Name: הזרקת Intraductal של LPS כמודל עכבר של דלקת בשד: איתות מדמיינת דרך NF-κB כתב מהונדס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: חקור דלקת בבלוטת החלב בעכברים באמצעות הזרקת LPS תוך-צינורית ודימות ביולומינסצנטי. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות של פעילות NF-κB בתגובה דלקתית בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH CA113734 הוענק לF Yull והמחלקה לענייני יוצאי הצבא (TS לקוול).

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הטיפול באוניברסיטה ונדרבילט המוסדי בעלי החיים ושימוש ועדה. 1. הכנת עכברים הטרנסגניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבות עכברים, חיוביים לNGL (N-F-κB-G FP-L uciferase) הכתב transgene (שתואר לעיל 1) משמשים להליך זה. כאשר נקבות לפחות 6 שבועות של גיל, חבר אותם עם זכר סוג פראי FVB. הרמון רבייה ניתן להשתמש (עד 4 נקבות בכלוב עם זכר 1). (לתשומת הלב: עכברי מתח FVB שמשו למחקר הנוכחי עכברי מתח כהים כגון C57Bl6 עשויים לשמש גם, אבל עכברים אלו חייבים להיות מגולחים לפני ההדמיה.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ 15 ימים לאחר הזדווגות, בדוק את הנשים באופן קבוע לסימנים של הריון (היקף גדול בולט). כל נקבה יש להפריד לאחר ההריון והזכר הוסר מהכלוב הפעם הנקבה האחרונה להריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו הנקבות המופרדותד לשים לב לתאריך לידה, כאשר המלטה מופיעה. המלטה של ​​לפחות 6 גורים נדרשת להנקה מספקת. שמונה ימים לאחר לידתו של ההמלטה, להמשיך בפרוטוקול (ראה איור 1 עבור סכמטי ציר זמן). </li></ol> 2. הכנה להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס את ה LPS coli בPBS לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl. 50 μl של פתרון זה, או סך של 5 מיקרוגרם, יהיה ניתן להזריק לתוך בלוטת החלב. הכן את המבחנה שנייה של PBS לבד לשמש להזרקת שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ביתור וציוד הרדמה isoflurane. מנגנון אף מחודד צריך להיות מאובטח לשלב של הביתור שבו הניח את העכבר. מקור אור טוב, בין אם מההיקף עצמו או מפנסי תאורה נוספים צריך גם להיות מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שההגדרה היא מוחלטת, להפעיל את מכונת isoflurane וזרימת אוויר. </li></ol> 3. הזרקת Intraductal של LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מזרק מחט הקצרה עם 50 μl של פתרון LPS. להגדיר את זה בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את העכבר להיות מוזרק על ידי הנחת הראשון הנקבה לתוך קופסה מלאה isoflurane ואז ברגע נשימה מואטת, להעביר אותה לבמה ומניח את אפה בתוך האף המחודד. השתמש קמצוץ בוהן כדי לאשר את העכבר הוא מורדם באופן מלא. לפקח הנשימה של העכבר לאורך התהליך ולהתאים את רמת isoflurane בהתאם. הכלוב ובו של הגורים שהנקבה כבר נלקחה מיש להפריש בזהירות עד שניתן יהיה להחזיר את הסכר לאחר ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטיפה קטנה של אתנול 70% כדי להפוך את המעייל שכב ולעזור לדמיין הפטמה המחוברת לבלוטת חלב # 4 מפשעתי ממש על הבטן התחתונה של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקד הביתור לתצוגה מיטבית של הפטמה. זהירות להשתמש בערכה של מלקחיים עדינים יותר כדי למשוך את הפטמה מהעור, אך אין לנקב או לפצוע את הפטמה בצורה כלשהי.מלקחיים לא צריכים להיות שלובים בכוח כאשר מניפולצית הרקמה, אבל שימוש עם אחיזה קלה הדורשת את הכמות המינימאלית של לחץ על הפטמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים ביד השמאל בעדינות להחזיק את הפטמה במקום. לאט לאט תביא את מזרק preloaded לתוך שדה ראייה של שימוש ביד ימין. המזרק צריך להיות מוחזק כך שאף מיקום מחדש צריך להתרחש כדי להזריק את התוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמזרק נמצא בתצוגה, מטרה בזהירות בפתיחת ductal הקטנה בתוך מרכז הפטמה, ולהכניס את המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי למקם מחדש את היד, להזרים את תכולת המזרק ולהוציא את המחט מהפטמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מזרק שני עם 50 μl של PBS להזרקת השליטה. למקם את העכבר על במה ולתצוגה הטובה ביותר של הפטמה השמאלית # 4 מפשעתי חלב הבלוטה בצד השני של הבטן התחתונה של העכבר. חזור על שלבים 3.4-3.7 באמצעות מזרק PBS הטעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתי הזריקות Complete, להפסיק הרדמה ולהזיז את העכבר לכלוב התאוששות. לפקח על הנקבה כדי להבטיח שהיא הופכת ניידת בתוך 5 דקות. אפשר העכבר כדי להישאר בכלוב ההתאוששות לשעה 1. לאחר 1 שעה של התאוששות, הנח את הגב הנשי לכלוב עם גוריה של גורים. עכברים צריכים להיות במעקב תקופתי להזרקת 6 שעתי הודעה לפני שימשיכו להדמיה. מניסיוננו, השלכות שליליות נרשמו באו נקבה או את הגורים במהלך התקופה שבין הזרקה והדמיה. עם זאת, אם סימני המצוקה הם נצפו בנקבה (למשל היציבה הכפופה, נושכים או שמירה על מקום ההזרקה, עייפות כללית) או את הגורים (אין תנועה, צבע כחלחל של עור) הניסוי יש להפסיק. </li></ol> 4. Bioluminescent הדמיה למדמיינת פעילות NF-κB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעכברים כבר הועברו למתקן ההדמיה, תתחיל לבצע את הליך ההדמיה על ידי פתיחת התוכנה ומאתחל את המחשב. הפעל הואמכונת oflurane וזרימת אוויר, ולהבטיח כי ההרדמה זורמת לשניהם תיבה וחדר ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר תחת הרדמת isoflurane בתיבת ההרדמה הברורה. ברגע שיש האטת נשימה, השתמש קמצוץ בוהן כדי לאשר את העכבר הוא מורדם באופן מלא. ואז, להזרים 100 μl של מצע luciferin לעכבר בזריקה רטרו מסלולית 5 שימוש במזרק סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להעביר את העכבר לחדר ההדמיה ולהציב את אפה תחת אף קונוס isoflurane ממוקם שם. העכבר צריך להיות פרקדן. לאבטח כל רגל לבמה עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את ההגדרות המתאימות לתוכנת IVIS לקחת גם תמונה לבנה אור צילום ותמונה של פעילות bioluminescent. זמן החשיפה צריך להיות 10 שניות. לרכוש את התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתמונות שרכשו, מאפשר עכבר כדי להתאושש ואז למקם אותה בכלוב עם גוריה ולעקוב מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום וזורחתמונות הם כיסו באופן אוטומטי ומוצגות על המסך, כמו באיור 2. לנתח את התמונות שנרכשו על ידי צבת האזור של עניין או חוגים &quot;החזר על השקעה&quot; של גודל שווה על כל צד של הבטן התחתונה של העכבר (אחד מעל בלוטת PBS הזריק ואחת מעל בלוטת LPS הזריק-). הגדר את הקריאה לפוטונים. מספר צריך להיות מוצג מצביע הארה זוהתה בתוך כל החזר על השקעה (ראה איור 2B). השתמש במספר זה בניתוח סטטיסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להציג את התמונה האופטימלית, בהמשך להתאים את הסף של האות המוצגת. זה לא ישנה את ההארה המוחלטת קריאה החוצה אבל יאפשר לך להסיר את אות רקע ולהמחיש את ההבדלים בין השליטה ובלוטת LPS-טופל. להקטין את כמות ההארה הראתה עד בלוטת PBS הזריק הוא ללא אות רקע. זה צריך לעזוב את האותות המוגברים בבלוטה עדיין ניכרת בתמונה, כפי שניתן לראות באיור 2 LPS-טופלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Additionaניתוח הליטר, כולל מבחני RNA חלבון ו, ניתן להשלים עם רקמת שד הנשי שנגבתה מנתיחה שלאחר המוות 6. </li></ol> 5. נציג תוצאות כדי להשיג תוצאות לפרש מהשיטות הללו, LPS (או PBS) חייב להיות חדור רק לצינוריות החלב, ומשאיר את הרקמות הסמוכות באין מפריע. הזרקה לתוך הרקמה התת עורית מסביב לפטמה תגרום דלקת עקב פציעה ולא הזיהום המדומה. ההזרקה של trypan הכחול צבע המדוללת ב PBS היא מועילה כאשר לומדים את הטכניקה. 3A האיור מראה בלוטה הוזרקה בהצלחה רוויה עם 100 μl של trypan כחול ב PBS. כפי שניתן לראות, רק עץ ductal צריך להיות מלא בפתרון המוזרק, ולא אמור להיות בולוס באזור ההזרקה. &quot;בולוס&quot; בהקשר זה הוא ההצטברות של הנוזל שהוזרק בפטמה או ברקמות המקיפות את הפטמה בלי עירוי לתוך עץ ductal. זה shלבד באיור 3B. שים לב כי הזריקות בפועל מוצגות באיור 3 הושלמו בנקבה ביום 21 להנקה. בזמן השיא של הנקה (יום 8-10, בשלב שבי LPS מוזרק באמצעות הפרוטוקול הנוכחי), חלב בשפע, וקשה לדמיין את הצינוריות ולקבוע אם הזריקה הושלמה כהלכה. לכן, כעבור זמן נקודות בהנקה הן טובות יותר לזריקות בפועל. זריקה מוצלחת של LPS לתוצאות צינוריות החלב בפעילות מוגברת NF-κB בתוך הבלוטה. זה צריך להיות ברור בעכבר על כתב IVIS הדמיה, ובלוטת LPS הזריק צריכה לוציפראז פעילות גבוהה באופן משמעותי (שנמדד על ידי פוטון ספירה) מבלוטת PBS-המוזרקת, כפי שמוצג באיור 2 (בממוצע, בלוטת LPS קוראה 200% של אות שליטת PBS). עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בהארה בתוך בלוטות LPS-טופלה כcompared לשליטה הנגדית הושג למרות השלמת קבוצה של 4 עכברים 4. מחקר נוסף אפשר גם נצל הזרקת החלב intraductal של או E. חיידק או LPS לNF-κB כתב הטרנסגניים. דומה לעבודה שלנו, מחברים אלה ראו גידול משמעותי ב6 שעתי פעילות כתב לאחר ה coli הזרקה 2. שימו לב, עקב פעילות מכוננת NF-κB במוח ובאברי בטן אחרים, הראשים והבטן של עכברי כתבתנו מראים בעקביות אות כאשר צלמו, אפילו בתחילת מחקר לפני כל מניפולציה. לפיכך, האות הזה יש להתעלם בנוגע לניסוי זה. אות ברורה צריכה להישאר בבלוטת החלב LPS הזריק אחרי התמונה לקריאה מתוך מותאמת ללמזער הארת רקע בבלוטת PBS. תרשים 2 מציג תמונות עם הרקע מופחת. זריקה לא מוצלחת של הבלוטה תהיהתוצאה ככל הנראה ניזק לפטמה. זה יגרום הצביע דלקת, עור ברמה שתהיה ברור על הדמיה. סוג זה של פציעת אות יהיה חזק מאוד ומוגבל לאזור הפטמה שבו הניזק התרחש, אינו בוקע בכל הבלוטה, כפי שראה לאחר זריקה מוצלחת LPS לתוך הצינורות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של הליך. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> איור 2. תוצאות מייצגות מן IVIS bioluminescent ההדמיה. () נרכשות תמונה עם רקע מופחת, חושפות פעילות לוציפראז גדל בבלוטת LPS-המוזרקת. (ב) תמונה מתוך באזור quantifications ריבית נוספת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3 הזרקת עיסוק:.. בלוטת חלב מוזרקת עם צבע באמצעות הזרקת intraductal כדי לבדוק את הדיוק של משלוח דרך הפטמה, עכבר ב 21 יום של הנקה היה מוזרק עם 100 μl של הצבע הכחול trypan המדולל ב PBS. בעקבות קרבה, הבלוטה נחשפה להדמיה. () זריקה מוצלחת ו( B) בולוס של צבע בפטמה.

<ol><li>Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+and+intensity+of+NF-%CE%BAB+activity+determine+the+severity+of+endotoxin-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury.</a> The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).</li>
<li>Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+NF-%C3%8E%C2%BAB+activity+during+Escherichia+coli-induced+mammary+gland+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of NF-ÎºB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection.</a> Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).</li>
<li>Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+in+endotoxin-induced+murine+mastitis+is+strictly+dependent+on+mammary+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages.</a> Veterinary Research. 41, 10(2010).</li>
<li>Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+nuclear+factor+kappaB+in+mammary+epithelium+promotes+milk+loss+during+mammary+development+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection.</a> J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. (21), e2828(2011).</li>
<li>Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Research. 11, R66(2009).</li>
<li>Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+lipopolysaccharide-induced+mastitis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model.</a> Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).</li>
<li>Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen%2C+D+%22Intraductal+Injection+into+the+Mouse+Mammary+Gland.+Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research%22">Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).</li>
<li>Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+bovine+soluble+CD14+reduces+severity+of+experimental+Escherichia+coli+mastitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice.</a> Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).</li>
<li>Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+neutrophils+but+not+mammary+alveolar+macrophages+in+a+murine+model+of+acute+Escherichia+coli+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis.</a> Veterinary Research. 41, 53(2010).</li>
<li>Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+LPS-binding+protein+in+bovine+blood+and+milk+following+bacterial+lipopolysaccharide+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge.</a> Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).</li>
<li>Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+is+needed+to+restrict+the+invasion+of+Escherichia+coli+P4+into+mammary+gland+epithelial+cells+in+a+murine+model+of+acute+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis.</a> Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).</li>
<li>Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mediators+in+Escherichia+coli-induced+mastitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Immunology%2C+Microbiology%2C+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice.</a> Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).</li>
<li>Osterman, K. L., Rahm, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactation+mastitis%3A+bacterial+cultivation+of+breast+milk+symptoms%2C+treatment%2C+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Lactation%22%5BJournal%5D)">Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome.</a> Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).</li>
<li>Sordillo, L. M., Streicher, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+Gland+Immunity+and+Mastitis+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).</li>
<li>Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetically+altered+mice+to+investigate+the+role+of+nuclear+factor-kappa+B+activation+and+cytokine+gene+expression+in+sepsis-induced+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS.</a> Chest. 116, 73S-74S (1999).</li>
<li>Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+NF-kappaB+activation+promotes+urethane-induced+lung+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).</li>
<li>Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-%CE%BAB+signaling+in+fetal+lung+macrophages+disrupts+airway+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis.</a> The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).</li>
<li>Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+IKKepsilon+regulates+energy+balance+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice.</a> Cell. 138, 961-975 (2009).</li>
<li>Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+kinase+II+triggers+cell+membrane+injury+by+inducing+complement+factor+B+gene+expression+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

כאן אנו מנצלים עכבר מהונדס NF-κB כתב וטכניקת הזרקה מותאמת לדלקת בשד מודל, דלקת ברקמת השד נגרמת לרוב על ידי זיהום חיידקים. השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא הזרקת intraductal עצמו. בפועל, זה בדרך כלל ברור אם הזרקת intraductal הייתה מוצלחת. ההזרקה של הסוכנים (LPS או PBS) צריכה להרגיש נוזל ולא אמורה להיות לא מעט התנגדות כמזרק מרוקן. המלכודת הנפוצה ביותר היא פגיעה בפטמה שמובילה למעבר חסום בבלוטה. זה יכול להיות דמיין ידי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Lipopolysaccharide מחיידקי Escherichia (LPS) </td><td> סיגמא </td><td> L 2880 </td><td> סרוטיפ 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> מזרק אינסולין מד 31 </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 328438 </td><td> מחט קצרה </td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> ביתור היקף </td><td> ליקה </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> טרל isoflurane, USP </td><td> MINRAD Inc עבור Rx עלית </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> 200 מערכת IVIS הדמיה &lt;/ Td&gt; <td> קליפר (לשעבר Xenogen) </td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td> מזרק להזרקת luciferin </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-luciferin Firefly, monohydrate מלח נתרן (מצע luciferin) </td><td> כימיה וביולוגית ביוסינט </td><td> L-8240 </td><td> דלל עד 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr></tbody></table>

הזרקת intraductal של lps כמודל עכבר של דלקת בשד: איתות מדמיינת דרך nf-κb כתב מהונדס

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

מודלים בבעלי חיים למחלות אנושיות הם הכרחיים על מנת ללמוד בקפדנות שלבי התקדמות מחלה ומנגנונים נלווים, וסופו של דבר, כמודלים טרום קליניים כדי לבדוק התערבויות. בשיטות אלה, אנו מתארים טכניקה שבה lipopolysaccharide (LPS) מוזרקת לתוך בלוטת החלב המניק עכבר דרך הפטמה, ביעילות הדלקת בשד דוגמנות, או דלקת, של הבלוטה. תוצאות זיהום זה מדומה במוגבר גרעינית גורם kappa B (NF-κB) איתות, ראו בעיני רווחו באמצעות הדמית bioluminescent של עכבר כתב לוציפראז NF-κB 1. המטרה שלנו בפיתוח שיטות אלה הייתה ללמוד הדלקת קשורה בדלקת בשד בבלוטת המניקות, אשר לעתים קרובות כוללת אדמומיות, נפיחות, וחדירה לתא חיסונית 2,3. לכן, היינו מודעים היטב לכך שחתך, או כל סוג של פציעה של העור, הפטמה, או בלוטה כדי להציג את יכל LPSלא להיות מנוצל בשיטות שלנו מאז שהגישה הזאת עשויה לבלבל את הקריאה מתוך של דלקת. אנחנו גם רצויים שיטה ישר קדימה, שלא הצריך pipettes נעשה במיוחד מצויר ביד או על השימוש בmicromanipulators להחזיק כלים מיוחדים האלה במקום. לפיכך, אנו נחושים להשתמש במזרק אינסולין זמין מסחרי ולהזריק לתוך סוכן צינור החלב של פטמה ללא פגע. שיטה זו הייתה מוצלחת ואפשרה לנו ללמוד הדלקת קשורה בהזרקת LPS ללא תופעות נוספות מעולפות על ידי התהליך של הזרקה. בנוסף, שיטה זו מנוצלת גם NF-κB לוציפראז כתב מהונדס עכבר וטכנולוגיית הדמית bioluminescent חזותי וכמותית להראות גדל NF-κB איתות בתוך הבלוטה LPS-4 המוזרקת. שיטות אלה הן עניין לחוקרים מתחומים רבים המבקשים למחלת מודל בתוך בלוטת חלב מניקות, כסופו של דבר, הטכניקהמתואר כאן יכול להיות מנוצל עבור זריקה של מספר החומרים, ואינו מוגבל לLPS בלבד.

מתואר כאן היא טכניקה שבה lipopolysaccharide מוזרקת לתוך בלוטת החלב המניק באמצעות עכבר הפטמה כדי לדמות דלקת בשד, מצב שנגרם בדרך כלל על ידי זיהום חיידקים. תוצאות הזרקה בLipopolysaccharide מוגברת גרעינית גורם kappa B (NF-κB) איתות, מדמיינים באמצעות הדמית bioluminescent של עכבר כתב לוציפראז NF-κB.

הזרקת Intraductal של LPS כמודל עכבר של דלקת בשד: איתות מדמיינת דרך NF-κB כתב מהונדס

מודלים חייתיים של מחלות אנוש נחוצים על מנת לחקור באופן קפדני את שלבי התקדמות המחלה ואת המנגנונים הקשורים אליה, ובסופו של דבר, כ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור מאסטיטיס (mastitis), דלקת של בלוטת החלב, ובאופן ספציפי יותר, להדגים ולכמת את פעילות NF Kappa b בתוך בלוטת חלב דלקתית בתקופת הנקה. זאת מושגים תחילה על ידי הכלאה של נקבה טרנסגנית הנושאת רפורטר עבור NF Kappa b עם זכר מסוג פרא (wild type). שמונה ימים לאחר הולדת הגורים, מוחדר ליפופוליסכריד (lipopolysaccharide) לבלוטת החלב של הנקבה באמצעות טכניקת הזרקה, שאינה גורמת לנזק באתר ההזרקה שש שעות לאחר הפעולה.העכבר עובר דימות בביולומינסנציה כדי לזהות פעילות לוסיפראז בתוך בלוטת החלב. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות פעילות משמעותית של NF KB בבלוטות שטופלו ב-LPS באמצעות שיטת הזרקה תוך-נישבית (intraductal injection), ולאחריה דימות בביולומינסנציה. היתרון המרכזי של הגישה שלנו על פני שיטות אחרות של הזרקה תוך-נישבית הוא שאתר ההזרקה אינו נפגע בשום דרך.דבר זה קריטי לחלוטין אם בכוונתכם לחקור את הדלקת הנלווית להזרקת ה-LPS, שכן כל נזק לאתר ההזרקה או לפטמה יחפיף ויסבך את הבדיקות הללו. לצורך הליך זה נעשה שימוש בעכברים נקבות החיוביות לטרנסגן ה-NGL Reporter. אחת: הנקבות הן בנות שישה שבועות לפחות.החליטו אותן עם זכר FVB wild type באמצעות har והרבייה ביום ה-15 לאחר ההזדווגות. התחילו לבדוק את הנקבות באופן קבוע לסימני הריון, ובפרט היקף בטן בולט. העבירו את הנקבות ההריות לכלובים נפרדים, וכאשר הנקבה האחרונה תהפוך להרה, הוציאו את הזכר מכלוב ההרבייה.נדרש שגר של לפחות שישה גורים להבטחת הנקה נאותה. שמונה ימים לאחר הולדת שגר כזה, יש להמשיך בביצוע הפרוטוקול.החלק המאתגר ביותר של הפרוצדורה הוא ההזרקה הראשונית עצמה. ידיים יציבות ותרגול רב יעזרו, אך תקלות תמיד עלולות להתרחש. היו מוכנים עם מספר עכברים ביום ההזרקה כדי להבטיח הצלחה.התחילו בדילול של ליפופוליסכריד המופק מ-e coli ב-PBS עד לריכוז סופי של 0.1 micrograms per microliter. 50 microliters של תמיסת LPS זו יוזרקו לבלוטת החלב. הכינו מבחנה שנייה עם PBS בלבד לשימוש כהזרקה לבקרת ניסוי.לצד הבמה של מיקרוסקופ ההבדילה. חברו התקן של חרוט אף להגשת ההרדמה. הכינו תאורה חזקה של הבמה באמצעות זרקורים נוספים לפי הצורך.לאחר שהגדרת הניתוח מוכנה, הפעל את מכונת ה-isof fluorine ואת זרימת האוויר. לאחר מכן, טען מזרק אינסולין בכילוי 31 עם 50 µL של תמיסת LPS והנח את המזרק בצד לצורך תרגול ההזרקות. השתמש בצבע triam blue המדולל ב-PBS כדי להמחיש את התוצאות.בשלב הבא, הרדימו את העכבר שייזרק ברגע שנשימתו תאט. הניחו אותו על הבמה וספקו isoflurine באמצעות קונו האף. השתמשו בצביטה כדי לאשר הרדמה מלאה לאורך הפרוצדורה.יש לעקוב אחר דפוס הנשימה של העכבר. יש לכוון את ה-isof fluorine באופן רציף כדי לשמור על נשימה יציבה. השתמשו בטיפה קטנה של 70% ethanol כדי להשטיח את הפרווה בבטנו הגחונית של בעל החיים ואתר את הפטמות.אתרו את הפטמה של בלוטת העיר של ממירי מספר ארבע הימנית בבטן התחתונה באמצעות פינצטה עדינה ביד הלא-דומיננטית. משכו בזהירות את הפטמה החוצה מהעור. אין לסגור את הפינצטה בחוזקה.יש להחזיק את הפטמה באחיזה קלה בלבד ביד הדומיננטית. הביאו את המזרק הטעון לשדה הראייה והחזיקו אותו כך שלא יהיה צורך במיקום מחדש כדי להזריק את תוכנו. כוונו בזהירות את המחט אל הפתח התעלתי הקטן במרכז הפטמה.החדירו כרבע מאורך המחט לתוך התעלה ללא שינוי מיקום. מזריקו את תכולת המזרק במשך שלוש עד חמש שניות. לאחר מכן, הוציאו בזהירות את המחט מהפטמה.מלא מזרק שני עם 50 µL של PBS וחזור על הפרוצדורה בצד שמאל. מספר ארבע, פטמה של בלוטת העשייה השטרנית (inguinal mammary gland) באמצעות בקרת ה-PBS. לאחר השלמת שתי ההזרקות, הפסק את ההרדמה והעבר את העכבר לכלוב התאוששות.הנקבה אמורה להתחיל לזוז תוך חמש דקות. לאחר שעה, החזירו אותה לכלוב ביתי יחד עם ה-puffs שלה. יש לצלם את העכבר שש שעות לאחר ההזרקה.במהלך הזמן הזה, יש לעקוב אחר העכבר אם נצפים סימני מצוקה. יש להפסיק את הניסוי ולהקריב את העכברים במתקן ההדמיה. הכינו את הנקבה להרדמה באמצעות isof fluorine.ודאו שההרדמה זורמת הן לתיבה והן לתא הדמיון. הניחו את העכבר תחת הרדמה של isoflurane בתיבת ההרדמה השקופה. לאחר שהנשימה האטה, השתמשו בצביטה כדי לאשר שהעכבר מורדם לחלוטין.בשלב הבא, הזרק 100 µL של מצע לוציפראז (Lucifer substrate) למסלול הרטרו-אורביטלי באמצעות מחט בכי মাপ 26. מיד לאחר ההזרקה, העבר את העכבר לתא ההדמיה וחבר את קונו האף להגשת Isof Lorraine. הנח את העכבר במצב שכיבה על הגב (supine position) והדבק כל רגל למסבב באמצעות סרט הדבקה שחור ואטום.הזינו את ההגדרות המתאימות לתוכנת ה-IVIS כדי לצלם הן תמונה פוטוגרפית באור לבן והן תמונה של הפעילות הביולומינסנטית. זמן החשיפה צריך להיות 10 שניות לאחר רכישת התמונות. פעלו לפי פרוטוקול ההתאוששות כפי שמתואר עבור שלב לאחר ההזרקה.התמונות הצילומית והלומנסנטית מוטמעות באופן אוטומטי ומוצגות על המסך. נתחו את התמונות שהתקבלו על ידי מיקום מעגלי אזור עניין (ROI) בגודל שווה מעל כל צד של הבטן התחתונה של העכבר: מעגל אחד מעל הבלוטה שזוהתה בהזרקת PBS ומעגל אחד מעל הבלוטה שזוהתה בהזרקת LPS.הגדירו את קריאת המכשיר לפוטונים. צריך להופיע מספר המציין את הלומניסנציה שזוהתה בתוך כל ROI; השתמשו במספר זה בניתוח סטטיסטי כדי להציג את התמונה האופטימלית. כעת כווננו במקום זאת את סף האות המוצג.פעולה זו לא תשנה את קריאת הלומנסנסיה הכוללת, אך תאפשר את הסרת אות הרקע כאשר בלוטת ה-PBS המוזרקת נקייה מאות רקע. העלייה באות בבלוטה שטופלה ב-LPS צריכה להיות ניכרת בתמונה. הזרקות אימון בוצעו ביום ה-21 להנקה, כאשר ייצור החלב נמוך יותר, והצלחת ההזרקה ניתנת להדמיה בקלות באמצעות צביעה ב-trian blue; בבלוטות מימיני (mammary glands) שהוזרקו בהצלחה, רק עץ התעלות התמלא בתמיסה. בהזרקה שלא הצליחה, נצפה הצטברות של נוזל בפטמה או ברקמות הסובבות.הזרקה מוצלחת של LPS לתוך הצינורות החלביים ביום השמיני הובילה לעלייה בפעילות NF KB בתוך הבלוטה, זאת בשל פעילות קונסטיטוטיבית של NF KB במוח ובאיברים בטניים אחרים. נצפה אות בסיס עקבי לפני כל מניפולציה. פעילות הלוסיפראז הייתה גבוהה משמעותית בבלוטה שזוהרה ב-LPS לעומת הבלוטה שזוהרה ב-PBS, מקבוצה של ארבעה עכברים.נמדדה עלייה מובהקת סטטיסטית בלומינסנסציה בבלוטות שטופלו ב-LPS. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי דלקת בבלוטות החלב. היא יכולה להיות מיושמת גם בתחומי מחקר אחרים, כגון מחקר סרטן.ניתן להזריק תאי סרטן או חומרים קרצינוגניים ישירות לתוך התעלה השדית.

intraductal-injection-lps-as-mouse-model-mastitis-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: רדולוביץ', ק., ואחרים. הזרקות של ליפופוליסכריד לעכברים כדי לחקות כניסת מוצרים שמקורם במיקרוביאליזם לאחר פריצת מחסום מעיים. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים הליך שלב אחר שלב להזרקת ליפופוליסכריד (LPS) לעכברים תוך-פריטונית כדי לגרום לדלקת מערכתית.

הזרקה תוך-פריטונית של ליפופוליסכריד חיידקי בעכברים לחקר תגובות חיסוניות מערכתיות

פרוטוקול למשלוח intraductal לא פולשנית של חומרים כימיים מימיים לבלוטת החלב בעכבר מתואר. השיטה מנצלת הזרקה מקומית לפטמות של בלוטות החלב מיקוד צינוריות החלב באופן ספציפי. טכניקה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של תרכובות כולל siRNA, תרופות כימותרפיות ומולקולות קטנות.

הזרקת intraductal עבור משלוח סמים מקומיים לעכבר החלב בלוטת

הפעלה של מוטציות סמויות עם adenovirus-Cre לתוצאות מערכת ductal החלב בסרטן שד גרורתי רלוונטי מבחינה קלינית. התאגדות של אמרגן YFP מאפשרת מעקב של תאים סרטניים גרורתי דיסטלי. מודל זה שימושי ללמוד גרורות סמויות, חסינות אנטי סרטניים, ולעיצוב immunotherapies החדשני לטיפול בסרטן השד.

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

פרוטוקול נוכחי זה משתמש במדווחים פלואורסצנטיים, תיוג in vivo וטכניקות הדמיה תוך-חיוניות כדי לאפשר ניטור של התהליך הדינמי של תחול נויטרופילים בבעלי חיים חיים.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה של IL- 8 האמרגן תלוי דלקת ההפעלה הריאות של עכברים באמצעות הדמיה פליטת אור לא פולשני (BLI). אותו בעל חיים יכול להיות נתון BLI מספר פעמים במשך עד חודשיים מזמן המסירה של הכתב לוציפראז לבנות.

דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

כאן מוצג פרוטוקול כדי לחקות את הכניסה של נגזר בקטריאלי תרכובות לאחר פריצה מכשול המעי. מינון נמוך לא קטלני של ליפופוליסכריד היה מוזרק מערכתית עכברים, אשר היו במעקב במשך 24 שעות לאחר ההזרקה. הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים נקבע במספר נקודות זמן הטחול, הכבד, המעי הגס.

זריקות של ליפופוליסכריד לתוך עכברים לחקות כניסה של מוצרים מיקרוביאלית נגזר לאחר פריצה מכשול המעי

המטרה של הפרוטוקול הזה היא לתאר את הגישה החדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של יצור-הבעת אדנווירוס לתוך בלוטות החלב של העכבר. גישה זו מאפשרת גם מניפולציה ייחודית לסוג תא ולעוגב של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקר.

דוגמנות סרטן השד באמצעות הזרקת הפנים של המין-אדנווירוס המבטא לתוך בלוטת החלב של העכבר

כאן, אנו מתארים מיקוד פשוט שיטה הדמיה כדי להמחיש את הלוקליזציה באתרו של תאים הפרשה את ציטוקינים אינטרפרון גמא באיברי הלימפה משני מוראין. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור ויזואליזציה של ציטוקינים אחרים ברקמות שונות.

הדמיה של אינטרפרון באתרו הפקת גמא בטחול העכבר בעקבות זיהום יסטריה חיידקי

אנו מתארים הזרקה תאיים כי מעסיקה מחט כפוף בקצה כי ניתן לייצב את הגולגולת, ובכך לחסל את הסיכון של נזק על הבסיס הבסיסי. הגישה יכולה לשמש למיפוי הגורל הגנטי ומניפולציות של תאים לטומאנעיים ולמעקב אחר תנועת נוזל מוחי שדרתי.

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

שיטה של הזרקה תוך-יצרנית של ריאגנטים לפתרון אבלטיבי מבוסס אתנול לעץ דביק החלב של העכבר להדמיית ויוו ומניעת סרטן השד מתוארת. הזרקה ישירות לתוך פתח הפטמה מאפשרת מיקוד תאי אפיתל החלב עם נזק מינימלי לרקמות משניות.

משלוח תוך-חינוכי והדמיה של רנטגן של פתרון אבלטיבי מבוסס אתנול למניעה וטיפול מקומי בסרטן השד במודלים של עכבר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה אינטרדוקטלית של וקטורים נגיפיים דרך הטיט כדי להעביר גנים מעניינים לתאי אפיתל החלב.

ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב

חקור דלקת בבלוטת החלב בעכברים באמצעות הזרקת LPS תוך-צינורית ודימות ביולומינסצנטי. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות של פעילות NF-κB בתגובה דלקתית בזמן אמת.

הזרקת Intraductal של LPS כמודל עכבר של דלקת בשד: איתות מדמיינת דרך NF-κB כתב מהונדס

גלה סרטונים נוספים