מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה
22 במאי 2012
שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ"א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כניסתה של נזק שאינו ספציפי בדנ"א, אשר בתורו משפיע על התקדמות מחזור התא.
המטרה הכוללת של הפרוצדורה הבאה היא למדוד את הקינטיקה וההתקדמות של מחזור התא. ראשית, תאים מסומנים בשיטת pulse chase באמצעות romo, deoxy, uridine או BRDU, אשר נטמעים ב-DNA של התא במקום תימידין. לאחר מכן, התאים עוברים צביעה אימונוציטוכימית באמצעות נוגדנים נגד BRDU ומנותחים בשיטת ציטומטריית זרימה מיד לאחר הצביעה.
רק תאים בשלב S מסומנים, כאשר התאים המסומנים מתקדמים במחזור התא לשלב G2. הם מזוהים כבעלי תכולת DNA של 4N לאחר המיטוזה. תכולת ה-DNA פוחתת ל-2N. לפיכך, ניתוח של פרופילי הפלואורסצנציה שהופקו באמצעות ציטומטריה זרימה יכול לשמש לקביעת הקינטיקה של ההתקדמות במחזור התא.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים אחרים המשתמשים בחומרים כימיים לסנכרון תאים הוא היעדר הפרעות פיזיולוגיות שעלולות להשפיע בטעות על מנגנון חלוקת התאים. השתמשנו בשיטה זו לראשונה כאשר ניסיונותינו לבחון את קצב התקדמות מחזור התא באמצעות סנכרון כימי הניבו תוצאות בלתי צפויות שהפריעו לניתוח שלנו. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ביולוגיית התא.
לדוגמה, מהו הבסיס להבדלים בשיעורי הצמיחה בין סוגי תאים שונים? כדי לבחון זאת, התחילו את הפרוטוקול בסימון התאים ב-BRDU בשיטת pulse Chase. התחילו בסימון של צלחת אחת של 10 סנטימטר לכל נקודת זמן, בתוספת צלחת אחת לכל אחת מהבקרות הבאות.
BRDU בלבד, PI בלבד, BRDU שלילי, PI שלילי; זרעו בכל צלחת 5×10⁵ תאי MCF-7 ב-DMEM מועשר. הדגרירו את הצלחות למשך 24 עד 48 שעות כדי לאפשר לתאים להתאושש ולהיקשר. ברגע שהתאים הגיעו ל-60% התקהרות (confluency), החליפו את המצע ב-DMEM טרי המכיל 10 µM.
דגרו את התאים עם BRDU למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius ו-5%CO2 כדי לאפשר שילוב של BRDU ב-DNA. הקפידו להשאיר צלחת אחת ללא טיפול שתשמש כביקורת שלילית או כנקודת זמן אפס לאחר שעה אחת. הסירו את מצע סימון הדחף (pulse labeling) ושטפו את התאים בקצרה עם PBS עבור נקודות הזמן של שעתיים עד שמונה שעות.
הוסיפו מצע גידול טרי והחזירו אותן לאנקובטור. לאחר מכן, קצרו באופן מיידי את הצלחות של נקודות הזמן אפס ושעה אחת, כפי שמתואר בסעיף הבא. כדי לקצור את התאים, שאבו את המצע ושטפו את הצלחת.
שטפו פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן השתמשו בטריפסין כדי להפריד את התאים מהפלטה ואספו אותם לתוך DMEM; צנטריגו ב-390 ×g למשך חמש דקות. שפכו את הנוזל העילאי. לאחר מכן, שטפו את התאים ב-1 עד 5 מיליליטר של PBS קר בקרח; צנטריגו ב-390 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסבב, שפכו את הנוזל העילאי והשעיקו מחדש את התאים ב-100 µL של קרח.
PBS קר המכיל 1% FBS. ה-FBS מסייע במניעת התגבשות של תאים. אחד ההיבטים החשובים ביותר של פרוצדורה זו הוא להבטיח קבלת סספנזיה של תאים בודדים מהתאים שנאספו.
עבור העובדות. כדי להשיג זאת, ניתן להוסיף את התאים שלך ישירות לאתנול טיפה אחר טיפה. זהו שלב קריטי. כדי לקבע את התאים, השתמש בפ pipette להוספת התאים בטפטוף לחמישה מיליליטר של קרח.
70% ethanol במבחנה קונית של 15 מיליליטר. הדגרימו את התאים על קרח למשך 30 דקות או אחסנו אותם בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך לילה. זהו שלב אידיאלי לעצירת איסוף הדגימות מנקודות זמן שונות; ניתן להשאיר את הדגימות באתנול למשך מספר ימים, מה שמאפשר לעבד אותן בו-זמנית בהמשך הפרוטוקול לצורך ביצוע צביעה ב-BRDU ובפרופידיום יודיד.
הוצא את התאים מטמפרטורה של 4 °C וסובב אותם בצנטריפוגה במהירות של 90 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסבב, שאב את רוב חומר הקיבוע והשאר כ-50 µL. לאחר מכן, ערבב במכשיר vortex.
כדי לשחרר את המשקע לצורך דנטורציה של ה-DNA תוך כדי ערבוב ב-vortex. יש להוסיף באיטיות ובטפטוף 1 mL של HCL Triton X 100 בריכוז 2N, ולאחר מכן להדגיר את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. יש למשקע את התאים על ידי סבוב של הדגימות בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-390 ×g, ולאחר מכן לשאוב ולהשליך את העלייה.
לאחר מכן, השעו מחדש את משקע התאים ב-1 mL של נתרבית טטרהבוראט 0.1 M. לאחר הצנטריפוגה, שאבו שוב את התאים והשליכו את העלייה. לאחר מכן, השעו מחדש את משקע התאים ב-75 µL של תמיסת צביעה ל-BRDU.
ערבבו ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות, תוך הגנה מאור לאחר הדגירה. השקיעו את התאים על ידי סבוב במערך צנטריפוגלי כפי שבוצע קודם לכן, והשעיקו מחדש את משקע התאים במילליליטר אחד של PBS המכיל חמישה מיקרוגרם למילליליטר של propidium iodide. בעת הרצת הדגימה החיובית ל-PI בציטומטר הזרימה, צרו תרשים של forward scatter לעומת side scatter כדי לוודא את התפלגות הגודל התקינה של התאים.
שני הפרמטרים הללו צריכים להיות מיוצגים בסולם ליניארי. במקביל, יש להציג גרף של FL three H לעומת FL two W כדי לבחון את צביעת ה-PI לעומת רוחב פעימת הפלואורסצנציה. גרף זה משמש ליצירת שער (gate) לצורך בידוד פракציית התאים הנחשבים כנמצאים בתוך דפוס ההתפלגות הנורמלי של מחזור התא.
באופן כללי, תבנית התהודה הזו מאופיינת בשני מקבצי תאים עם תוכן PI של 2N ו-4N, המייצגים את שלבי G1 ו-G2 של מחזור התא, בהתאמה. רצף של תאים הממוקמים בין שני מקבצים אלה מייצג שכפול DNA מתמשך המתרחש בשלב S של מחזור התא. צור גרף המציג את התאים המסומנים (gated) כאשר FL1-H או FITC נמצאים בסולם לוגריתמי בציר Y ו-PI נמצא בסולם ליניארי בציר X.
גרף זה ישמש לקביעת שאר הפרמטרים באמצעות הבקרים השונים וכן לאיסוף נתונים. לצורך הניתוח, מקמו את דגימת הצביעה ב-PI בלבד בפתח הטעינה של ציטומטר הזרימה וכווננו את ההגבר (gain) כך ש-G1 ימוקם בערך ב-200 על ציר ה-x. יהיה קל יותר להמחיש זאת בגרף היסטוגרמה של צביעת ה-PI.
כעת הניחו את דגימת ה-BRDU בלבד בפתח הטעינה והפעילו את המכשיר. כווננו את ההגבר (gain) כך ששתי אוכלוסיות התאים, אלו החיוביים ל-BRDU ואלו השליליים ל-BRDU, יופיעו על התרשים. באופן אידיאלי, התאים השליליים ל-BRDU ממוקמים בדיוק ב-10 to the one או מתחתיו.
בקרת האיכות הסופית היא הדגימה השלילית של BDU/PI. יש להריץ בקרה שלילית זו כדי להבטיח שהתאים אינם מופיעים באף אחד מהרבעונים העליונים או הימניים. לאחר שנקבעו הפרמטרים של הגרפים השונים, ציטומטר הזרימה מכויל ומוכן לעיבוד תאים שצבו ב-BRDU ו-PI. יש לאסוף נתונים ממינימום של 10,000 תאים תחת שער (gate) של PI עבור כל דגימה.
לאחר מכן, באמצעות תוכנה כגון FlowJo או fax diva, צרו גרף של FITC מול PI, כאשר התאים מסננים (gated) כחיוביים ל-PI מתוך גרף ה-PI מול FL two W, כדי להבחין באוכלוסייה הנמצאת במחזור תא. לאחר מכן, צרו שער (gate) שני כדי לבודד את האוכלוסייה החיובית ל-BRDU.
לאחר מכן, כדי לעקוב אחר מהלך הזמן של התקדמות מחזור התא, שרטטו את מספר התאים החיוביים ל-BRDU עם תוכן G1 או G2 כפונקציה של זמן, כדי להשוות את קינטיקת התקדמות מחזור התא בין שני קווי תאי סרטן המעי הגס HT 29 ו-LS 180. התאים נאספו מדי שעה במשך שמונה שעות לאחר הסרת פולס ה-A-B-R-D-U.
בהשוואת הקינטיקה של שני הפרופילים, עולה כי שיא G1 מופיע בנקודת זמן של t שווה ל-ארבע שעות לאחר BRDU בתאי LS 180, בהשוואה לנקודת הזמן המקבילה בשורת התאים HT 29, שבה שיא זה אינו קיים. דבר זה מעיד על התקדמות מואצת של מחזור התא דרך שלב G2 של מחזור התהא. בשורת התאים של סרטן המעי הגס LS 180 כדי ליצור פרופיל מחזור של שורת התאים של סרטן השד.
תאי MC שבע נאספו מדי שעה במשך שמונה שעות, לאחר הסרת דופק ה-BRDU. התאים שעברו סימון אימונולוגי וצביעת DNA נמיינו לאחר מכן על סמך האותים הפלואורסצנטיים שלהם.
כפי שניתן לראות כאן, תאי CF seven עברו מחזור במהירות איטית משמעותית מאשר כל אחד משני קווי תאי סרטן המעי הגס שנבדקו. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו סימון מטבולי של DNA בשילוב עם קציר בנקודות זמן מאפשר לכם לעקוב אחר קינטיקת מחזור התאים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למעקב אחר התקדמות וקינטיקה של מחזור התא באמצעות סימון מטבולי וצביעת DNA. גישה זו מבטלת את הצורך בסנכרון כימי, ובכך מפחיתה את הסיכון לנזק לא ספציפי ל-DNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- ניתוח מחזור התא
- ציטומטריה בזרימה
רקע
- הבנת הדינמיקה של מחזור התא היא חיונית למגוון מחקרים ביולוגיים.
- שיטות מסורתיות עלולות להוות ארטיפקטים עקב סנכרון.
- סימון מטבולי מספק ייצוג מדויק יותר של שלבי מחזור התא.
- ציטומטריה זורמת מאפשרת ניתוח מדויק של תאים מסומנים.
מטרת המחקר
- למדידת קינטיקת התקדמות מחזור התא.
- שימוש בסימון BrdU למעקב אחר סינתזת DNA.
- ניתוח של שלבי מחזור התא ללא סנכרון כימי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון מסוג Pulse-chase באמצעות BrdU או נוקליאוזידים אחרים.
- צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדנים נגד BrdU.
- ניתוח תאי הצביעה באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- גילוי תכולת ה-DNA לזיהוי שלבי מחזור התא.
תוצאות עיקריות
- תאים בשלב S מסומנים ביעילות באמצעות BrdU.
- ציטומטריית זרימה חושפת שינויים בתוכן ה-DNA ככל שהתאים מתקדמים במחזור.
- השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר קינטיקת מחזור התא.
- נזק לא ספציפי ל-DNA ממוזער, דבר המשפר את מהימנות הנתונים.
מסקנות
- השילוב של סימון מטבולי וציטומטריה של זרימה יעיל לחקר דינמיקת מחזור התא.
- גישה זו מספקת תובנות על התקדמות מחזור התא ללא החסרונות של סנכרון כימי.
- יישומים נוספים של שיטה זו עשויים לשפר את הבנתנו את הביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
מדידה מדויקת של קינטיקת התקדמות מחזור התא היא קריטית להפחתת סיכונים בשלבי תיקוף מוקדמים של יעדי אונקולוגיה ולאופטימיזציה של סריקת תרכובות במודלים של מחלות פרוליפרטיביות. סימון מטבולי בשילוב עם ציטומטריה זרימה מאפשרים הערכה כמותית, נטולת ארטיפקטים, של דינמיקת מחזור התא, ובכך תומכים בביטחון ניבוי בחקירת מסלולים ובמחקרים מכניסטיים. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים חסונים וניתנים לשחזור על פרוליפרציה של תאים ותגובה לתרופות, ללא ארטיפקטים של סנכרון המבלבלים את התוצאות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של קינטיקת מחזור התא כדי להבהיר את תפקוד המסלול ואת המעורבות של היעד.
- מפחית עמימות מנגונית על ידי הימנעות מארטיפקטים של סנכרון כימי או מכני.
- תומך בביטחון חיזוי בהערכת שיעורי גדילה דיפרנציאליים בין קווי תאים שונים.
- מסייע בתיקוף תפקודי של יעדים רגולטוריים של מחזור התא במחקר אונקולוגי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק קריאות כמותיות וסטנדרטיות להתבצעות ולהתפלגות של שלבי מחזור התא.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה על ידי מזעור הפרעות פיזיולוגיות במהלך הכנת הדגימות.
- מאפשר סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של השפעות תרכובות על קינטיקת מחזור התא במודלים הרלוונטיים למחלה.
- תומך בזרימות עבודה (workflows) ניתנות להרחבה ומוכנות לפלטפורמה לצורך הערכת תרכובות ומיון מובילים (lead triage).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים בין מדידות קינטיקה של מחזור התא לנקודות קצה של שגשוג (proliferation) הרלוונטיות למחלה.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מעקב אחר השפעות התרופה על התקדמות מחזור התא.
- תומך בקבלת החלטות על קידום הפיתוח בהתאם לסיכון, על בסיס נתונים כמותיים של מחזור התא הספציפיים לשלב.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטית במודלים של אונקולוגיה תרגומית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו של סימון מטבולי וציטומטריה של זרימה משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, והיא תומכת הן בבדיקת היפותזות ראשונית והן באפיון תרכובות בשלבים מאוחרים יותר.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את התקדמות מחזור התא כדי להבהיר את פעילות המסלול ולתקף מטרות.
- סריקה: מספק פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור עבור סריקת תרכובות ופיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מספק נתוני מהלכים של זמן ברזולוציה גבוהה על מעברי שלבי מחזור התא לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין קינטיקה של מחזור התא in vitro לבין נקודות סיום של תגובה לתרופות ופרוליפרציה הרלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית עם מעט ארטיפקטים, הניתנת להתאמה בין קווי תאים ומודלים של מחלות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מחזור התא.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות מחזור התא.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ויעילות הון על ידי אספקת נתונים קינטיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום תוכניות למחלות אונקולוגיות ומחלות פרוליפרטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של ציטומטריה זרימתית וצביעה אימונוהיסטוכימית.
- נדרשת גישה למכשור ציטומטריה זרימתית ולתוכנה אנליטית.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרוטוקולי סימון ו-gating.
- ניתן להתאמה לקווי תאים שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מודלים ספציפיים.
- הכנת הדגימות ודיוק ה-gating הם קריטיים למדידות קינטיות מהימנות.
