כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

מטרת הליך זה היא ללכוד התאמות תרביות מיקרוביאליות כמותיות במקביל בקנה מידה רחב גנומי בצורה מדויקת ותפוקה גבוהה. זה מושג על ידי ספריית טיורינג ומערך ראשונה של מושבות מיקרוביאליות ב-96 לוחות באר והגדלת התרבות לרוויה. לאחר מכן, התרביות הרוויות מדוללות במים ולאחר מכן מאותרות על צלחות אגר מוצקות.

לאחר מכן מצלמים את לוחות הגארף המוצקים מעת לעת ועד שצמיחת המושבה המיקרוביאלית רוויה. לבסוף, צילומי מהלך הזמן של הצמיחה של כל תרבית מומרים למדדים כמותיים של צפיפות התאים ומסוכמים עקומות הצמיחה הנצפות עם מודלים של גדילה ומדדים כמותיים של כושר מיקרוביאלי. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ראיות לאינטראקציות גנטיות באמצעות הוכחה כי לזנים מיקרוביאליים יש כושר שונה בשילוב עם מוטציות שונות או בתנאים שונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שיטות הצמדה בצפיפות גבוהה כגון SGA או ניסויי תחרות ברקוד, הוא שמדידות הכושר מדויקות יותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום פיתוח תרופות לסרטן, כגון אילו גנים ותהליכים חשובים בתגובה לנזק ל-DNA ובקרת מחזור התא, הבנה ותרגום של מחקרים כאלה ומיקרואורגניזמים בסיסיים בצורה של מטרות תרופתיות פוטנציאליות בתאי סרטן אנושיים. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד הטלומרים והראייה.

ניתן ליישם אותו גם בתחומים אחרים של ביולוגיה של שמרים או למעשה בכל תחום שבו פנוטיפים של כושר יכולים לספק תובנה לגבי ביולוגיה מיקרוביאלית. אנו מקווים שניתן יהיה ליישם QFA על אורגניזמים מיקרוביאליים רבים אחרים שעבורם קיימות ספריות מערך. לדוגמה, povi e coli, עודף אורילה החל מתרביות לילה רוויות שיחק עד 96 זני שמרים עצמאיים בנפחים של 200 מיקרוליטר של מדיום נוזלי עשיר.

בצלחת מתורבתת היטב יש לעקר פלטת העתק ידנית בקוטר 96 פינים, שמינית אינץ' על ידי טבילתו תחילה באתנול של 100%, ואז להבעיר אותו ולהשאיר אותו למערך קירור, 200 מיקרוליטר של מים סטריליים בבארות של מערבולת צלחת 96 בארות הרוו תרביות שמרים ודיללו על ידי טבילת כלי הסיכה המעוקר בזנים שלוש פעמים. לאחר מכן לאחר שנכנסים לצלחת המכילה את המים, עקרו את כלי הסיכה והניחו לו להתקרר לפני שטובלים אותו שלוש פעמים בתרביות המדוללות. לאחר מכן העבירו את הפינטל לצלחת אגר מוצקה.

לאחר הדגירה של לוחות האגר, השתמש במצלמת SP רובוטיקה s and p כדי לדמות אותם ידנית לתרבות אוטומטית. התחל עם מערך מלבני של זני שמרים עצמאיים הגדלים על אגר מלא. בדוגמה זו, הזנים ההתחלתיים הם תוצאה של חציית מוטציית שאילתה רגישה לטמפרטורה עם אוסף מחיקת השמרים.

1,536 תרביות המייצגות ארבעה שכפולים של 384 זני שמרים עצמאיים גדלים על לוחות SGA באמצעות רובוט עם כלי סיכה סטרילי בקוטר 96 פינים בקוטר מילימטר אחד המעביר 384 מתוך 1,536 הזנים ל-4 96. ובכן צלחות תרבית המכילות 200 מיקרוליטר של מדיום סלקטיבי מגדלות את התרבויות ב -20 מעלות צלזיוס לרוויה. כדי לזהות את תרביות השמרים הרוויות, התחילו בהעברתם לרובוט לטיפול בנוזלים, ו-Resus תולה אותם על שייקר מגנטי, לדלל את התרביות לסביבות 1 עד 70 על ידי שימוש בכלי סיכה רובוטי סטרילי של 96 פינים כדי להצמיד ל-200 מיקרוליטר של מים סטריליים.

לאחר ניקוי ועיקור כלי הסיכה, זהו את התרבויות המדוללות על צלחות אגר. ב-384, פורמט באר מעביר את הלוחות לחממה לחה מבוקרת טמפרטורה עם קרוסלה אוטומטית ופתח גישה. כדי לדמות את התרביות השתמשו בהדמיה אוטומטית רובוטית, המסירה שוב ושוב את הצלחות מהאינקובטור, מסירה את המכסים, מעבירה אותם לחלל מואר באופן אחיד מתחת למצלמת 35 מילימטר, מצלמת תמונה בגודל 5, 184 על 3, 456.

רזולוציית פיקסלים מחליפה את המכסה, ואז מחזירה אותם לקרוסלת החממה כדי לעקוב אחר מיקומי התרבית על הצלחות והטיפולים המיושמים עליהם. הצלחות מקודדות אוטומטית על פי שם החממה, הטמפרטורה, מספר האצווה הרציף הייחודי והמיקום בחממה. שמות תמונות הם שרשור של שם הלוח וחותמת הזמן ונוצרים באופן אוטומטי עם לכידת התמונה.

צלחות מסומנות לרוב גם באופן ידני כדי להבטיח שהן יישארו באותו סדר בעת העברה בין קרוסלות רובוטים. קובצי המטא-נתונים הם קובצי טקסט מופרדים באמצעות טאבים, הנוצרים באופן ידני. קובץ התיאור הניסיוני FT שתיים.

טבלה ראשונה ייחודית לכל ניסוי, אך ניתן לעשות שימוש חוזר בתיאור הספרייה FT 3, טבלה 1 באופן נרחב. לאחר הבנייה, הניסוי מתואר בקובץ התיאור הניסיוני FT שתי טבלה המכילה עמודות לברקוד או ניסוי שם לוחית שנוצר אוטומטית התחלת תוכן טיפול בלוחית חותמת זמן של שם מסך בינוני אגר מוצק, מספר לוחית ספרייה לספריות עם מספר לוחות, ומספר רביע חוזר להקטנת קנה מידה מ-1, 536, פורמט באר ל-384. ובכן פורמט ספריית הזנים האלקטרוניים מתוארת עם קובץ תיאור ספרייה FT 3, טבלה ראשונה המציינת את הגנוטיפ שגדל בכל מיקום תרבית.

בכל לוח של ספרייה, הוא מכיל עמודות ארבע, שם הספרייה, ORF, לוחית מספר לוחית, עמודת לוחית שורה ועמודת הערות אופציונלית. ניתן לספק קובץ שם גן סטנדרטי אופציונלי FT 4, טבלה 1 המתארת את שם הגן הסטנדרטי המשויך לכל מספר ORFY שיטתי, ומזהה זנים המוסרים. קובץ זה מכיל שתי עמודות, ORF ושם גן לניתוח הנתונים.

זרימת העבודה החישובית של QFA דורשת גישה לתחנת עבודה מרובת ליבות חזקה למדי עליה מותקנת. כלי התוכנה לניתוח תמונות קולוניאליסט וחבילת QFAR, שניהם מתועדים באינטרנט, זמינים בחינם ופועלים במגוון מערכות הפעלה. הפעל את המתיישב עם כל אחת מתמונות הלוח שצולמו כקלט היוצר קובץ פלט קולוניאליסט אחד FT חמש, טבלה אחת עבור כל תמונה שצולמה קבצי פלט של קולוניזטור, ציין הערכות צפיפות תרבות, תרבות, שטח, צורה וצבע.

לכל אחד מ- 384 המיקומים בלוח התמונה, שם קובץ פלט מועתק אוטומטית משם קובץ תמונת המקור. חבילת QFAR מכילה פונקציות לתזמון קורסים עבור כל תרבות כדי להתאים מודלים לוגיסטיים כלליים של אוכלוסייה לתצפיות ולתרשים. שניהם רואים איורים 2 ו-3 לדוגמאות.

ערכי פרמטרים מותאמים נכתבים בקבצי פרמטרים לוגיסטיים של QFA. חבילת QFAR מכילה גם פונקציות לבקרת איכות. מושבות קצה מושלכות עקב זמינות גדולה יותר של חומרים מזינים בקצוות הצלחת וקושי בניתוח תמונה.

ליד דפנות לוחות ותרביות, שנכשלו ב-SGA וגנוטיפים המציגים קישור עם גנים סמנים ספציפיים למסך מופשטים מהניתוח. מספר מדדי כושר כמותיים נגזרים מפרמטרים של מודל אוכלוסייה לוגיסטי עבור כל תרבות. אלה כוללים שיעורי הכפלת אוכלוסייה מקסימליים ומספר החלוקות מחיסון לרוויה עבור כל קבוצה של תרביות שכפול ועבור כל הגדרת כושר.

מספר נתונים סטטיסטיים מסכמים של הערכות כושר מחושבים: כושר ממוצע ובינוני, סטיית תקן כושר ומספר שכפולים שנצפו. סטטיסטיקות סיכום מוצגות לקבצי סיכום כושר QFA FT 8, טבלה ראשונה לניתוח נוסף. לדוגמה, חישובים של ציוני אינטראקציה גנטית FT תשע טבלה ראשונה.

איור זה מציג עקומת צמיחה אופיינית אחת בסולם לוג OUTTA 384 QFA. תרביות הגדלות ב-20 מעלות צלזיוס על אגר מוצק כפי שכומת על ידי המתיישב עם עלייה בצפיפות התאים הניתנת לזיהוי לראשונה לאחר כיומיים. עיכוב זה הוא ככל הנראה השפעה משולבת של שלב פיגור בתרבית לאחר החיסון על מדיום מוצק, וגבול זיהוי נמוך יותר לצפיפות התאים.

כאן, 308 עקומות צמיחה דומות נלכדו מלוח יחיד. שימו לב שזנים שיצרו קו שטוח היו חולים מאוד או מתים. איור זה מדגים את ההשוואה בין שני מסכי QFA רחבים בגנום כדי להסיק את חוזק האינטראקציה הגנטית.

חבילת QFAR כוללת גם פונקציות להפקת נתון עקומת הגדילה הקודמת ולפלט רשימות מדורגות של גנוטיפים שנבדקו והערכות של חוזק האינטראקציה הגנטית. יחד עם ערך Q למשמעות ה-GIS הנצפה פעם שלטה ב-QF שלם בכל הגנום עם ארבעה שכפולים. ניתן להשלים ניסוי תוך שלושה שבועות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות מאורגן במעקב ובמתן שמות לכל הלוחות והתמונות.

כל הצלחות חייבות להיות מחוסנות ולאתר בכיוון הנכון ולהזמין הלאה. ניתוח הנתונים מסתמך על נכונות קבצי הטקסט העזר שנבנו על ידי מדען הניסוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להעריך את הכושר של אלפי תרביות מיקרוביאליות עצמאיות.

הכושר מוערך על ידי צילום חוזר ונשנה של תרביות נקודות, הגדלות על לוחות אגר מוצקים, המרת התמונות שצולמו להערכות של צפיפות התאים ויצירת עקומות גדילה. מודלים מתמטיים של עקומות גדילה מספקים הערכות כושר כמותיות, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהן כדי להסיק קשרים פונקציונליים בין תוצרי גנים בקנה מידה רחב של הגנום.