ביצית אחת bisulfite mutagenesis

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח מתילציה של DNA בביצית אחת. זה מושג על ידי הסרת תאי קומולוס וסבון פאליטה מביציות שנאספו. השלב השני הוא להטמיע את הביצית בתמיסת aros lysis של שניים לאחד כדי להגן על הכמות הזעירה של ה-DNA מפני אובדן או השפלה.

לאחר מכן מתבצעת מוטגנזה של דו סולפיט, ואחריה הגברה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז מקוננת. השלב האחרון הוא לקשר ולשכפל את מוצר ה-PCR. לאחר מכן, שיבוטים נאספים, מוגברים ב-PCR ונשלחים לריצוף.

בסופו של דבר, מוטגנזה וריצוף של דו סולפיט משמשים להצגת מתילציה של DNA בציטוזין פוספט גין, או דינוקלאוטידים CPG של אזור מעניין בביצית בודדת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מוטגנזה של דו סולפיט של מספרי תאים גדולים, הוא שניתן להשיג נתונים מביצית בודדת ללא איגום ציטים, הטיית PCR וזיהום תאי כימותרפיה. ביום איסוף הביציות, הכינו טרי את הפתרונות המפורטים בפרוטוקול הכתוב בעת הכנת תמיסות, הפחיתו את הסיכוי לזיהום DNA על ידי החלפת כפפות לעתים קרובות ושימוש בקצות סינון גם שומרים על הצינורות בזווית כאשר הם פתוחים ומכסים מחדש את כל הצינורות כאשר אינם בשימוש.

התחל באיסוף OSI על ידי הנחת ביציות העכבר המנותחות לתוך M שתי מדיה וקריעת גלגלת M כדי לחלץ את קומפלקס תאי הקומולוס. לאחר מכן הפרד את הציטים מקומפלקס תאי הקומולוס באמצעות 0.3 מיליגרם למיליליטר של תמיסת היאלורונידאז בטיפה של 30 מיקרוליטר של M שני מדיה. שמור את הציטים בתמיסה רק כל עוד נדרש כדי להסיר את תאי הקומולוס מכיוון שחשיפה ממושכת עלולה לפגוע בהם.

שטפו את הביציות ב-30 טיפות מיקרוליטר של M two מדיה על ידי העברת הביציות מטיפה לטיפה. הסרת תאי הקומולוס מעת לעת בסך הכל שלוש כביסות. הסר את ה-Z של LUCITA באמצעות תמיסת טירו חומצית.

תחילה מניחים את הביציות בטיפת תמיסה אחת של 30 מיקרוליטר, ולאחר מכן מעבירים לטיפה נוספת של 30 מיקרוליטר. כמו כל מדיה שנישאת תדלל את החומצה ותפחית את יעילותה. שמור את הציטים בתמיסה רק כל עוד לוקח להסיר את האזור מכיוון שחשיפה ממושכת עלולה לפגוע בהם.

לאחר הסרת הזונה, שטפו שוב את הציטים בטיפה של 30 מיקרוליטר של M two media כדי לבצע הטמעת אגרוס הנח תחילה את תמיסת הליזיס על גוש חום של 70 מעלות צלזיוס. הוסף את נקודת ההיתוך הנמוכה שחוממה מראש, או LMP Agros לתמיסת הליזיס, ויצר תמיסת AGROS לליזה של שניים לאחד. לאחר מכן הנח ביצית בודדת על שקופית זכוכית נקייה במדיה מינימלית M two.

השלב הבא הוא להטמיע את הציט הבודד בתמיסת Agros ו-lysis. יש לעשות זאת במהירות מכיוון שהאגרוס יתקשה בטמפרטורות מתחת ל-65 מעלות צלזיוס. קח 10 מיקרוליטר מתמיסת הליזה של אגרוס לקצה פיפטה תחת מיקרוסקופ.

הוצא בעדינות כמיקרוליטר אחד או פחות מתמיסת האגרוס ליזה על מגלשת הזכוכית, ואפשר לה להתערבב עם המדיה המינימלית. הרם בעדינות את הביצית לתוך קצה הפיפטה. לאחר מכן הכניסו את כל 10 המיקרוליטרים לצינור איינור עם 300 מיקרוליטר שמן מינרלי כך שהחרוז המתקבל יקבל צורה כדורית.

דגרו את הצינור על קרח למשך 10 דקות לביצוע ליזה. הסר את 300 מיקרוליטר השמן המינרלי והוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הליזיס SDS. דגרו את הדגימה למשך הלילה באמבט מים המוגדר ל-50 מעלות צלזיוס ביום השני.

הכן את פתרונות המוטגנזה של בי סולפיד טריים כמתואר בפרוטוקול הכתוב. התחל מוטגנזה על ידי הסרה מלאה של 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה SDS. זכור כי כל מאגר ליזה שנותר ידלל את האגרוס כאשר הוא מחומם והחרוז יהיה רגיש יותר להתמוססות בשלבים הבאים.

לאחר הסרה מוחלטת של מאגר הליזיס, הוסף 300 מיקרוליטר שמן מינרלי. דגרו את הדגימה למשך שתי דקות וחצי על גוש חום של 90 מעלות צלזיוס. קח קראט כדי לערבב או לערבב, להאריך או לשנות את הטמפרטורה.

אחרי שתיים וחצי דקות. דגרו את הדגימה על קרח למשך 10 דקות. כדי לבצע דנטורציה, הסר את השמן המינרלי והוסף מיליליטר אחד של 0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי לתנועת הצינור והפוך את הצינור חמש עד שש פעמים.

דגרו את הדגימה למשך 15 דקות. באמבט מים המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס המתהפך כל שלוש עד ארבע דקות, החרוז צריך לצוף בנתרן הידרוקסיד. שימו לב שהחרוז כבר לא נמצא בתחתית הצינור.

כדי לבצע טיפול בסולפיט יש לסובב תחילה את הצינור בעדינות לאחר הסרת הנתרן הידרוקסיד. הוסף 300 מיקרוליטר שמן מינרלי ו -500 מיקרוליטר תמיסת BIS sulfite. הקפד להימנע מחשיפה לאור ולדגור את הצינור במשך שלוש וחצי שעות באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס.

עכשיו בצע ייעוד. תחילה דגרו את הדגימה על קרח למשך שלוש דקות לפני הסרת השמן המינרלי ותמיסת BIS sulfite. לאחר סיבוב עדין, הוסף מיליליטר אחד של 0.3 נתרן הידרוקסיד מולארי והפוך את הצינור חמש עד שש פעמים.

דגרו את הדגימה למשך 15 דקות. באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ההופך כל שלוש עד ארבע דקות, שוב, החרוז צריך לצוף בנתרן הידרוקסיד לפני תחילת ה-PCR. שוטפים את הדגימות על ידי סיבוב ראשון בעדינות.

לאחר מכן הסר את הנתרן הידרוקסיד והוסף מיליליטר אחד של pH xte 7.5 אחד. יש לנער במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סיבוב עדין שני, הסר את ה-XTE.

חזור על תהליך כביסה זה פעמיים. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של חיטוי, מים מזוקקים כפולים. לנער חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר, לסובב בעדינות בפעם השלישית ולהוציא את המים.

חזור על שטיפת המים המזוקקים פעמיים. לבסוף, הסר את כל ה-supernatant, והשאיר רק את חרוז הארוס. בדקו שה-pH של הסופרנטנט הוא 5.0.

אם הסופרנטנט עדיין בסיסי מדי, שטפו את החרוזים שוב במים מזוקקים כפולים. בינתיים, הוסף את תערובת ה-PCR העגולה הראשונה לצינור ה-PCR כמתואר בפרוטוקול הכתוב. החלק את מהירות האגרו המוצקה לשפת צינור העינור.

לאחר מכן העבירו בזהירות את מהירות האגרו לחום צינור ה-PCR ל-70 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת וערבבו ואז ההגברה מוצעת בפרוטוקול הכתוב. לאחר הגברת הסיבוב הראשון, הכינו את תגובת ה-PCR בסיבוב השני באמצעות חמישה מיקרוליטרים של מוצר הסיבוב הראשון כתבנית. הקפידו לשים ביפה מתחת לשכבת השמן המינרלי.

המשך לבצע את סבב ההגברה השני לפי ההוראות בטקסט כבדיקת אבחון. ניתן לחתוך דגימות סיבוב שני עם אנזים הגבלה שהוא מתילציה או אלקטרופורזה ספציפית לזן את תוצרי העיכול על ג'ל אקרילאמיד 8%. כל הרצועות ההטרוגניות שנוצרות מייצגות יותר מרצף אחד כדי לשכפל את תוצר הסיבוב השני לתוך הווקטור ולבצע שיבוט TA כמתואר בכתב היד המלווה את הסרטון הזה לאחר לוחית שיבוט TA, כל התגובה מתערבבת על צלחת אגר ו-LB, בתוספת אמפיצילין, אקס גל ו-IPTG ודוגרת הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר מכן הוסף את תערובת ה-PCR הראשית של המושבה לצינור ה-PCR כמפורט בפרוטוקול הכתוב. בחר מושבת חיידקים לבנה מהצלחת עם קצה פיפטה וסובב אותה לתוך 35 מיקרוליטר מתערובת מאסטר PCR של המושבה בצינור PCR. המשך להגביר את ההשעיה כמתואר בטקסט לאחר אלקטרופורזה של הגברת PCR ארבעה מיקרוליטרים של מוצר ה-PCR על ג'ל AGROS של 1.5%.

לבסוף, שלח כ-30 מיקרוליטר של תוצר ה-PCR לריצוף של חמישה PCR מושבה לכל ציט. לאחר קבלת תוצאות הריצוף, ניתן לקרוא דפוסי מתילציה כל ציטוזין גואנין מקורי שנשאר ככזה עבר מתילציה. לעומת זאת, כל גואנין ציטוזין מקורי שהוא כעת גואנין תיאמין לא עבר מתילציה לאחר הגברת PCR מקוננת באמצעות פריימרים שהומרו לבי סולפיט.

ניתן לאשר המרה מוצלחת על ידי הדמיה של גודל שבר נכון על מטפאזה בודדת של ג'ל ארוס. שתי ביציות מייצגות אלל הורי אחד ובתיאוריה יש דפוס מתילציה מוטבע אחד ככזה. ניתן לבדוק מוצרי PCR סיבוב שני לזיהום לא מכוון.

ניתן להשתמש באנזים הגבלה הרגיש למתילציה של DNA כדי לעכל את מוצר ה-PCR בסיבוב השני כדי להעריך אם הוא מכיל אלל שעבר מתילציה או ללא מתילציה כאן, ציטוזין שעבר מתילציה בתוך רצף זיהוי האנזים נחתך. בעוד שציטוזין לא מתילציה המומר לתימין אינו מזוהה עוד על ידי האנזים ואינו נחתך, יש להשליך כל דגימת ביצית מטפאזה המכילה אללים מתיליים ולא מתיליים מכיוון שהיא מעידה על זיהום תאי קומולוס או הכללת גוף קוטבי לאחר קשירה וטרנספורמציה.

ניתן לדמיין הגברה מוצלחת של PCR במושבה על ג'ל AROS כדי להבטיח שדגימות עם גודל המוצר הנכון נשלחות לריצוף. לדוגמא זו, גודל האמפליקון הצפוי לאחר קשירה הוא מאה 56 זוגות בסיסים. כאן, לשיבוט חמש יש גודל אמפליקון שגוי ואין לשלוח אותו לריצוף.

הרצף של חמישה שיבוטים בודדים מביצית מטפאזה שנייה אמור לייצר חמישה דפוסי מתילציה זהים ושיעורי המרה זהים שאינם CPG. יש להשליך כל דגימות המכילות יותר מתבנית אחת. מכיוון שלשני ציטים מטאפאזה ביוצית יש שני עותקים כרומוזומיים או גוף קוטבי מחובר, קיימת אפשרות להשיג שני דפוסי רצף דומים.

יש להשליך נתונים מכל ציט שיש לו דפוסי מתילציה שונים מאוד. מכיוון שלא ניתן לשלול זיהום בתאי קומולוס בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תחילה לשטוף ביציות מספר פעמים במדיום טרי, לאחר טיפול HI IDE כדי להסיר כמה שיותר תאי קומול. שנית, אגרוס נקודת ההיתוך הנמוכה יתקשה בטמפרטורות מתחת ל-65 מעלות צלזיוס, לכן עבדו בזהירות אך במהירות.

ולבסוף, נתרן ביס סולפט והידרוקינון רגישים לאור, ולכן יש לעטוף צינורות תגובה ותמיסות בנייר כסף.