שונות כאשר הם משולבים עם מוטציות שונות או גדלים בתנאים שונים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטות קיבוע בצפיפות גבוהה כמו SGA או ניסויי תחרות של ברקודים, הוא שמדידות הכושר (fitness) מדויקות יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום פיתוח התרופות לסרטן, כגון אילו גנים ותהליכים חשובים בתגובה לנזק ל-DNA ובבקרת מחזור התא, וכן בהבנה ותרגום של מחקרים בסיסיים במיקרואורגניזמים למטרות תרופתיות פוטנציאליות בתאי סרטן אנושיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד הטלומרים ו-visi.

ניתן ליישם זאת גם בתחומים אחרים של ביולוגיה של שמרים, או למעשה בכל תחום שבו פנוטיפים של כשירות (fitness) יכולים לספק תובנות לגבי ביולוגיה מיקרוביאלית. אנו מקווים שניתן יהיה ליישם את QFA על אורגניזמים מיקרוביאליים רבים אחרים שעבורם קיימות ספריות מערכים. לדוגמה, povi e coli, orilla surplus. החל מתרביות רוויות של לילה, דללו עד ל-96 זני שמרים נפרדים בנפחים של 200 µL של מצע נוזלי עשיר.

בצלחית תרבית בעלת 96 בארות, עקרו פין של מכשיר שכפול ידני (manual replica plater) בעל 96 פינים ובקוטר של שמינית אינץ', תחילה על ידי טבילה ב-100% ethanol, לאחר מכן על ידי שריפה בלהבה והשארתו להתקרר. באופן מסודר, העבירו 200 microliters של מים סטריליים לבארות של פלטת 96 בארות; לאחר ערבוב ב-vortex, דללו תרביות שמרים רוויות על ידי טבילת כלי הפינים המעוקר בתוך הזנים שלוש פעמים, ולאחר מכן פעם אחת לפלטה המכילה את המים. עקרו שוב את כלי הפינים, והמתינו שיתקרר לפני טבילה שלוש פעמים בתרביות המדוללות. לאחר מכן, העבירו את הפינים לפלטת agar מוצקה.

לאחר דגירת צלחות האגר, השתמש ב-s and p robotics SP imager כדי לדגום אותן ידנית לצורך תרביות אוטומטיות. התחל עם מערך מלבני של זני שמרים עצמאיים שגודלו על אגר מוצק. בדוגמה זו, הזנים ההתחלתיים הם תוצאה של הכלאה בין מוטציית שאילתה רגישה לטמפרטורה לבין אוסף המחיקות של השמרים.

1,536 תרביות המייצגות ארבע חזרות של 384 זני שמרים עצמאיים גודלו על פלטות SGA באמצעות רובוט עם כלי העברה סטרילי בעל 96 פינים, בקוטר פין של מילימטר אחד; העבירו 384 מתוך 1,536 הזנים ל-4 פלטות תרבית בעלות 96 בארות המכילות 200 µL של מצע סלקטיבי; גדלו את התרביות בטמפרטורה של 20 °C עד להגעה לרוויה. כדי לבצע נקודות (spotting) של תרביות השמרים הרוויות, התחילו בהעברתן לרובוט לטיפול בנוזלים וביצוע רסספנסיה (resuspension) על שייקר מגנטי; דללו את התרביות לריכוז של כ-1:70 באמצעות כלי פינים רובוטי סטרילי בעל 96 פינים, על ידי העברה ל-200 µL של מים סטריליים.

לאחר ניקוי ועיקור של כלי הפין, יש להטפטף את התרביות המדוללות על פלטות אגר. בפורמט של 384 בארות, העבירו את הפלטות לאנקובטור לח עם בקרת טמפרטורה, הכולל קרוסלה אוטומטית ופתח גישה. לצילום התרביות השתמשו במצלמה רובוטית אוטומטית, אשר מוציאה את הפלטות מהאינקובטור באופן חוזר, מסירה את המכסים, מעבירה אותן למרחב מואר באופן אחיד מתחת למצלמה של 35 מילימטר, ומבצעת צילום ברזולוציה של 5,184 על 3,456.

מערכת ה-Pixel resolution מחזירה את המכסה למקומו, ולאחר מכן מחזירה את הפלטות למעגל האינקובטור כדי לעקוב אחר מיקומי התרביות על הפלטות והטיפולים שהוחלו עליהן. הפלטות מקבלות ברקוד באופן אוטומטי בהתאם לשם האינקובטור, הטמפרטורה, מספר אצווה רצפי ייחודי ומיקומה באינקובטור. שמות התמונות הם שרשור של שם הפלטה וחתימת זמן, והם נוצרים באופן אוטומטי בעת לכידת התמונה.

לעתים קרובות מתוויתים את הפלטות באופן ידני כדי להבטיח שהן יישארו באותו סדר בעת ההעברה בין קרוסלות הרובוט. קובצי המידע (metadata) הם קבצי טקסט המופרדים בטאבים, אשר נוצרים באופן ידני. קובץ תיאור הניסוי FT two.

טבלה אחת היא ייחודית לכל ניסוי, אך ניתן להשתמש בתיאור הספרייה FT three, טבלה אחת באופן נרחב. לאחר בנייתו, הניסוי מתואר בקובץ תיאור הניסוי FT two טבלה אחת, המכיל עמודות עבור ברקוד או שם פלטה שנוצר באופן אוטומטי, חותמת זמן של תחילת הניסוי, טיפול בפלטה, תכני מצע אגר מוצק, שם המסך, מספר פלטת ספרייה עבור ספריות עם פלטות מרובות, ומספר רבעון חזרתי לצורך הקטנה מפורמט של 1,536 בארות לפורמט של 384 בארות. ספריית ה-e strain מתוארת באמצעות קובץ תיאור ספרייה FT three, טבלה אחת, המציין את הגנוטיפ שגודל בכל מיקום תרבית.

כל פלטה בספרייה מכילה ארבע עמודות: שם הספרייה, ORF, מספר הפלטה, שורה ועמודה בפלטה, ועמודה אופציונלית להערות. ניתן לספק קובץ אופציונלי של שמות גנים סטנדרטיים FT ארבע, טבלה אחת המתארת את שם הגן הסטנדרטי המשויך לכל מספר ORF סיסטמטי, המזהה את הזנים הנבדקים. קובץ זה מכיל שתי עמודות, ORF ושם הגן, לצורך ניתוח הנתונים.

סבב העבודה החישובי של ה-QFA דורש גישה לתחנת עבודה רב-ליבתיות בעלת עוצמה סבירה שמותקנת עליה התוכנה. כלי התוכנה לניתוח תמונות של ה-colonizer וחבילת ה-QFAR, ששניהם מתועדים באופן מקוון, זמינים בחינם ופועלים על מגוון מערכות הפעלה. הפעילו את colonizer כאשר כל אחת מהתמונות שצולמו של המצעים משמשת כקלט, באופן שיפיק קובץ פלט אחד של colonizer עבור כל תמונה שצולמה; קובצי הפלט של colonizer מפרטים הערכות של צפיפות התרבית, שטח התרבית, צורה וצבע.

עבור כל אחד מ-384 המיקומים על לוח התמונה, שם קובץ הפלט מועתק באופן אוטומטי משם קובץ תמונת המקור. חבילת ה-QFAR כוללת פונקציות seldens עבור סדרות זמן של כל תרבית, לצורך התאמת מודלים לוגיסטיים כלליים של אוכלוסיות לתצפיות וליצירת גרפים. ראו דוגמאות באיורים שתיים ושלוש.

ערכי הפרמטרים המותאמים נכתבים לקובצי פרמטרים לוגיסטיים של QFA. חבילת QFAR כוללת גם פונקציות לבקרת איכות. מושבות קצה נפסלות בשל זמינות גבוהה יותר של חומרי הזנה בשולי הצלחת וקושי בניתוח התמונות.

דגימות שנמצאו סמוך לדפנות המצע או תרביות שנכשלו ב-SGA, וכן גנוטיפים שהראו קישור לגנים מסמנים ספציפיים של הסריקה, מוסרים מהניתוח. מספר מדדי כשירות כמותיים נגזרים מפרמטרים של מודל אוכלוסייה לוגיסטי עבור כל תרבית. אלו כוללים את שיעורי הכפלת האוכלוסייה המקסימליים ואת מספר החלוקות מההחדרה ועד לרוויה עבור כל סט של תרביות חוזרות ועבור כל הגדרה של כשירות.

מחושבים מספר מדדי סיכום של הערכות הכושר: כושר ממוצע וחציוני, סטיית תקן של הכושר ומספר החזרות שנצפו. מדדי הסיכום מופקים לקובצי סיכום הכושר של QFA, FT eight, טבלה 1, לצורך ניתוח נוסף. לדוגמה, חישובים של מדדי אינטראקציה גנטית, FT nine, טבלה 1.

איור זה מציג עקומת גדילה טיפוסית בסולם לוגריתמי מ-384 QFA. תרביות הגדלות ב-20 degrees Celsius על אגר מוצק כפי שכומת על ידי colonizer, כאשר עלייה בצפיפות התאים ניתנת לזיהוי ראשוני לאחר כיומיים. עיכוב זה הוא ככל הנראה תוצאה משולבת של פאזת השהייה (lag phase) של התרבית לאחר ההזראה למצע מוצק, ושל סף גילוי נמוך עבור צפיפות התאים.

כאן, נדגמו 308 עקומות גדילה דומות מתוך פלטה אחת. שימו לב שזנים שהניבו קו שטוח היו חולים מאוד או מתים. איור זה מדגים את ההשוואה בין שני סריקי QFA רחבי גנום כדי להסיק את עוצמות האינטראקציה הגנטית.

חבילת ה-QFAR כוללת גם פונקציות להפקת איור עקומת הגדילה הקודם ולהוצאת רשימות מדורגות של הגנוטיפים שנבדקו והערכות של עוצמת האינטראקציה הגנטית, יחד עם ערך Q למשמעות הסטטיסטית של ה-GIS שנצפה. לאחר השליטה בשיטה, ניתן להשלים ניסוי QF.A מלא בשימוש בארבע חזרות לכל הגנום בתוך שלושה שבועות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות מאורגנים במעקב ובשמיים של כל הצלחות הפטרי ושל כל התמונות.

יש להחדיר את כל המצעים ולבצע נקודות (spot) באוריינטציה ובסדר הנכונים להמשך התהליך. ניתוח הנתונים נשען על נכונותם של קובצי הטקסט העזר שנבנו על ידי המדען המבצע. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את הכושר ההישרדותי (fitness) של אלפי תרביות מיקרוביאליות עצמאיות.

כושר ההישרדות (Fitness) מוערך על ידי צילום חוזר של תרביות מנוקדות הגדלות על פלטות אגר מוצקות, המרת התמונות שהצולמו להערכות של צפיפות תאים ויצירת עקומות גדילה. מידול מתמטי של עקומות הגדילה מספק הערכות כמותיות של כושר ההישרדות, שניתן להשתמש בהן כדי להסיק קשרים תפקודיים בין תוצרי גנים בקנה מידה גנומי רחב.