גישה חצי כמותי להערכת גיבוש biofilm באמצעות פיתוח המושבה מקומט

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות ולמדוד שינויים בהיווצרות ביופילם על ידי הערכת התפתחותן של מושבות מקמטות לאורך זמן. זאת מושג תחילה על ידי גידול זני חיידקים רלוונטיים בתרבית נוזלית. השלב השני הוא הנחת טיפות מהתרביות על אגר תזונתי.

בשלב הבא, עוקבים אחר הכתמים לאורך זמן כדי לזהות את המועד שבו הם מתחילים לפתח מבנים תלת-ממדיים המעידים על תחילת היווצרות מושבות מקומטות. עוקבים אחר התפתחות מורפולוגיית המושבות עד שלא נצפים שינויים נוספים. לבסוף, נעזרים במיקרוסקופיה של הכתמים כדי להראות הבדלים בהתפתחות הביופילם לאורך זמן על ידי זנים ספציפיים או תחת תנאים ספציפיים באופן חצי-כמותי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת ניתוח חצי-כמותי של היווצרות ביופילם בקטריאלי באמצעות התפתחות של מורפולוגיית מושבות מקמטת. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי היווצרות ביופילם ב-Vireo fishery, היא יכולה להיות מיושמת גם לאפיון פנוטיפים של ביופילם במערכות בקטריאליות אחרות כגון basc, slus, pseudomonas osa, ו-vial cholera. רעיון זה לשיטה עלה לנו לראשונה כאשר זיהינו מוטנטים בקטריאליים שהפגינו עיכוב בהתפתחות של היווצרות מושבות מקמטות.

היווצרות ביופילם מושפעת בדרך כלל מצפיפות התאים ומקצב הצמיחה. לכן, לפני הערכת המורפולוגיה של מושבות מקומטות, יש לקבוע את קצב הצמיחה והתנובה של הזנים הרלוונטיים כדי להגדיר את קצב הצמיחה. מדדו את העלייה בצפיפות האופטית או ב-OD של כל זן לאורך זמן, ושרטטו עקומת צמיחה כדי לקבוע את התנובה או את מספר התאים הסופי.

ניתן להשתמש במבחן זריעה של תאים. זני החיידקים הרלוונטיים גודלים בתרבית נוזלית, ולאחר מכן דלילי תרבויות נזרעים על צלחות אגר. לאחר דגירה, מספר התאים החיוניים מחושב ומוצג באופן גרפי כפי שמוצג כאן.

חשוב גם לזהות את התנאים האופטימליים לנקודות (spotting) שיחשפו את ההבדלים הבולטים ביותר בין הביקורת לבין המוטנט הנבדק. כדי להשיג זאת, לפני ביצוע נקודות של זני גידול בתרבית נוזלית תחת תנאים שונים, כגון מצעים או טמפרטורות שונות, ובשלבים שונים של הגדילה, כגון שלב מעריכי (exponential) או שלב סטציונרי, יש להטיל 10 µL של תרבית בצפיפויות תאים שונות על המצע המתאים ולדגור בטמפרטורה הרצויה עד להופעת המורפולוגיה של המושבות. באופן זה, ניתן לקבוע את ה-OD התחלתי האופטימלי עבור סט נתון של זנים או תנאים כדי להתחיל בהליך זה.

העבירו תאי v Fisher eye מלוחיות אגר לתוך 5 mL של מצע LB salt או LBS המכיל את האנטיביוטיקה הדרושה, והדגירו עם ניעור בטמפרטורה של 28 °C למשך לילה. למחרת בבוקר, בצעו תת-תרבית לתאים בדילול של 1:100 לתוך 5 mL של מצע LBS טרי; הדגירו באותם תנאים עד שהתאים הגיעו ל-OD הרצוי ב-600 nm. עבור Vibrio fii, התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר הנקודות (spots) נוצרות מתרביות בעלות OD של כ-0.2. לאחר מכן, העבירו באמצעות פיפט 1 mL מכל תרבית לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה וסובבו בצנטריפוגה במהירות מקסימלית.

במשך דקה אחת, הסירו את הנוזל העליון באמצעות שאיבה ושחקו מחדש את המשקע במילליטר אחד של מי תאור artificial seawater סטריליים בריכוז 70% או ב-SW centrifuge. שלב שטיפה זה יסיר שוב שאריות של מצע ומרכיבים חוץ-תאיים. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו את הנוזל העליון ושחקו מחדש את המשקע השטוף במילליטר אחד של 70%A SW כדי להבטיח שכל דגימה מכילה את מספר התאים כפי שהוערך לפי ה-OD ב-600 ננומטרים.

בצעו התאמות נחוצות על ידי דילול דגימות ריכוזיות יותר עם 70%A SW spot נוסף, 10 microliters מכל תרבית על גבי פלטות LBS המכילות אנטיביוטיקה נחוצה. הקפידו להחזיק את הפפטה עם האצבע ממש מעל פני האגר, ובצעו את הנקודה (spot) בצורה אנכית ולא בזווית. השליכו את הנוזל באיטיות כדי להבטיח פיזור אחיד של הנקודה, והוסיפו את הביקורות החיוביות והשליליות המתאימות על אותה פלטה.

בעת הערכת היווצרות מושבות מקומטות בצלחות קטנות, וריאציה של AFL עשויה להשפיע על התפתחות הביופילם. ההיבט המורכב ביותר של הליך זה הוא זיהוי תחילת היווצרות המושבות המקומטות. לעיתים הדבר ניכר רק לאחר שההתפתחות כבר התקדמה.

כדי ללכוד את תחילת התפתחות מושבות המקמטים, אנו דוגמים נקודות זמן בכל שעה בתוך מסגרת זמן ספציפית. הדבר מאפשר לנו גם לחזור לאחור ולבצע השוואות לאחר שהתפתחותה החלה. כדי להבטיח שהתרבית שהוכתבה תישאר מפוזרת באופן אחיד, המתינו לייבוש הנקודה לפני העברת הפיתה למדגרה, הפכו את הפיתות והדגרו אותן ב-28 degrees Celsius.

דרך אחת להערכת המורפולוגיה של התרביות שנזרעו בנקודות היא באמצעות בדיקת נקודת סוף (endpoint assay), הכוללת הערכה של היווצרות מושבות מקומטות בנקודת זמן שנקבעה מראש לאחר הזריעה. זוהי תוצאה מייצגת מבדיקת נקודת סוף שבה הוערכה היווצרות של מושבות מקומטות. 40 שעות לאחר הזריעה, מוצג מצד שמאל זן של Vibrio FII שאינו יוצר ביופילם, ומצד ימין מוצג זן יוצר ביופילם.

בדיקת נקודת הסיום (endpoint assay) שימושית עבור זנים המראים, או שצפויים להראות, פגמים חמורים ביצירת ביופילם. בדיקה נוספת להערכת מורפולוגיית מושבות היא בדיקת מהלך זמן (time course assay), שבה מעריכים את יצירת מושבות מקומטות לאורך פרק זמן לאחר הנקוטה (spotting), כדי לעקוב בקלות אחר הזמן שחלף מהנקוטה. כווןו טיימר לספירה מעלה.

בהדגמה זו, המורפולוגיה של הכתם הגדל תנוטר מדי שעה, החל מ-12 עד 15 שעות לאחר הזריעה, באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting scope) עם התקן מצלמה, רכישת תמונות וניתוח תמונות. תוכנות מחשב משמשות לצפייה ותיעוד של מורפולוגיית המושבות ולהערכת התחלה והתקדמות של היווצרות מושבות מקומטות. לפני הדמיית תרביות שנזרעו בכתמים, מכסה פטרי ההגדלה מוסר בדרך כלל כדי לאפשר קבלת התמונה הברורה ביותר.

כאן, הנקודות מוארות מלמטה דרך במה זכוכית שקופה באמצעות מקור אור קר, בעוד התמונות נלכדות מלמעלה. הגדרה זו היא האופטימלית לדימוי של התפתחות מושבות מקומטות, מכיוון שמושבות של Vibrio fischeri הן שקופות למחצה. כדי להמחיש באופן מיטבי את התפתחות המושבות המקומטות, התאימו הן את עוצמת התאורה והן את זווית ההחזרה מתחת למושבות החיידקיות, כך שניתן יהיה להבחין במורפולוגיה התלת-ממדית של הביופילמים המתפתחים.

קבעו את תנאי התאורה האופטימליים המספקים את הניגודיות החזקה ביותר בין המושבה המנוקדת לבין רקע האגר שמסביבה. חשוב להשתמש באותה הגדלה בעת איסוף התמונות לאורך כל הניסוי באמצעות המנוף הממוקם בחלק האחורי של המצלמה; העבירו את התצוגה מעדשת המיקרוסקופ למסך המחשב, כווןנו את התצוגה, בצעו פוקוס בהתאם, ואז צלמו את התמונה. צלמו תמונות מתאימות לתיעוד תחילת ההיווצרות וההתפתחות של המושבה המקמטת. הניסוי מסתיים כאשר אין התפתחות נוספת של הביופילם.

בסיום הניסויים שנערכו, התמונות מאוחדות לכדי דמויות כדי להמחיש את התפתחות התבניות לאורך זמן עבור כל זן או תנאי. שימו לב לכמה זמן חולף מרגע ההחדרה ועד לזמן שבו מתחילה היצירה של מושבות מקומטות; תחילת היצירה של מושבות מקומטות מוגדרת כנקודת הזמן שבה היווצרות התבניות והמבנים התלת-ממדיים ניכרת לראשונה. בדוגמה זו, התחלת היווצרות הביופילם ניכרת לאחר 12 שעות עבור זן בקרה בעל יכולת יצירת ביופילם של Vibrio FII, המוצג בפנל העליון.

בפאנל התחתון, תמונות מייצגות של זן מוטנטי של Vibrio FII המראה עיכוב של ארבע שעות בתחילת היווצרות מושבות מקומטות לאורך זמן, כאשר היווצרות הביופילם מתחילה 16 שעות לאחר ההזרקה. שימו לב כי בעוד שנצפות הבדלים דקים בין זנים אלו בנקודות זמן מוקדמות יותר ב-40 שעות, הזנים נראים דומים בעוצמה ובדפוס של היווצרות הביופילם בכל נקודת זמן לאחר תחילת היווצרות המושבות המקומטות. יש לשים לב לדפוס ההתפתחות של המושבות המקומטות.

המבנה עשוי להתפתח מהחוץ פנימה כפי שמוצג בלוח A, או שהוא עשוי להתפתח מהפנים החוצה כפי שמוצג בלוח B. הערכה זו מספקת מנגנון להבחנה בין ביופילמים שנוצרו על ידי זנים שונים או תחת תנאים שונים. מדד חצי-כמותי שני של יצירת ביופילם נעזר בשינוי קוטר המושבה של המושבה המתפתחת לאורך זמן. כפי שמוצג בלוח העליון, זן בעל יכולת יצירת ביופילם מייצג יוצר מושבות שמורכבותן וקוטרן עולות.

לעומת זאת, זן אחר המוצג בפאנל התחתון אינו יוצר ביופילמים. לבסוף, איור זה מציג ייצוג גרפי של העלייה בקוטר המושבה לאורך זמן. עבור שני הזנים הללו, הזן בעל היכולת ליצור ביופילם מיוצג על ידי עיגולים לבנים.

בעוד שהזן שאינו יוצר ביופילמים מיוצג על ידי ריבועים שחורים. ניתוח זה גילה כי גודלן של מושבות המסוגלות ליצור ביופילם גדל בקצב מהיר יותר מאשר המושבות השליליות לביופילם, ובנקודת הזמן הסופית, ההבדל ביניהן היה כמעט פי שניים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להטמיע בזהירות כל זן ולתעד את תחילת היווצרות המושבות המקומטות עבור כל זן.

בהמשך לפרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקת iCal או צביעה רחבה של הגבישים (crystal wide staining) כדי לענות על שאלות נוספות לגבי התהליכים המעורבים ויצירת הביופילם.