Name: מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: למדו למדוד קינטיקה והתקדמות מחזור תאים באמצעות סימון מטבולי BrdU וציטומטריית זרימה. שיטה זו מונעת נזק DNA שאינו ספציפי ומאפשרת מעקב בזמן אמת אחר שלבי מחזור התא בלי סינכרון כימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אנדי ג&#39;ונסון של מרכז מחקר ביו רפואית UBC לקבלת סיוע בניתוח FACS. לחקר הסרטן הגיוס וונג מעבדה ניתן על ידי האגודה למלחמה בסרטן הקנדית Research Institute (ההפעלה מענק # 019250) ומ מהשקעה קרנות מחקר של הפקולטה למדעי התרופות, UBC. JMYW נתמך על ידי הכיסאות מחקר בקנדה סמית מיכאל קרן לקריירה בריאות תוכניות מחקר ופיתוח.

1. תא הכנה <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="איור 0" /> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הצלחת להשיג צפיפות של כ 60% confluency. התאים חייבים להיות בשלב יומן בעת ​​האיסוף. עבור mcf7 תאים, עושים זאת על ידי זריעה על 5 x 10 תאים 5/10 ס&quot;מ צלחת באמצעי התקשורת המתאימים. HT29 ו LS180 תאים זרע לאחר 6 x 10 תאים 5/6 צלחת ס&quot;מ. השתמשנו DMEM התקשורת השלימו עם 10% FBS ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין. הקפד צלחות זרע שולטת חיוביות ושליליות הנכונותבנוסף דגימות הבדיקה שלך. הם כוללים: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אני </td><td> בקרה חיובית </td><td> BrdU בלבד </td></tr><tr><td> ב </td><td> בקרה חיובית </td><td> לצרכן בלבד </td></tr><tr><td> ג </td><td> בקרה שלילית </td><td> BrdU שלילית, PI שלילית </td></tr></tbody></table> (יש לציין כי ניסוי ראשוני עם timepoints מרובים כמו זה שמתואר בפרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לצמצם את מסגרת הזמן שבו לבצע את האוספים הבאים.) <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מצופה מודגרת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 של 24-48 שעות, ובכך לאפשר לתאים להתאושש לצרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדופק תאים תווית עם bromodeoxyuridine (BrdU), DMEM מוחלף Wiהתקשורת טריים המכילים 10 מיקרומטר ה BrdU. תאים מודגרת עבור 1 H ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, כדי לאפשר שילוב BrdU לתוך ה-DNA. הקפד להשאיר צלחת 1 מטופל לשמש בקרת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדופק תיוג התקשורת מוסר לבין תאים שטף בקצרה עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת הצמיחה טריים נוסף (מינוס BrdU) ותאי מותר להמשיך לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד timepoint מתאים קצירת הוא הגיע. </li></ol> 2. קציר קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתאים שלא טופלו משלב 1.3 נחשבים timepoint אפס. מדגם זה ניתן לקצור יחד עם 1 H timepoint אשר נאסף מיד לאחר הטיפול BrdU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור את התאים, מדיה מוסר והצלחות הם שטף פעם אחת עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים trypsinized, אסף בתקשורת culturing ו pelleted לאחר מכן על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 1500 עבור 5 דקות סופernatant נמחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף 1-10 x 10 6 תאים 5 מ&quot;ל קרח קר 1X PBS. סרכזת בסל&quot;ד 1500 עבור Supernatant 5 דקות נמחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא גלולה הוא resuspended אז μl 100 של קר כקרח PBS / 1% FBS. תוספת של 1% FBS PBS מסייע במניעת clumping התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה תאים אלה על ידי ירידה של 5 מ&quot;ל ל -20 ° C, 70% אתנול לתקן את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על קרח למשך 30 דקות או בחנות ב 4 ° C למשך הלילה. זהו צעד אידיאלי שבו להפסיק איסוף דגימות מן timepoints שונים. דוגמאות ניתן להשאיר באתנול במשך כמה ימים, ולאפשר להם להיות מעובד בו זמנית באמצעות יתרת לפרוטוקול. </li></ol> 3. BrdU ו PI מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה 5 דקות בסל&quot;ד 1500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע, אבל להשאיר ~ 50 μl בו כדי לשחרר את הכדור על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפגל את ה-DNA, לאט להוסיף 1 מ&quot;ל של HCL 2N / טריטון X-100dropwise תוך vortexing. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה דגימות 5 דקות בסל&quot;ד 1500. Aspirate וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 1 מ&quot;ל של 0.1M נתרן tetraborate, pH 8.5, לנטרל את הצעד denaturation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת תאים 5 דקות בסל&quot;ד 1500. Aspirate וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב μl 75 תמהיל מכתים BrdU (50 0.5% μl tween 20/1% BSA / PBS + 20 μl FITC מצומדות נגד BrdU + 5 μl 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNase). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים גלולה, צנטריפוגות מדגמים דקות 5 בסל&quot;ד 1500. Aspirate וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​propidium יודיד. </li></ol> 4. תזרים Cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את התאים, cytometer זרימת מצויד לייזר 488 ננומטרמסננים מתאימים הוא הכרחי. תוכנת ניתוח כגון CellQuest יש ליצור החלקות המפורטות להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר פועל באמצעות מדגם cytometer את זרימת, ליצור פיזור קדימה (SSC-H) לעומת הצד פיזור (FSC-H) העלילה כדי להבטיח את התפלגות גודל תקין של התאים (איור 1 א). שני פרמטרים אלה נרשמות על בקנה מידה ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל להצגת חלקת FL3-H (PI כתם) לעומת fl2-W (1B איור). עלילה זו משמשת ליצירת השער (R3) כדי לבודד את החלק היחסי של תאים הנמצאים בתוך דפוס ההתפלגות הנורמלית של מחזור התא. באופן כללי, דפוס זה מאופיין על ידי חלוקת שני אשכולות של תאים מתוכן את ה-DNA של 2N ו 4n מכתים לצרכן מייצג את ה-G1 ו G2 של שלבי מחזור התא, בהתאמה. שורה של תאים הממוקמים בין 2 קבוצות הוא נציג של שכפול ה-DNA מתמשכת המתרחשת בשלב S של מחזור התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור displayi העלילהng התאים סגורות (R3) של 4.3 צעד, עם FL1-H (FITC, העלילה יומן) על ציר y ו - PI (העלילה ליניארי) על ציר x (איור 1 ג). העלילה זה ישמש כדי לקבוע את הפרמטרים הנותרים באמצעות הפקדים השונים המתוארים 1.1, וכן כדי לאסוף נתונים לצורך ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את PI רק דגימה מוכתמת על cytometer. התאם רווח להציב G1 ב ~ 200 על ציר ה-x. זה יהיה קל יותר לדמיין בעלילה היסטוגרמה של PI הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פקד 2 כרוך פועל מדגם BrdU בלבד על cytometer את הזרימה. התאם רווח כך 2 אוכלוסיות של תאים (BrdU חיובית לעומת BrdU שלילי) נראה על המגרש. באופן אידיאלי, התאים BrdU שליליות ממוקמים להופיע מתחת 10 -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השליטה הסופית היא מדגם BrdU / PI שלילית. הפעל בקרה שלילית על מנת להבטיח כי התאים אינם מופיעים בכל אחד הרביעים העליונה או ימינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים של החלקות השונות נקבעו,cytometer הזרימה הוא מכויל ומוכן לעיבוד של תאים BrdU ו PI מוכתמים. מינימום של 10,000 תאים הנמצאים מגודרת בשבריר לצרכן הנכון (מתייחס לשלב 4.3) יש לקרוא לכל אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את הנתונים שנאספו, תוכנה כגון FlowJo או FacsDiva מנוצלים. כל החלקות הנ&quot;ל ניתן ליצור מחדש בתוכניות אלה וניתוח כמותי סטטיסטי ביצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודת הסיום של ניתוח כולל כמה שלבים רצופים. יצירת חלקת FITC לעומת PI עם תאים סגורות כמו PI חיובית העלילה לצרכן לעומת fl2-W מאפשר להבחין בין האוכלוסייה רכיבה על אופניים. שער 2 נוצרת העלילה זה על ידי בידוד האוכלוסייה BrdU חיובית. להביע את האוכלוסייה הייחודי על מגרש היסטוגרמה עם PI על ציר ה-x מאפשר לעקוב אחר מהלך הזמן של התקדמות מחזור התא. זה יכול להיות דמיינו עוד יותר על ידי מתכנן מספר BrdU חיובי תאים עם G1 או תוכן G2 כפונקציה של הזמן. </li></ol> 5. נציג תוצאות בדרך כלל תאים אופניים מוכתמים יודיד propidium יש שיאים שונים ב G1 ו G2, המתאימים תאים המכילים תוכן DNA 2N ו 4n, בהתאמה (איור 2). הדופק סימון BrdU מאפשר תיוג סלקטיבית של אוכלוסיית משנה של תאים באופן פעיל סינתזה DNA (שלב S IE). זמן קצר לאחר הסרת מגיב BrdU, כל התאים המסומנים נמצאים בשלב S (איור 3). על ידי הגבלת תיוג לדופק קצר אחד הוא מסוגל לעקוב אחרי זה ברור עכשיו תת אוכלוסיה של תאים בכל נקודות זמן רב כשהם עוברים דרך השלבים הבאים של מחזור התא. זה יכול להיות דמיינו בנקודה H 1 זמן באיור 3 כחוסר הברור של ה-G1 ו G2 פסגות. מידע נוסף ניתן להסיק בשלב תיוג BrdU. לא רק יכול חלקם של התאים המתחלקים באופן פעיל להימדד, אבל ESTimate ההפצה מחזור התא בשלב בין שתי דגימות ניתן לקבוע גם כן. על ידי איסוף תאים במרווחים גדולים לא פחות לאחר הסרת מגיב BrdU, ניתן לאתר תאים כאשר הם ממשיכים בהתקדמות מחזור, כדי G2, ובסופו של דבר לעבור כדי חלוקת התא של התאים המקוריים, סוף סוף מתעוררים כמו BrdU חיובי לתאי הבת עם G1 ה-DNA תוכן (איור 4). דוגמה כימות מחזור התא בשלב וניתוח הקינטית ניתן באיור 5. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 (א) פיזור קדימה לעומת פיזור מגרש הצד של האוכלוסייה mcf7 נציג התא. (ב) לצרכן לעומת רוחב (FL-W) מגרש של האוכלוסייה mcf7 נציג התא. Gating מוצג להוציא כפילויות התא בסופו של דבר (R3). כפילויות התא יהיה רוחב הדופק עולה על תא בודד, כפי שהם דורשים זמן רב יותר לעבור דרך קרן לייזר ו therefעפרות ניתן לשלול מן הניתוח. (ג) PI לעומת FITC (BrdU) מגרש של האוכלוסייה mcf7 נציג התא. Gating מוצג לכלול רק את (BrdU) תאים FITC חיוביות (R4). <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. היסטוגרמה נציג חלקת אוכלוסייה של תאים בדרך כלל אופניים. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. העלילה היסטוגרמה של התאים שנאספו 1h לאחר הסרת הדופק BrdU, לאחר gating עבור FITC (BrdU) חיובי תאים. BrdU חיובי תאים ב timepoint מוקדם לאחר הסרת התווית הצגת פרופילים לצרכן המתאימים דגימות DNA המציגים תוכן בקנה אחד עם תאים הנמצאים בשלב-S של מחזור התא, המאשר תיוג מוצלח של תאים רק במהלך סינתזת ה-DNA. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" a<html> LT = &quot;איור 4&quot; /&gt; איור 4. השוואה של מחזור התא קינטיקה התקדמות בין שורות תאים סרטניים, סרטן המעי הגס HT29 (א) ו LS180 (ב &#39;), כמו גם סרטן השד mcf7 (C). תאים נאספו כל שעה במשך 8 שעות, בעקבות הסרת הדופק BrdU. בניסוי זה, צפינו על פרופיל ברור של התפתחות תאים מואצת לעבור שלב G2 של מחזור התא LS180 תא המעי הגס קו. השוואת קינטיקה בין שני פרופילים של תאים סרטן המעי הגס, הופעת שיא G1 ניכר ב ט = 4H שלאחר BrdU ב LS180 תאים, לעומת נקודת הזמן המתאימה לקו HT-29 בתא שבו אין זה השיא. בהשוואה בין אחת משתי שורות תאים המעי הגס, mcf7 תאים רכיבה על אופניים בקצב משמעותי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <html> מחדש 5 &quot;/&gt; איור 5 (א) תא כמותי מחזור שלב ניתוח BrdU, שכותרתו תאים סרטניים. האלגוריתם דין / ג&#39;ט / פוקס היה מוחל על HT29, LS180 ו mcf7 (מאויר בירוק). מחזור וכתוצאה מכך על תאים בשלב הפצות מכל מדגם מבוטאות% מסך BrdU חיובי תאים עבור כל שלב. רק לבחור נקודות זמנים לקו כל תא מוצגים, כמו ניתוחים של כמה נקודות זמן קודמות הניבו תוצאות לא חוקיים. אלה נקודות הזמן קודמות, כל BrdU חיובי תאים הם בשלב-S ולכן אין G1 ברורים פסגות G2, אשר נחוצים יישום אלגוריתם. (ב) Histograms של תאים סרטניים מראה את הקינטיקה של התקדמות דרך G2 / M שלבי מחזור התא. התקדמות דרך G2 / M שלבים הוא המהיר ביותר LS180 התאים, ואחריו HT29 ו mcf7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <html> &quot;alt =&quot; jpg איור S1 &quot;/&gt; איור S1. Cytometry בקרות זרימה. mcf7 תאים מוצגים הביקורת (A) שלילי שבו התאים הם לא לצרכן ולא מוכתם BrdU. (ב) לצרכן מוכתם בלבד. (ג) BrdU-FITC שכותרתו דגימות. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="להבין S2" /> איור איור S2. סכמטי המציג את הקשר בין ספקטרום פליטה הניאון של PI לעומת FITC (BrdU). החלונות איסוף ספקטרליים עבור ערוץ ניאון 1 (FL1, עבור FITC) וערוץ ניאון 3 (FL3, עבור PI) מוצגים בתיבות המתאימות. אין חפיפה בין ספקטרום fluorophore FL1 ו FL3 זיהוי. ככל הנראה, פיצוי הקרינה אינו הכרחי כאשר נתוני הניסוי של PI ו FITC-BrdU שיתוף שכותרתו התאים נאספים על FL1/FL3 ערוצי בהתאמה. ספקטרום הקרינה התקבלו באתר BioSciences BD:target = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> .

<ol><li>Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+D+as+a+therapeutic+target+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cyclin D as a therapeutic target in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).</li>
<li>Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+is+balancing+development%2C+differentiation+and+de-differentiation+to+assure+cancer+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention.</a> Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).</li>
<li>Dickson, M. A., Schwartz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-cycle+inhibitors+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy.</a> Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).</li>
<li>van Opstal, A., Boonstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+phosphatidylinositol+3-kinase+activity+prevent+cell+cycle+progression+and+induce+apoptosis+at+the+M%2FG1+transition+in+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).</li>
<li>Gasnereau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+to+sort+mammalian+cells+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis.</a> Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).</li>
<li>Harper, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+cell+populations+in+G1%2FS+and+G2%2FM+phases+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle.</a> Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).</li>
<li>Pedrali-Noy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+HeLa+cell+cultures+by+inhibition+of+DNA+polymerase+alpha+with+aphidicolin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin.</a> Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).</li>
<li>Merrill, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization.</a> Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).</li>
<li>Fleisig, H. B., Wong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+promotes+efficient+cell+cycle+kinetics+and+confers+growth+advantage+to+telomerase-negative+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells.</a> Oncogene. , (2011).</li>
<li>Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZ703%2C+an+imidazo%5B1%2C2-a%5Dpyridine+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1+and+2%2C+induces+E2F-1-dependent+apoptosis+enhanced+by+depletion+of+cyclin-dependent+kinase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9.</a> Cancer Res. 66, 435-444 (2006).</li>
<li>Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell cycle by flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).</li>
<li>Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

על ידי שילוב של cytometry זרימה עם שילוב BrdU, יש לנו את הכלים הדרושים כדי ללמוד קינטיקה מחזור התא. המאפיין הייחודי של BrdU לתפקד אנלוגי תימידין מה מאפשרת כימות DNA תוכן התא רכיבה על אופניים. שילוב של BrdU לתוך גדיל DNA צומח הבת בשלב הסינתזה של מחזור התא היא מה מאפשר לעקוב subpopulation של תאים אופניים באמצעות שכפול של דנ&quot;א בשלב S, לתקופה של צמיחה ב G2, ובסופו של דבר חלוקת התא . הבת BrdU חיובי תאים ניתן בעקבות ברציפות עד אשר נקודת זמן את התווית BrdU מדוללת על ידי חלוקת התא במ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> bromodeoxyuridine </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> propidium יודיד </td><td> סיגמא </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml המניות </td></tr><tr><td> FITC נגד BrdU </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן tetraborate </td><td> דיג </td><td> S80172 </td><td> 0.1M, pH 8.5 </td></tr><tr><td> FACS קליבר </td><td> בקטון דיקינסון </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

בקרה מדויקת על תחילתו ועל התקדמותו העוקבת של מחזור התא דרך השלבים השונים היא בעלת חשיבות עליונה בתאים מתחלקים. חלוקת מחזור התא היא חלק בלתי נפרד מהצמיחה והרבייה, ושיבושים ברגולציה של רכיבי מפתח במחזור התא נקשרו לאירועים המזרזים קרצינוגנזה 1,2. סוכנים מולקולריים בטיפולים נגד סרטן פועלים לעיתים קרובות על מסלולים ביולוגיים האחראים לוויסות ולתיאום של חלוקת מחזור התא 3. למרות שקינטיקת מחזור התא נוטה להשתנות בהתאם לסוג התא, התפלגות התאים בין ארבעת שלבי מחזור התא היא עקבית למדי בקו תאים מסוים, וזאת בשל דפוס עקבי של ביטוי מיטוגנים וגורמי גדילה. אירועים גנוטוקסיים ומגאיצים תאיים אחרים עלולים להוביל לחסימה זמנית של התקדמות מחזור התא, מה שגורם למעצר או להפסקה זמנית בשלב מסוים של מחזור התא כדי לאפשר הפעלה של מנגנון התגובה המתאים.
היכולת לצפות באופן ניסיוני בהתנהגותה של אוכלוסיית תאים ביחס לשלב ההתקדמות שלהם במחזור התא מהווה התקדמות חשובה בביולוגיה של התא. נהלי עבודה נפוצים, כגון mitotic shake off, צנטריפוגה דיפרנציאלית או מיון מבוסס ציטומטריה של זרימה (flow cytometry), משמשים לבידוד תאים בשלבים ספציפיים של מחזור התא 4-6. אוכלוסיות אלו, המועשרות בשלב מסוים של מחזור התא לאחר הפרדה, מוכרעות לאחר מכן לטיפולים ניסיוניים. לעיתים קרובות, התנובה, הטוהר והחיוניות של הפראקציות המופרדות עלולות להיפגע בשימוש בשיטות הפרדה פיזיות אלו. כמו כן, פרק הזמן שחולף בין הפרדת אוכלוסיות התאים לבין תחילת הטיפול הניסיוני, במהלכו עלולים התאים המופרדים להתקדם מהשלב הנבחר במחזור התא, עלול להציב אתגרים משמעותיים בביצוע ובפירוש מוצלחים של ניסויים אלו.
גישות אחרות לחקר שלבי מחזור השטח כוללות שימוש בחומרים כימיים לסנכרון תאים. טיפול בתאים עם מעכבים כימיים של תהליכים מטבוליים מרכזיים עבור כל שלב במחזור התא הוא יעיל בחסימת ההתקדמות של מחזור התא לשלב הבא. לדוגמה, hydroxyurea, מעכב של ribonucleotide reductase, עוצר תאים בנקודת המפגש G1/S על ידי הגבלת אספקת ה-deoxynucleotides, אבני הבניין של ה-DNA. חומרים כימיים בולטים אחרים כוללים טיפול ב-aphidicolin, מעכב polymerase alpha לעצירה ב-G1, טיפול ב-colchicine וב-nocodazole, ששניהם מפריעים להיווצרות כישורי המיטוזה כדי לעצור תאים בשלב M, ולבסוף, טיפול ב-5-fluorodeoxyridine, מסיימ דשראות DNA, כדי להשריש עצירה בשלב S 7-9. טיפול בחומרים כימיים אלו הוא אמצעי יעיל לסנכרון של אוכלוסייה שלמה של תאים בשלב מסוים. עם הסרת החומר הכימי, התאים חוזרים למחזור התא באופן אחיד. מתן החומר הנבדק לאחר השחרור מהחומר הכימי החוסם את מחזור התא מבטיח שהתגובה לתרופה תהיה מאוכלוסייה אחידה וספציפית לשלב במחזור התא. עם זאת, מכיוון שרבים מהמסנכרנים הכימיים הם תרכובות גנוטוקסיות ידועות, הפרדה בין מעורבותם של מסלולי תגובה שונים (למסנכרנים לעומת החומרים הנבדקים) היא מאתגרת.
כאן אנו מתארים שיטת סימון מטבולי למעקב אחר תת-אוכלוסייה של תאים במחזור פעיל, החל משלב השכפול של ה-DNA ועד לחלוקה ולהפרדה של תאי הבת. בשילוב עם כימות באמצעות ציטומטריית זרימה, פרוטוקול זה מאפשר מדידה של ההתקדמות הקינטית של מחזור התא בהיעדר מאמצים תאיים מושריים מכנית או כימית, הנפוצים בשיטות אחרות לסנכרון מחזור התא 10. בסעיפים הבאים נדון במתודולוגיה, כמו גם בחלק מהיישומים שלה במחקר ביו-רפואי.

שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ&quot;א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כניסתה של נזק שאינו ספציפי בדנ&quot;א, אשר בתורו משפיע על התקדמות מחזור התא.

בקרה מדויקת של הפנייה (initiation) וההתקדמות העוקבת דרך השלבים השונים של מחזור התא היא בעלת חשיבות עליונה בתאים מתחלקים...

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא למדוד את הקינטיקה וההתקדמות של מחזור התא. ראשית, התאים מסומנים בשיטת pulse-chase באמצעות romo, deoxy, uridine או BRDU, אשר נטמעים ב-DNA של התא במקום תימידין. לאחר מכן, התאים עוברים צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדנים נגד BRDU ומנותחים באמצעות ציטומטריה זרימתית מיד לאחר הצביעה.רק תאים בשלב S מסומנים, כאשר התאים המסומנים מתקדמים במחזור התא לשלב G2. הם מזוהים כבעלי תכולת DNA של 4N לאחר המיטוזה. תכולת ה-DNA פוחתת ל-2N. לפיכך, ניתן להשתמש בניתוח של פרופילי הפלואורסצנציה שהופקו באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את קינטיקת ההתקדמות של מחזור התא.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים אחרים המשתמשים בחומרים כימיים לסנכרון תאים הוא היעדר הפרעות פיזיולוגיות שעלולות להשפיע בטעות על מנגנון חלוקת התא. השתמשנו בשיטה זו לראשונה כאשר ניסיונותינו לחקור את קצב התקדמות מחזור התא באמצעות סנכרון כימי הניבו תוצאות בלתי צפויות שהפריעו לניתוח שלנו. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא.למשל, מהי הבסיס לקצבי גדילה דיפרנציאליים בין סוגי תאים שונים? כדי לבחון זאת, התחילו את הפרוטוקול בסימון Pulse-Chase של התאים באמצעות BRDU. התחילו בסימון של צלחת אחת בקוטר 10 סנטימטר עבור כל נקודת זמן, בתוספת צלחת אחת עבור כל אחת מבקרות האיכות הבאות.BRDU בלבד,

measuring-cell-cycle-progression-kinetics-with-metabolic-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

שימוש מוצלח של צבעי מעקב סלולרי כדי לעקוב אחר תפקוד תא חיסוני והתפשטות כרוכה במספר שלבים קריטיים. אנו מתארים שיטות ל: 1) קבלת תווית-ing הבהיר והאחיד, לשחזור קרום עם צבעים: 2) בחירת תנאי נתוני רכישת fluorochromes ו; ו3) בחירת מודל לכמת התפשטות תאים על בסיס דילול צבע.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

הסרטון מתאר את בדיקת סימון הדופק המדורגת של תאי יונקים עם ברומודוקסיורידין (BrdU) למדידת התפשטות תאים. ספיגת BrdU מאפשרת מעקב זמני אחר תאים שהיו בשלב הסינתזה בנקודת זמן מסוימת, ללא צורך בסנכרון התאים.

בדיקת תיוג דופק Bromodeoxyuridine: טכניקה למדידת התפשטות תאים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בbromodeoxyuridine ספיגה (BrdU) כדי לאפשר המעקב הזמני של תאים שהיו בשלב S בנקודה מסוימת בזמן. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדן מאפשרת ניתוח מפורט של גורלם של התאים בשלב S בתקופות מאוחרות יותר.

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

כאן, אנו מתארים כיצד לחקור לוקליזציה מיטוכונדריאלית של קינאז (מחזור התא), וכיצד לקבוע את מיקומו התת-מיטוכונדריאלי כמו גם מצעים/מטרות מיטוכונדריאליות פוטנציאליות. ביטוי מאולץ של חלבונים למיטוכונדריה מספק כלי שימושי לחקר ההשלכות התפקודיות של לוקליזציה מיטוכונדריאלית של חלבון מעניין.

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

השיטה המוצגת משלבת את הניתוח הכמותי של מעברי ה-DNA כפול סטרנד (DSBs), מחזור התא הפצה ו אפופטוזיס כדי לאפשר מחזור התא הערכה ספציפית של האינדוקציה DSBS ותיקון, כמו גם את ההשלכות של כשל בתיקון.

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית ​​יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית ​​שכותרתו עם צבע אדום ניאון FM 4-64 למדוד את קצב שחרור שלפוחית ​​presynaptic בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת כפולה GloTM Assay בלוציפראז מ Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

למדו למדוד קינטיקה והתקדמות מחזור תאים באמצעות סימון מטבולי BrdU וציטומטריית זרימה. שיטה זו מונעת נזק DNA שאינו ספציפי ומאפשרת מעקב בזמן אמת אחר שלבי מחזור התא בלי סינכרון כימי.

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

גלה סרטונים נוספים