Name: גישה חצי כמותי להערכת גיבוש biofilm באמצעות פיתוח המושבה מקומט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: למדו שיטה חצי כמותית להערכת גיבוש biofilm בחיידקים באמצעות מיקרוסקופ ניתוח ומעקב אחר התפתחות מושבות מקומטות לאורך זמן. השיטה מאפשרת השוואה בין זנים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ביטוח בריאות ממלכתי R01 מענק GM59690 הוענק KLV.

1. אפיון ראשוני ושיקולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היווצרות biofilm מושפע בדרך כלל על ידי צפיפות התאים ואת קצב הצמיחה. לכן, יש צורך לקבוע את שיעור הצמיחה (גידול צפיפות אופטית (OD) לאורך זמן) תשואה (מספר התא האחרון) של זן (ים) של עניין על ידי ביצוע עקומת הצמיחה פשוט ציפוי מבחני התא. פגמים הצמיחה, או חוסר התאמה בין OD ומספר התא, יש לקחת בחשבון בעת ​​פירוש תוצאות תצפית ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול את הפקדים חיוביות ושליליות מתאימות על אותה צלחת כאשר מעריכים הקמת המושבה מקומט, כמו וריאציה קלה הצלחת אל צלחת עשויה להשפיע על התפתחות biofilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את התנאים הטובים ביותר לאיתור, כלומר, אלה לחשוף את הבדלים ברורים ביותר בין שליטה לבין מוטציה (ים) של עניין. לגדל זנים בתרבות נוזל בתנאים שונים, כמו מדיה או טמפרטורות שונות, לשלב אחרים של צמיחה (שלב מעריכי או נייח) לפני כתמים. במקום 10 μl של התרבות על צפיפות תאים שונים על גבי מדיה מתאים, דגירה בטמפרטורה הרצויה עד מורפולוגיות המושבה לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay סוף נקודות כולל הערכה של הקמת המושבה מקומט בנקודת זמן קבועה מראש לאחר תצפית (כלומר, 48 שעות). הערכה זו שימושית עבור זנים (או מוצעים להציג) התערוכה פגמים חמורים במבנה biofilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay כמובן זמן מעריך הקמת המושבה מקומט על פני תקופה של זמן (כלומר, כל שעה) לאחר כתמים. Assay זה מאפשר הערכה כמותית למחצה של היווצרות biofilm בכך שהוא מאפשר לקבוע את תחילת היווצרות קמטים המושבה ופיתוח הדפוס על פני תקופה של זמן. משך הניסוי ואת מספר נקודות איסוף לקורס זמן נתון יש לקבוע בניסויים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב בקלות אחר הזמן שלאחר איתור, נקבע עלimer לספור עד. </li></ol> 2. הערכה מיקרוסקופית של מורפולוגיה המושבה מקומט ב V. fischeri <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסן ו &#39; fischeri התאים לתוך 5 מ&quot;ל של מלח-LB (LBS) בינוני 13 (1% [w / v] tryptone, 0.5% [w / v] תמצית שמרים, 2% [w / v] נתרן כלורי, 50 מ&quot;מ טריס-HCl [ pH 7.5]) המכיל את כל אנטיביוטיקה הדרושים דגירה, עם רעד, בן לילה ב 28 ° C. בבוקר, תת התאים עם דילול 1:100 לתוך 5 מ&quot;ל של מדיום LBS דגירה טרי באותם תנאים עד שהתאים הגיעו OD 600 הרצוי (למשל, OD 600 = 0.2 או 0.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של תרבות לתוך צינור microfuge ו צנטריפוגות בקבוצת microfuge במהירות המרבית למשך דקה אחת. הסר את supernatant ידי שאיפה. שוטפים את התאים להסיר התקשורת שיורית ורכיבים תאיים על ידי resuspending גלולה ב 1 מ&quot;ל של מי ים סטריליים מלאכותיים 70% (ASW) (35 מ&quot;מ MgSO 4-7H 2 O, 7 mM CaCl2-2H 2 O, 210 מ&quot;מ NaCl, KCl mM 7) וחזרה על צנטריפוגה. Resuspend גלולה שטוף ב 1 מ&quot;ל של ASW 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי מדגם זה מכיל את אותו מספר של תאים כפי שנאמדה ב -600 ננומטר ידי OD. בצע את ההתאמות הנדרשות על ידי דילול דגימות מרוכז יותר ASW 70% נוספים. בניסויים ראשוניים, תרבויות ספוט בבית הראשונים ערכים שונים כדי לקבוע OD OD החל האופטימלי עבור קבוצה נתונה של זנים או תנאים. התוצאות הטובות ביותר ניתנות על ידי ו &#39; fischeri כאשר נוצרות נקודות מתרבויות עם OD של כ 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 10 μl של תאים שטף על גבי צלחות המכילות ק&quot;ג כל אנטיביוטיקה הדרושים. כאשר איתור תרבות לצלחת, הקפד פיפטה יציב (עם האצבע) מעל פני השטח אגר. לאתר אנכית, לא בזווית, ועל להוציא את הנוזל לאט התפלגות אחידה של המקום. בדרך כלל כל זן הוא הבחין פעם אחת בכל צלחת (עד 6 נקודות לכל צלחת), שנינותש הצלחות מרובות (2-3) בכל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את התרבות הבחין עדיין מופץ באופן שווה, במקום לאפשר לו להתייבש לפני שעבר את הצלחת אל האינקובטור. הפוך את הצלחות דגירה אותם 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על המורפולוגיה של תחילת מקום גדל והולך מדי שעה בשעה 12-15 שעות לאחר חיסון. אנו משתמשים היקף לנתח (STEMI Zeiss 2000-C) עם קובץ מצורף המצלמה (הקידמה C10 PLUS) ו CapturePro הקידמה ותוכניות ImageJ תוכנה לצפות ולתעד מורפולוגיה המושבה כדי להעריך את התקדמות התחלה של היווצרות המושבה מקומט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקנה ספציפית המצוינים בשלב 2.5, כתמים מוארים מלמטה ועד לשלב זכוכית שקוף עם מקור אור EC 1500 CL קר, בעוד תמונות נלכדים מלמעלה. התקנה זו היא אופטימלית לפיתוח המושבה הדמיה מקומט כי V. fischeri המושבות (כתמים) הם שקופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיעדר ציוד מסוים מופיע רחובEP 2.5, מורפולוגיה צג המושבה קמטים באמצעות כל מיקרוסקופ לנתח המאפשרת צפייה במושבה מלא ויש לו מקור אור מתכווננת, באופן אידיאלי, המצלמה המצורפת. במידת הצורך, מצלמה דיגיטלית יכול גם להיות מנוצל בהעדר המצלמה המצורפת, אבל זה לא אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטובה ביותר לחזות התפתחות המושבה מקומט, יש צורך להתאים גם את עוצמת התאורה והזווית של השתקפות מתחת מושבות חיידקים כאלה, מורפולוגיה תלת מימדי של biofilms מתפתחות ניתן להבחין. לקבוע את תנאי תאורה אופטימליים המספקים את הניגוד החזק בין המושבה הבחינו והרקע אגר שמסביב, כך לאדריכלות (קמטים) של המושבה הוא להבחין בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים מסוימים, הצבע של המושבה הבחין חייבים גם לקחת בחשבון, כמו שינויים בצבע המושבה יכולה להתרחש במהלך היווצרות biofilm. כוון את העוצמה ואת הזווית של מקור התאורה לחשוףאלה שינויים עדינים צבע. פעם אחת את ההגדרות המתאימות מושגות, לשמור אותם במשך כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב כמה זמן עובר מרגע של חיסון לזמן שבו הקמת המושבה מקומט יוזם על זן אחד או מצב. להגדיר את תחילת היווצרות קמטים המושבה כנקודת הזמן שבה היווצרות דפוסים ומבנים 3D (כלומר, יוצרים פסי בקצה החיצוני או &quot;אדוות&quot; המתרחשים במרכז) ניכר 1. התאים שעברו מוטציה, עשויות להציג ירידה או עלייה הזמן להתחיל של היווצרות המושבה מקומט (למשל, איור. 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתעד את תחילת הפיתוח של היווצרות קמטים המושבה על ידי לכידת תמונות דיגיטליות המתאימים. חשוב להשתמש בהגדלה אותה בעת איסוף תמונות לאורך כל הניסוי. לעבור את הנוף העינית של המיקרוסקופ למסך המחשב באמצעות מנוף הממוקם בצד האחורי של המצלמה. בעת מעבר בין העיניתומסך צפייה המחשב, להתאים את התצוגה ולמקד בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תרבויות הדמיה מנוקדים, מכסה של צלחת פטרי מוסר בדרך כלל כדי לספק את התמונה הברורה. עם זאת, זה צעד לא חובה, כמו תרבויות מנוקדים ניתן הדמיה באמצעות המכסה באמצעות ההתקנה המפורט צעדים 2.5 ו -2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל נקודת זמן לאחר תחילת היווצרות המושבה מקומט לציין את דפוס התפתחות המושבה מקומט. ארכיטקטורת עלולים לפתח מחוץ פנימה, או מחוץ פנימה הערכה זו מספקת מנגנון להבחין בין biofilms שהוקמה על ידי זנים שונים או בתנאים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הקוטר של המושבה המתפתחת בכל נקודת זמן. ניתן לעשות זאת באופן ידני, או באופן דיגיטלי באמצעות התוכנה המשויך. אם נעשה באופן דיגיטלי, השתמש בתוכנית CapturePro הקידמה תוכנה 1 לכייל את סרגל קנה המידה כדי הגדלה המסוים של הניסוי. כלול את סרגל קנה המידה של התמונה בכל בשבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את קוטר המושבה באמצעות תוכנה ImageJ, לפתוח כל קובץ תמונה. לתקנן את סרגל קנה המידה באופן הבא: בחר את &quot;אפשרות קו ישר&quot; מסרגל הכלים. שכבת בר בקנה מידה מוטבע עם קו ישר באורך ורוחב אותו. בחר &quot;סולם הגדר&quot; מהכרטיסייה שכותרתו &quot;ניתוח&quot;. בתיבת &quot;ידוע המרחק&quot;, הכנס את אורך המתאים (כפי שנקבע משורת בהיקף המקורי, כלומר, 2 מ&quot;מ) ולחצו על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;קו ישר&quot; אפשרות להוסיף קו אופקי על פני המקום. תחת הלשונית ניתוח, בחר &quot;מדוד&quot;. בחלון התוצאות החדשות, אורך מחושב יסופק. להשיג מידה 2 על ידי הוספת קו אנכי על פני המקום. מחדש לחשב את קוטרו. רשום את הממוצע של שתי המדידות. גרף הקוטר הממוצע על כל מקום בכל נקודת זמן באמצעות תוכנה כגון Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הניסוי מתרחש גם בנקודה זמן מוגדר או כאשר אין עודהפיתוח של biofilm. לאחר סוף הוא הגיע, לאחד את התמונות לתוך הדמות (ים) כדי לחזות את התפתחות הדפוס לאורך זמן באמצעות תוכנה כגון Powerpoint. </li></ol> 3. נציג תוצאות בניסויים אלה השתמשנו V. fischeri כאורגניזם מודל ללמוד היווצרות biofilm ידי הערכת התפתחות המושבות מקומט על פני אגר מוצק. Biofilm, לייצר זנים של V. fischeri מושבות טופס עם ארכיטקטורת 3D נרחב בתוך 40 שעות (איור 1) 8,9,14. כאשר בחנו במשך הזמן, מתברר כי הקמת המושבה מקומט על ידי זן פקד מפעילה מוקדם ככל כ 12 שעות לאחר חיסון (בהתאם לתנאים מסוימים) (איור 2) 9. לעומת זאת, היווצרות biofilm ידי מוטציה נציג בהשהייה של כ 4 שעות, לא יוזם עד כ 16 שעות לאחר חיסון 9. RepeaTS של ניסויים אלה הראו כי העיתוי היה עקבי יחסית, מה שהופך את הערכה זו חצי כמותית 9. המדד השני חצי כמותית של היווצרות biofilm עושה שימוש שינוי בקוטר של המושבה המתפתחת עם הזמן. כפי שמוצג באיור. 3A, זן נציג biofilm-המוסמכת מהווה מושבות העלייה המורכבות בקוטר יחסית זן נציג שאינו ליצור biofilms. מדידות קפדניות לאורך זמן של קוטר של המושבות שהוקמה על ידי שני זנים עולה כי גודל biofilm-המוסמכות מושבות עלה בשיעור גדול יותר מאשר biofilm שלילי המושבות, ובשלב שעת סיום 2 שונה בכמעט 2 - פי (איור 3 ב). כך, אם כי תמונות של זמן מאוחר נציג או &quot;סוף נקודות&quot; מורפולוגיה המושבה לעיתים קרובות מוצגים בספרות, נוספים וכמותיות הנתונים ניתן לאסוף את זה יאפשר הבנה טובה יותר של פגם biofilm.<img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> באיור 1. סוף נקודות assay. נתון זה הוא דוגמה assay סוף נקודות באמצעות נציג שאינו biofilm יוצרי (משמאל) biofilm להרכיב (מימין) זנים של V. fischeri. התמונות הללו נאספו ב 40 שעות שלאחר כתמים. תמונות אלה נוצרו עם wild-type ו &#39; fischeri המכיל בקרת וקטור (לא biofilm יוצרי) או חלק overexpressing הוב&quot;א פלסמיד (biofilm יוצרי) והיו הנתונים שנאספו להגדיר עבור מוריס et al., 2011. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> 2. איור זמן מנות assay. הפאנל העליון מכיל תמונות מייצגות של היווצרות biofilm ידי זן biofilm-המוסמכת השליטה V. fischeri במשך הזמן שבחרת. תחילת היווצרות biofilm ניכר על 12 שעות. הפאנל התחתון מכיל אני נציגהמגים של זן מוטנטי של V. fischeri שמספקת עיכוב (4 ג) ב תחילת היווצרות קמטים המושבה לאורך זמן, עם היווצרות biofilm ייזום ב 16 שעות לאחר חיסון. שים לב ב 40 שעות זנים נראים דומה בעוצמת ו דפוסים של היווצרות biofilm, בעוד הבדלים דקים בין זנים אלה הם נצפו רק בנקודות זמן קודמות. תמונות אלה נוצרו עם הוב&quot;א overexpressing wild-type ו sypE מוטציה V. תאים fischeri וחלק היו של הנתונים שנאספו להגדיר עבור מוריס et al., 2011. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> 3. איור המושבה בקוטר כניתוח חצי כמותית של היווצרות biofilm. () זמן מהלך היווצרות biofilm על ידי נציג (הפאנל התחתון) זנים biofilm יוצרי (הפאנל העליון) ולא biofilm יוצרי של V. fischeri. שים לב כי המתח biofilm יוצרי מציג עלייה גדולה יותרבקוטר לאורך זמן ביחס למתח הלא biofilm להרכיב. תמונות אלה נוצרו עם wild-type ו &#39; fischeri המכיל חלק overexpressing הוב&quot;א פלסמיד (biofilm יוצרי) או בקרת וקטור (לא biofilm יוצרי) והיו הנתונים שנאספו להגדיר עבור מוריס et al., 2011. (ב) ייצוג גרפי של גידול בקוטר של המושבה לאורך זמן על ידי שני זנים בלוח א &#39;אלה נתונים שנוצרו באמצעות התוכנה ImageJ ו-Excel כמתואר בפרוטוקול.

<ol><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li>
<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+as+complex+differentiated+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187(2002).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20(2005).</li>
<li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li>
<li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae%3A+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT%2C+vpsR%2C+and+hapR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388(2007).</li>
<li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160(2005).</li>
<li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li>
<li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus%2C+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li>
<li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114(2011).</li>
<li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113(2002).</li>
<li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+%C3%8F%C6%9254-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ïƒ54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485(2005).</li>
<li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215(2009).</li>
<li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986(1994).</li>
<li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437(2008).</li>
<li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866(2010).</li>
<li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rdar+morphotype%2C+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234(2005).</li>
<li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888(2006).</li>
<li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117(2009).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

בעבודה זו אנו מתארים שיטה חצי כמותי להערכת היווצרות biofilm באמצעות V. fischeri כאורגניזם מודל. באופן ספציפי, אנו מנצלים מיקרוסקופ לנתח עם קובץ מצורף המצלמה לעקוב אחר היווצרות biofilm ופיתוח כמו הקמת המושבה מקומט לאורך זמן על פני אגר מוצק. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שני סוגים מסוימים של שיטות שאנחנו בדרך כלל להשתמש כדי להעריך את הקמת המושבה מקומט. הראשון הוא assay סוף נקודות, אשר מאפשר לנו לבחון את הארכיטקטורה הסופית, הכוללת 3D, דפוסים, ו בקוטר של התרבות הבחין בכל נקודה שנבחר &quot;הסופי&quot; לעת. גישה זו שימושית ביותר להערכת זנים מוטנטים או תנאים שיובילו ליקויים דרמטיים במבנה biofilm. עם זאת, גישה זו אינה מבחינה בין הבדלים דקים יותר המתרחשות בנקודות זמן עד נקודת הקצה שנבחרה. יותר מקרוב אחר הקמת המושבה מקומט, אנו משתמשים כמובן זמן assay, אשר מאפשר לנו לזהות את תחילת Wrinkled הקמת המושבה ולצפות הפיתוח שלה לאורך זמן. בעקבות גישה זו, הבדלים דקים יותר ב העיתוי של הקמת המושבה מקומט, אדריכלות 3D, ניתן לזהות דפוסים. השתמשנו זה assay כמובן זמן לייצר שני וכמותיות מבחני של היווצרות biofilm. ראשית, הזמן שבו המתח מתחיל לפתח ארכיטקטורת 3D ניתן להשוות לזה של זנים שליטה. מצאנו כי עיכוב היווצרות biofilm של מוטציה מסוימת באותם תנאים הוא עקבי למדי 9. לדוגמה, הנתונים המוצגים בתרשים. 2, מוטציה באופן עקבי הוצגו על עיכוב H 4 בייזום היווצרות biofilm. המדד השני חצי כמותית של היווצרות biofilm הוא השינוי בגודל של בקוטר של המושבה מקומט (נקודה). מצאנו כי הקוטר של מושבות מקומטים בהדרגה שונה מזו של הלא biofilm המושבות, והגיע על ההבדל 2 פי בנקודת זמן סוף (איור 3 </strong&gt;) (מוריס Visick, נתונים שלא פורסמו). נכון להיום, אנחנו לא הבחינו 1 פנוטיפ בלי השני (כלומר, היווצרות biofilm ללא הגדלה של קוטר המושבה) (נתונים שלא פורסמו), אם כי אפשרי עדיין מוטציות מסוימות יתנהג בצורה שונה. אכן, כבר דווח על V. cholerae כי חלק מכך מושבות מקומט לעלייה משמעותית בקוטר המושבה בעוד שאחרים לא 15. עם זאת, להערכת שינוי בקוטר לאורך זמן יכול לסייע ואפיון של מוטנטים biofilm פוטנציאליים ו / או לספק מדד כמותי נוסף של מוטציות עם עיכובים בפיתוח. של שני מדדים של היווצרות biofilm (זמן קוטר), הקובע את תחילת היווצרות המושבה מקומט הוא רגיש יותר, אך גם סובייקטיבית יותר, מאשר לקבוע את הקוטר של המקום. למרות זאת, שני אמצעים לספק הערכה כמותית של חצי פנוטיפ כי הוא שימושי מאוד לחוקרים biofilm אך לא ניתנות בקלות quantification. בעת ביצוע מבחני בתרבית מנוקדים, חשוב להביא בחשבון את התנאים הסביבתיים בהם הבחינו זנים מתורבתים. הקמת המושבה מקומט מושפעת לעתים קרובות על ידי תנאים סביבתיים שונים, כולל זמינות הטמפרטורה מזין, ולחות. כדי להפחית את השונות בין ניסויים, כדאי לבצע סטנדרטיזציה בתנאים אלה ככל האפשר הרבה יותר (כלומר סטנדרטיזציה צלחות אגר לנפח להגדיר culturing זני מנוקדים בטמפרטורה מבוקרת). שליטה נוספת השונות בין ניסויים תצפית, חשוב לכלול את הזנים המתאימים שליטה בתוך כל קבוצה של ניסויים. לבסוף, כאשר מפרשים את נתוני מבחני אלה, יש צורך לבצע כל ניסוי 1 מספר פעמים (3 +), במיוחד כאשר הערכת הבדלים דקים הקמת המושבה מקומט (למשל, עיכוב היווצרות biofilm או הבדלים דפוסים). מספר מגבלות של פרוטוקול זה הם: 1) determining אם התאים יש פגם הצמיחה עלול להיות קשה: הצמיחה של תאים בתרבית נוזל לא יכול לשקף במדויק שיעורי צמיחה על התקשורת מוצקים, וכן קביעת מדויק של צמיחה של biofilm יוצרי תאים, אשר עשויים להישאר יחד, לא יהיה אפשרי; 2) זנים עם פגמים הצמיחה יהיה בעייתי לנתח, 3) זה לא ייתכן שניתן להבחין בהבדלים בין זנים בקוטר עם פנוטיפים biofilm עדינים; 4) עבור זנים שאינם גדלים טבעת הקונצנטרי זה לא יכול להיות אפשרי למדוד במדויק את שינויים בקוטר 5) תוך דפוסים ניתן שנצפו במהלך היווצרות biofilm, אין דרך לכמת את דפוסים של biofilm וכתוצאה מכך, ו 6) אין שום דרך למדוד את Z-מימד של biofilm עם זה ניסיוני הגדרת . למרות מגבלות אלה, פרוטוקול זה בכל זאת מספק אמצעי כדי להשיג נתונים מספריים כדי לסייע בהערכת הקמת המושבה מקומט. בפרוטוקול זה, אנו מנצלים הדמיה ספציפימערכת (כלומר, מיקרוסקופ Zeiss לנתח ואת הקידמה CapturePro הדמיה תוכנה) להתבונן ולהעריך הקמת המושבה מקומט. מערכת הדמיה המתוארת כאן היא חזקה: את היכולת לזהות את תחילת היווצרות קמטים המושבה, ובכך להעריך את התפתחות בגישה כמובן זמן, הוא משפר באמצעות מיקרוסקופ לנתח. עם זאת, אם טכנולוגיה זו אינה זמינה, פרוטוקול יכול להיות מותאם לשימוש עם ציוד אחר, כולל מצלמה דיגיטלית פשוטה עם דגש זום. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בהערכה של התפתחות המושבה מקומט, זה יכול גם להיות שונה כדי להעריך את היווצרות קרומית, סוג של biofilm המתפתחת כאשר תאי גדלים באופן סטטי בתרבות נוזלי. פרוטוקול זה יכול גם להיות שימושי בהערכת אינדיקטורים אחרים של היווצרות biofilm, כולל שילוב של צבעים מסוימים אל המושבות הבחין במהלך ההתפתחות biofilm. אלה כוללים, אך לא רק, צבעים כגון קונגו האדום calcofluאו שיכול להיקשר צלולוזה, מרכיב נפוץ של חיידקים biofilms 16. בנוסף, על פרוטוקול זה, אם כי פיתחו לשימוש עם V. fischeri, לא רק אורגניזם זה, אבל ניתן להכליל את לימוד היווצרות biofilm באורגניזמים שונים רבים, כגון subtilis בצילוס 4, Vibrio cholerae 5, parahaemolyticus Vibrio 6, ו Pseudomonas aeruginosa 7, אשר כל היווצרות קמטים התערוכה המושבה. בסופו של דבר, זה גם יכול להיות מותאם ללמוד מורפולוגיות המושבה אחרים שיש להם דפוס התפתחותי, כגון, פוטנציאל, דפוסים המתרחשת במהלך הצמיחה של 17 Myxococcus xanthus ופיתוח מבנה אווירי Pseudomonas aeruginosa 18. פרוטוקול זה הוא, אפוא שימוש בכלל לחוקרים למיקרוביולוגיה biofilm.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C הביתור מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (שהושג באמצעות מיקרוסקופ לוקאס) </td></tr><tr><td> הקידמה C10 PLUS </td><td> JENOPTIK אופטי מערכות בע&quot;מ </td><td> 017953-602-26 </td><td> מצורף למצלמה (שהושג באמצעות מיקרוסקופ לוקאס) </td></tr><tr><td> CL 1500 EC מקור אור קר </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (שהושג באמצעות מיקרוסקופ לוקאס) </td></tr><tr><td> הקידמה CapturePro </td><td> JENOPTIK אופטי מערכות בע&quot;מ </td><td> תוכנה חופשית עם המצלמה רשום </td><td> המחשב תוכנית לכידת תמונה </td></tr><tr><td> תמונה J </td><td> NIH </td><td> התוכנה החופשית:ij / download.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> המחשב תוכנית מדידות קוטר </td></tr></tbody></table>

גישה חצי כמותי להערכת גיבוש biofilm באמצעות פיתוח המושבה מקומט

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, או משטח של תאים המחוברים קהילות הגלום מטריקס תאית, מייצגים אורח חיים משותף חיידקים רבים. בתוך biofilm, תאים חיידקיים מציגים לעיתים שינו פיזיולוגיה, כולל עמידות משופרת בפני אנטיביוטיקה ולחצים סביבתיים אחרים 1. בנוסף, biofilms יכול לשחק תפקידים חשובים מארח חיידק אינטראקציות. Biofilms להתפתח כאשר מעבר חיידקים מן הפרט, תאים planktonic כדי ליצור מורכבות, רב תאיים בקהילות 2. במעבדה, biofilms נלמדים על ידי הערכת הפיתוח של פנוטיפים biofilm ספציפיים. פנוטיפ biofilm משותפת כרוכה הקמת מושבות חיידקים מקומט או rugose על אגר מוצק התקשורת 3. הקמת המושבה מקומט מספק אמצעי פשוט ושימושי במיוחד כדי לזהות ולאפיין זני חיידקים המציגים פנוטיפים biofilm שהשתנו ולאחר לחקור תנאים סביבתיים biofilm היווצרות השפעה. WRIהקמת המושבה nkled משמש כאינדיקטור של היווצרות biofilm במגוון רחב של חיידקים, כולל שני חיידקים גראם חיוביים, כגון subtilis בצילוס 4 ו חיידקים גראם שליליים, כגון Vibrio cholerae 5, 6 parahaemolyticus Vibrio, Pseudomonas aeruginosa 7, ו Vibrio fischeri 8. חיידק ימי ו &#39; fischeri הפך מודל ליצירת biofilm בגלל התפקיד הקריטי של biofilms במהלך הקולוניזציה המארח: biofilms המיוצר על ידי ו &#39; fischeri לקדם קולוניזציה של הוואי bobtail דיונון 8-10 Euprymna scolopes. חשוב לציין, פנוטיפים biofilm שנצפתה חוץ גופית לתאם עם היכולת של V. תאים fischeri ביעילות ליישב חיות מארח: זנים לקויי ליצירת biofilm במבחנה בעלי פגם קולוניזציה 9,11, ואילו זנים מציג גדלפנוטיפים biofilm משופרים להתיישבות 8,12. V. fischeri כן מספקת המערכת מודל פשוט להעריך את המנגנונים המווסתים את היווצרות חיידקים אשר biofilm ואיך biofilms המארח קולוניזציה הפגיעה. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את שיטת חצי כמותי להערכת היווצרות biofilm באמצעות V. fischeri כמערכת מודל. שיטה זו כוללת איתור קפדני של תרבויות חיידקים בריכוזים ואמצעי אחסון מוגדרים על גבי מדיה אגר מוצק; התרבות הבחין הוא שם נרדף למושבה חיידקי אחד. טכניקה זו &quot;תרבות הבחינה&quot; יכול להיות מנוצל כדי להשוות פנוטיפים biofilm ברוטו ב בודדות, שצוינו זמן נקודות (נקודה בסוף מבחני), או לזהות ולאפיין פנוטיפים biofilm עדינים בזמן מנות מבחני של פיתוח biofilm מדידות של קוטר המושבה , אשר מושפעת היווצרות biofilm. לכן, שיטה זו מספקת ניתוח חצי כמותית של היווצרות biofilm, לכלmitting הערכת העיתוי ועל דפוסים של התפתחות המושבה מקומט בגודל היחסי של המבנה המתפתח, תכונות המרחיבות מעבר מורפולוגיה הכוללת פשוט.

אנו מספקים פשוט, חצי כמותית שיטה לחקור היווצרות biofilm<em&gt; במבחנה</em&gt;. שיטה זו מנצלת את STEMI Zeiss 2000-C הביתור מיקרוסקופ (עם קובץ מצורף המצלמה) כדי לפקח גם העיתוי של היווצרות דפוס biofilm, כפי שנבחנו על ידי פיתוח של מושבות מקומטים.

ביופילמים (biofilms), או קהילות של תאים ההיצמדים למשטח ועטופים במטריקס חוץ-תאי, מייצגים אופן חיים נפוץ עבור חיידקים רבים. בתוך...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות ולמדוד שינויים בהיווצרות ביופילם על ידי הערכת התפתחותן של מושבות מקמטות לאורך זמן. זאת מושג תחילה על ידי גידול זני חיידקים רלוונטיים בתרבית נוזלית. השלב השני הוא הנחת טיפות מהתרביות על אגר תזונתי.בשלב הבא, עוקבים אחר הכתמים לאורך זמן כדי לזהות את המועד שבו הם מתחילים לפתח מבנים תלת-ממדיים המעידים על תחילת היווצרות מושבות מקומטות. עוקבים אחר התפתחות מורפולוגיית המושבות עד שלא נצפים שינויים נוספים. לבסוף, נעזרים במיקרוסקופיה של הכתמים כדי להראות הבדלים בהתפתחות הביופילם לאורך זמן על ידי זנים ספציפיים או תחת תנאים ספציפיים באופן חצי-כמותי.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת ניתוח חצי-כמותי של היווצרות ביופילם בקטריאלי באמצעות התפתחות של מורפולוגיית מושבות מקמטת. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי היווצרות ביופילם ב-Vireo fishery, היא יכולה להיות מיושמת גם לאפיון פנוטיפים של ביופילם במערכות בקטריאליות אחרות כגון basc, slus, pseudomonas osa, ו-vial cholera. רעיון זה לשיטה עלה לנו לראשונה כאשר זיהינו מוטנטים בקטריאליים שהפגינו עיכוב בהתפתחות של היווצרות מושבות מקמטות.היווצרות ביופילם מושפעת בדרך כלל מצפיפות התאים ומקצב הצמיחה. לכן, לפני הערכת המורפולוגיה של מושבות מקומטות, יש לקבוע את קצב הצמיחה והתנובה של הזנים הרלוונטיים כדי להגדיר את קצב הצמיחה. מדדו את העלייה בצפיפות האופטית או ב-OD של כל זן לאורך זמן, ושרטטו עקומת צמיחה כדי לקבוע את התנובה או את מספר התאים הסופי.ניתן להשתמש במבחן זריעה של תאים. זני החיידקים הרלוונטיים גודלים בתרבית נוזלית, ולאחר מכן דלילי תרבויות נזרעים על צלחות אגר. לאחר דגירה, מספר התאים החיוניים מחושב ומוצג באופן גרפי כפי שמוצג כאן.חשוב גם לזהות את התנאים האופטימליים לנקודות (spotting) שיחשפו את ההבדלים הבולטים ביותר בין הביקורת לבין המוטנט הנבדק. כדי להשיג זאת, לפני ביצוע נקודות של זני גידול בתרבית נוזלית תחת תנאים שונים, כגון מצעים או טמפרטורות שונות, ובשלבים שונים של הגדילה, כגון שלב מעריכי (exponential) או שלב סטציונרי, יש להטיל 10 µL של תרבית בצפיפויות תאים שונות על המצע המתאים ולדגור בטמפרטורה הרצויה עד להופעת המורפולוגיה של המושבות. באופן זה, ניתן לקבוע את ה-OD התחלתי האופטימלי עבור סט נתון של זנים או תנאים כדי להתחיל בהליך זה.העבירו תאי v Fisher eye מלוחיות אגר לתוך 5 mL של מצע LB salt או LBS המכיל את האנטיביוטיקה הדרושה, והדגירו עם ניעור בטמפרטורה של 28 °C למשך לילה. למחרת בבוקר, בצעו תת-תרבית לתאים בדילול של 1:100 לתוך 5 mL של מצע LBS טרי; הדגירו באותם תנאים עד שהתאים הגיעו ל-OD הרצוי ב-600 nm. עבור Vibrio fii, התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר הנקודות (spots) נוצרות מתרביות בעלות OD של כ-0.2. לאחר מכן, העבירו באמצעות פיפט 1 mL מכל תרבית לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה וסובבו בצנטריפוגה במהירות מקסימלית.במשך דקה אחת, הסירו את הנוזל העליון באמצעות שאיבה ושחקו מחדש את המשקע במילליטר אחד של מי תאור artificial seawater סטריליים בריכוז 70% או ב-SW centrifuge. שלב שטיפה זה יסיר שוב שאריות של מצע ומרכיבים חוץ-תאיים. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו את הנוזל העליון ושחקו מחדש את המשקע השטוף במילליטר אחד של 70%A SW כדי להבטיח שכל דגימה מכילה את מספר התאים כפי שהוערך לפי ה-OD ב-600 ננומטרים.בצעו התאמות נחוצות על ידי דילול דגימות ריכוזיות יותר עם 70%A SW spot נוסף, 10 microliters מכל תרבית על גבי פלטות LBS המכילות אנטיביוטיקה נחוצה. הקפידו להחזיק את הפפטה עם האצבע ממש מעל פני האגר, ובצעו את הנקודה (spot) בצורה אנכית ולא בזווית. השליכו את הנוזל באיטיות כדי להבטיח פיזור אחיד של הנקודה, והוסיפו את הביקורות החיוביות והשליליות המתאימות על אותה פלטה.בעת הערכת היווצרות מושבות מקומטות בצלחות קטנות, וריאציה של AFL עשויה להשפיע על התפתחות הביופילם. ההיבט המורכב ביותר של הליך זה הוא זיהוי תחילת היווצרות המושבות המקומטות. לעיתים הדבר ניכר רק לאחר שההתפתחות כבר התקדמה.כדי ללכוד את תחילת התפתחות מושבות המקמטים, אנו דוגמים נקודות זמן בכל שעה בתוך מסגרת זמן ספציפית. הדבר מאפשר לנו גם לחזור לאחור ולבצע השוואות לאחר שהתפתחותה החלה. כדי להבטיח שהתרבית שהוכתבה תישאר מפוזרת באופן אחיד, המתינו לייבוש הנקודה לפני העברת הפיתה למדגרה, הפכו את הפיתות והדגרו אותן ב-28 degrees Celsius.דרך אחת להערכת המורפולוגיה של התרביות שנזרעו בנקודות היא באמצעות בדיקת נקודת סוף (endpoint assay), הכוללת הערכה של היווצרות מושבות מקומטות בנקודת זמן שנקבעה מראש לאחר הזריעה. זוהי תוצאה מייצגת מבדיקת נקודת סוף שבה הוערכה היווצרות של מושבות מקומטות. 40 שעות לאחר הזריעה, מוצג מצד שמאל זן של Vibrio FII שאינו יוצר ביופילם, ומצד ימין מוצג זן יוצר ביופילם.בדיקת נקודת הסיום (endpoint assay) שימושית עבור זנים המראים, או שצפויים להראות, פגמים חמורים ביצירת ביופילם. בדיקה נוספת להערכת מורפולוגיית מושבות היא בדיקת מהלך זמן (time course assay), שבה מעריכים את יצירת מושבות מקומטות לאורך פרק זמן לאחר הנקוטה (spotting), כדי לעקוב בקלות אחר הזמן שחלף מהנקוטה. כווןו טיימר לספירה מעלה.בהדגמה זו, המורפולוגיה של הכתם הגדל תנוטר מדי שעה, החל מ-12 עד 15 שעות לאחר הזריעה, באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting scope) עם התקן מצלמה, רכישת תמונות וניתוח תמונות. תוכנות מחשב משמשות לצפייה ותיעוד של מורפולוגיית המושבות ולהערכת התחלה והתקדמות של היווצרות מושבות מקומטות. לפני הדמיית תרביות שנזרעו בכתמים, מכסה פטרי ההגדלה מוסר בדרך כלל כדי לאפשר קבלת התמונה הברורה ביותר.כאן, הנקודות מוארות מלמטה דרך במה זכוכית שקופה באמצעות מקור אור קר, בעוד התמונות נלכדות מלמעלה. הגדרה זו היא האופטימלית לדימוי של התפתחות מושבות מקומטות, מכיוון שמושבות של Vibrio fischeri הן שקופות למחצה. כדי להמחיש באופן מיטבי את התפתחות המושבות המקומטות, התאימו הן את עוצמת התאורה והן את זווית ההחזרה מתחת למושבות החיידקיות, כך שניתן יהיה להבחין במורפולוגיה התלת-ממדית של הביופילמים המתפתחים.קבעו את תנאי התאורה האופטימליים המספקים את הניגודיות החזקה ביותר בין המושבה המנוקדת לבין רקע האגר שמסביבה. חשוב להשתמש באותה הגדלה בעת איסוף התמונות לאורך כל הניסוי באמצעות המנוף הממוקם בחלק האחורי של המצלמה; העבירו את התצוגה מעדשת המיקרוסקופ למסך המחשב, כווןנו את התצוגה, בצעו פוקוס בהתאם, ואז צלמו את התמונה. צלמו תמונות מתאימות לתיעוד תחילת ההיווצרות וההתפתחות של המושבה המקמטת. הניסוי מסתיים כאשר אין התפתחות נוספת של הביופילם.בסיום הניסויים שנערכו, התמונות מאוחדות לכדי דמויות כדי להמחיש את התפתחות התבניות לאורך זמן עבור כל זן או תנאי. שימו לב לכמה זמן חולף מרגע ההחדרה ועד לזמן שבו מתחילה היצירה של מושבות מקומטות; תחילת היצירה של מושבות מקומטות מוגדרת כנקודת הזמן שבה היווצרות התבניות והמבנים התלת-ממדיים ניכרת לראשונה. בדוגמה זו, התחלת היווצרות הביופילם ניכרת לאחר 12 שעות עבור זן בקרה בעל יכולת יצירת ביופילם של Vibrio FII, המוצג בפנל העליון.בפאנל התחתון, תמונות מייצגות של זן מוטנטי של Vibrio FII המראה עיכוב של ארבע שעות בתחילת היווצרות מושבות מקומטות לאורך זמן, כאשר היווצרות הביופילם מתחילה 16 שעות לאחר ההזרקה. שימו לב כי בעוד שנצפות הבדלים דקים בין זנים אלו בנקודות זמן מוקדמות יותר ב-40 שעות, הזנים נראים דומים בעוצמה ובדפוס של היווצרות הביופילם בכל נקודת זמן לאחר תחילת היווצרות המושבות המקומטות. יש לשים לב לדפוס ההתפתחות של המושבות המקומטות.המבנה עשוי להתפתח מהחוץ פנימה כפי שמוצג בלוח A, או שהוא עשוי להתפתח מהפנים החוצה כפי שמוצג בלוח B. הערכה זו מספקת מנגנון להבחנה בין ביופילמים שנוצרו על ידי זנים שונים או תחת תנאים שונים. מדד חצי-כמותי שני של יצירת ביופילם נעזר בשינוי קוטר המושבה של המושבה המתפתחת לאורך זמן. כפי שמוצג בלוח העליון, זן בעל יכולת יצירת ביופילם מייצג יוצר מושבות שמורכבותן וקוטרן עולות.לעומת זאת, זן אחר המוצג בפאנל התחתון אינו יוצר ביופילמים. לבסוף, איור זה מציג ייצוג גרפי של העלייה בקוטר המושבה לאורך זמן. עבור שני הזנים הללו, הזן בעל היכולת ליצור ביופילם מיוצג על ידי עיגולים לבנים.בעוד שהזן שאינו יוצר ביופילמים מיוצג על ידי ריבועים שחורים. ניתוח זה גילה כי גודלן של מושבות המסוגלות ליצור ביופילם גדל בקצב מהיר יותר מאשר המושבות השליליות לביופילם, ובנקודת הזמן הסופית, ההבדל ביניהן היה כמעט פי שניים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להטמיע בזהירות כל זן ולתעד את תחילת היווצרות המושבות המקומטות עבור כל זן.בהמשך לפרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקת iCal או צביעה רחבה של הגבישים (crystal wide staining) כדי לענות על שאלות נוספות לגבי התהליכים המעורבים ויצירת הביופילם.

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Assay מתאר אמצעי מהיר למדוד היווצרות biofilm מוקדם חיידקים ופטריות. שיטה זו משתמשת צלחת microtiter כמו לתשתית להיווצרות חיידקים biofilm ו biofilm היא דמיינו באמצעות סגול זן קריסטל. Assay מספק גם assay איכותי או כמותי ליצירת biofilm מוקדם.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

מאמר זה מתאר את הליך הקמת ויזואליזציה של biofilm חיידקי גדל בתוך שקופית 8-גם...

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

מקור: Bucher, T., ואחרים, מתודולוגיות לחקר Biofilms של B. subtilis כמודל לאפיון מעכבי ביופילם של מולקולות קטנות. J. Vis. Exp.(2016)הסרטון הזה מדגים את הכנת מושבות ביופילם חיידקיות בוגרות להדמיה ברזולוציה גבוהה. הוא עוסק בשלבי קיבוע, ייבוש, התקנה וציפוי מתכת לשימור והדגשת מורפולוגיית ביופילם.

הכנת מושבות ביופילם חיידקיות לניתוח מורפולוגי

הסרטון מדגים בדיקת היצמדות בשלב מוצק להערכת היווצרות ביופילם. בצלחת מרובת בארות, חיידקים במדיה בתוספת מלח מרה נצמדים למשטחים מוצקים, ויוצרים ביופילמים, אשר אושרו על ידי קולורימטריה באמצעות צביעה סגולה קריסטלית וטיפול באתנול.

בדיקת היצמדות לשלב מוצק להערכת היווצרות ביופילם

מוצג פרוטוקול לכימות והשוואה בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. המתודולוגיה כוללת שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, תוכנת ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם ותוכנת ניתוח סטטיסטי.

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

מחקר זה מציג את הפיתוח של מתודולוגיות הניתנות לשחזור לחקר מעכבי ביופילם והשפעותיהם על Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

אנו מתארים קיבעון, פרפין הטבעה וטכניקות דק אופטים עבור biofilms מושבת חיידקים. בדגימות מוכן, דפוסי ביטוי בתיוג וכתבת biofilm ניתן לאבחן באמצעות מיקרוסקופ.

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

פרוטוקול זה מתאר את הכנת החיסון, כימות הביופילם על לוחות מיקרוטיטר באמצעות צבע סגול גבישי, הספירה בת קיימא בביופילמים והדמיה של ביופילמים של אסינטובקטר.

אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מודולרי מסוג BSL-2 המשלב בדיקות ביומסה קריסטל-סגולה, קינטיקת פאזה-ניגודיות טיים-לאפס, מיפוי קונפוקלי תלת-ממדי/מטריצות, מבנה SEM אולטרה-סטרוקטיבי, ומודול זיהום אוגר ב-vivo לטיפוח, כמות, אפיון וחקר תפקיד פונקציונלי של ביופילם לפטוספירה , ומאפשר הערכה סטנדרטית של מוטנטים והתערבויות אנטי-ביופילם במעבדות.

תהליך עבודה מודולרי לניתוח כמותי, מבני ופונקציונלי של ביופילמים של לפטוספירה

למדו שיטה חצי כמותית להערכת גיבוש biofilm בחיידקים באמצעות מיקרוסקופ ניתוח ומעקב אחר התפתחות מושבות מקומטות לאורך זמן. השיטה מאפשרת השוואה בין זנים שונים.

גישה חצי כמותי להערכת גיבוש biofilm באמצעות פיתוח המושבה מקומט

גלה סרטונים נוספים