Name: ביצית אחת bisulfite mutagenesis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: למדו ניתוח מתילציה ב-DNA ברמת תא בודד בביציות באמצעות bisulfite mutagenesis. שיטה זו מאפשרת חקר רגולציה אפיגנטית בפיתוח עוברי מוקדם ללא זיהום תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מערב אונטריו, החוג למיילדות וגינקולוגיה, ומענק ER06-02-188 מהמחקר Ministryof וחדשנות, פרס חוקר הקדומה. אכפת נתמך על ידי תוכנית אימון CIHR ב שכפול, בהתפתחות המוקדמת ואת ההשפעה על מלגה (REDIH) בוגר הבריאות.

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Rodenhiser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+human+disease%3A+translating+basic+biology+into+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications.</a> CMAJ. 174, 341-348 (2006).</li>
<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+analysis+on+individual+chromosomes%3A+improved+protocol+for+bisulphite+genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).</li>
<li>Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bisulfite+method+of+5-methylcytosine+mapping+that+minimizes+template+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation.</a> Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).</li>
<li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylation%3A+Bisulphite+Modification+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), e3170(2011).</li>
<li>Olek, A., Oswald, J., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+improved+method+for+bisulphite+based+cytosine+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis.</a> Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).</li>
<li>Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loss+of+imprinting+in+the+placenta+following+preimplantation+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture.</a> Development. 131, 3727-3735 (2004).</li>
<li>Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effects+of+superovulation%3A+loss+of+maternal+and+paternal+imprinted+methylation+in+a+dose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).</li>
<li>Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+on+bisulfite+sequencing+method+for+methylation+status+of+imprinted+genes+in+single+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yi+Xue+Yi+Chuan+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes.</a> Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).</li>
<li>Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+imprinting+perturbations+do+not+originate+from+superovulation-induced+defects+in+DNA+methylation+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition.</a> Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Hajj, N. E. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dilution+bisulfite+%28pyro%29sequencing+reveals+parent-specific+methylation+patterns+in+single+early+mouse+embryos+and+bovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes.</a> Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

זה assay ביצית אחת מכיל שלבים רבים עם מספר כי הם קריטיים ודורשים טיפול מיוחד. הראשונה היא שטיפת הביצית. זה חשוב במיוחד כדי לשטוף כל הביצית מספר פעמים בינוני טרי טיפות לאחר הטיפול hyaluronidase כדי להסיר תאים קומולוס רבים ככל האפשר. יתר על כן, בעת העברת ביציות לפתרון חומצי של tyrode להסרת pellucida Zona לוודא סביב המדיום ברור של תאים קומולוס. הביצית דביק מאוד לאחר הסרת Zona, ואת כל התאים הסמוכים קומולוס יכול בקלות להיות דבוק הביצית. קשה מאוד להסיר תא תלולית כי הוא דבק הביצית Zona ח...

טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td colspan="4"> הביצית אוסף </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> סיגמא </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> חומצי Tyrode </td><td> סיגמא </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> סיגמא </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> 10% IGEPAL </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> תמוגה פתרון </td></tr><tr><td> טריס pH 7.5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> סיגמא </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> EDTA-pH 8.0 </td><td> סיגמא </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> מכסים </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS מאגר תמוגה </td></tr><tr><td> TE-pH 7.5 </td><td> Bioshop (טריס) סיגמא (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Bisulfite המרה </td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד </td><td> סיגמא </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrogensulfite נתרן (סודיום bisulfite) </td><td> סיגמא </td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td> הידרוקינון </td><td> סיגמא </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> טמפ &#39;התכה נמוכה (LMP) agarose </td><td> סיגמא </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> שמן מינרלי </td><td> סיגמא </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> M2 בינוני </td><td> סיגמא </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO מים מזוקקים </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclaved כפול מזוקקים (DD) מים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra מיקס חם התחל RTG </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / ml tRNA שמרים </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5x מאגר גרין GoTaq תגובה </td><td> מקצועןמגה </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> Primers מקוננות הפנימיים והחיצוניים </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> קשירת </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T קל וקטור </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ת&quot;א שיבוט </td></tr><tr><td> המוסמכות E.coli תאים </td><td> Zymo מחקר קורפ </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ציוד </td></tr><tr><td> לנתח מיקרוסקופ </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 מעלות צלזיוס ו 90 מעלות צלזיוס חום בלוקים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C, 50 ° C Waterbaths (42 ° C עבור טרנספורמציות) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כסא נדנדה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מכונת ה-PCR </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

אפיגנטיקה מקיפה את כל תורשתי ושינויים הפיך כדי הכרומטין כי הנגישות אלתר הגן, וכך הם המנגנונים העיקריים בוויסות שעתוק הגנים 1. מתילציה DNA הוא שינוי epigenetic שפועל בעיקר כסימן הדיכוי. באמצעות תוספת קוולנטי של קבוצת מתיל על cytosines ב dinucleotides CPG, הוא יכול לגייס חלבונים דיכוי נוספים ושינויים היסטון ליזום תהליכים המעורבים עיבוי הכרומטין השתקת גנים 2. מתילציה דנ&quot;א חיוני להתפתחות נורמלית כפי שהיא משחקת תפקיד קריטי תכנות התפתחותי, התמיינות תאים, הדיכוי של אלמנטים retroviral, כרומוזום ה-X איון ו החתמה גנומית. אחת השיטות החזקות ביותר לניתוח מתילציה בדנ&quot;א הוא mutagenesis bisulfite. Bisulfite נתרן הוא mutagen דנ&quot;א deaminates cytosines אל uracils. בעקבות הגברה seque PCR ו<html> ncing, אירועים אלה המרה מזוהים כמו thymines. Cytosines מפוגל מוגנים מפני deamination ובכך להישאר cytosines, המאפשר זיהוי של מתילציה בדנ&quot;א ברמת נוקלאוטיד יחיד 3. פיתוח assay mutagenesis bisulfite התקדמה מאלה דווח במקור 4-6 כלפי אלה הרגישים יותר לשחזור 7. אחד היה המפתח להתקדמות הטמעת כמויות קטנות יותר של דנ&quot;א חרוז agarose, ובכך להגן על ה-DNA מטיפול bisulfite הקשה 8. ניתוח זה מתילציה מופעל להתבצע על בריכות של ביציות ו בשלב הבלסטוציסט ועוברים 9. Mutagenesis המתוחכמת ביותר bisulfite פרוטוקול עד כה היא בשלב הבלסטוציסט עוברים בודדים 10. עם זאת, מאז blastocysts יש על 64 תאים הממוצע (המכיל 120-720 PG של הדנ&quot;א הגנומי), שיטה זו אינה יעילה ללימודי מתילציה על ביציות בודדים או מחשוף בשלב עוברים. אוהל &quot;&gt; לוקח רמזים מן הטבעה agarose כמויות הדנ&quot;א דקות כולל 11 ביציות, כאן אנו מציגים שיטה לפיה ביציות מוטבעים ישירות agarose ו תמוגה פתרון חרוז אחזור מיד לאחר והסרה של pellucida Zona מן הביצית. זה מאפשר לנו לעקוף את שני האתגרים העיקריים של mutagenesis ביצית אחת: bisulfite. המגנים על כמות זעירה של דנ&quot;א, השפלה ואובדן הבאים במהלך השלבים פרוטוקול רבים חשוב לציין, כאשר הנתונים מתקבלים ביציות בודדות, סוגיית ההטיה PCR בתוך בריכות מסולק יתר על כן. , זיהום מכוונת התא תלולית ניתן לזהות על ידי שיטה זו שכן כל המדגם עם דגם אחד או יותר של מתילציה ניתן נכללו בניתוח 12. פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור ניתוחים מוצלחים לשעתקו של מתילציה בדנ&quot;א ברמת מתחיל מתא בודד והוא אידיאלי עבור ביציות נפרדות, כמו גם מחשוף בשלב עוברים.

Mutagenesis bisulfite הוא תקן הזהב לניתוח מתילציה בדנ&quot;א. פרוטוקול שונה שלנו מאפשרת ניתוח מתילציה דנ&quot;א ברמת מתחיל מתא בודד ותוכנן במיוחד עבור ביציות נפרדות. זה יכול לשמש גם המחשוף בשלב עוברי.

אפיגנטיקה כוללת את כל המודיפיקציות התורשתיות וההפיכות של הכרומטין המשנות את נגישות הגנים, ובכך מהוות את המנגנונים העיקריים ל...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לנתח מתילציה של DNA בביצית בודדת. זאת מושג תחילה על ידי הסרת תאי קומולוס ו-soap palita מביציות שנאספו. השלב השני הוא הטמעת הביצית בתוך תמיסת aros lysis ביחס של שתיים לאחת, כדי להגן על כמות ה-DNA הזעירה מפני אובדן או פירוק.בשלב הבא מבוצע מוטגנזיס באמצעות ביסולפיט, ולאחריו הגברה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז מקננת (nested PCR). השלב הסופי הוא ליגציה ושבט של תוצר ה-PCR. לאחר מכן נבחרים שבטים, מוגברים באמצעות PCR ונשלחים לריצוף.בסופו של דבר, נעשה שימוש במוטגנזה של ביסולפיט וריצוף כדי להראות מתילציה של DNA בציטוזין-פוספט-גואנין, או דינוקלאוטידי CPG, של אזור עניין בביצית בודדת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מוטגנזה של ביסולפיט במספר תאים גדול, הוא שניתן להשיג נתונים מביצית בודדת ללא איחוד תאים, הטיות של PCR וזיהום של תאי כימיה. ביום איסוף הביציות, הכין טריים את התמיסות המפורטות בפרוטוקול הכתוב; בעת הכנת התמיסות, הפחת את הסיכון לזיהום DNA על ידי החלפת כפפות לעיתים קרובות ושימוש בקצוות מסננת (filter tips); כמו כן, השאר את המבחנות בזווית הרחק ממך כשהן פתוחות, והחזר את הפקקים לכל המבחנות כאשר אינן בשימוש.התחילו את איסוף ה-OSI על ידי הנחת תることができます המפוצלות של העכבר לתוך מצע M two ומשיכת הפולי M כדי לחלץ את קומפלקס תאי הענן (cumulus cell complex). לאחר מכן, הפרידו את הציטות (cytes) מקומפלקס תאי הענן באמצעות תמיסת היאלורונידאז בריכוז 0.3 milligrams per milliliter בטיפה של 30 microliter של מצע M two. השאירו את הציטות בתמיסה רק למשך הזמן הדרוש להסרת תאי הענן, שכן חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בהם.שטפו את התבويضיות בטיפות של 30 µL של מצע M two על ידי העברת התבويضיות מטיפה לטיפה. הסירו את תאי הקומולוס מדי פעם, עבור סך של שלושה שטיפות. הסירו את ה-Z של LUCITA באמצעות תמיסת tyro חומצית.ראשית, הניחו את התאים הביצית (oocytes) בטיפה אחת של 30 microliter מהתמיסה, ולאחר מכן העבירו אותם לטיפה נוספת של 30 microliter. זאת מכיוון שכל מדיום שיועבר ידלל את החומצה ויפחית את יעילותה. השאירו את התאים בתמיסה רק למשך הזמן הדרוש להסרת ה-zona, שכן חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בהם.לאחר הסרת ה-zona, שטפו שוב את התאים בטיפה של 30 µL של מצע M2. כדי לבצע שיכון ב-Agarose, הניחו תחילה את תמיסת הליזיס על בלוק חימום בטמפרטורה של 70 °C. הוסיפו את ה-Agarose בעל נקודת ההמסכה הנמוכה (LMP Agarose) שחומם מראש אל תמיסת הליזיס, כך שייווצר יחס של 2:1 בין ה-Agarose לתמיסת הליזיס. לאחר מכן, הניחו אווציט בודד על למסת זכוכית נקייה בכמות מינימלית של מצע M2.השלב הבא הוא להטמיע את התא הבודד לתוך תמיסת ה-Agros והליסיס. יש לבצע זאת במהירות, שכן ה-Agros יתקשה בטמפרטורות הנמוכות מ-65 °C. שאבו 10 µL של תמיסות הליסיס Agros לתוך טיפ של פיפט תחת מיקרוסקופ.הוצאו בעדינות כ-1 µL או פחות מתמיס הליזיס של agros על גבי הפס גלס, ואפשרו לו להתערבב עם המצע המינימלי. שאבו בעדינות את הביצית (oocyte) לתוך קצה הפ pipette. לאחר מכן, העבירו את כל 10 µL לשפופרת einor המכילה 300 µL של שמן מינרלים, כך שהטיפה שנוצרת תקבל צורה כדורית.דגרו את המבחנה על קרח למשך 10 דקות כדי לבצע ליזיס. הסירו 300 µL של שמן מינרלי והוסיפו 500 µL של תמיסת SDS lysis buffer. דגרו את הדגימה למשך לילה במבן מים המכוון ל-50 °C ביום השני.הכינו את תמיסות המוטגנזה של bi sulfide באופן טרי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. התחילו את המוטגנזה על ידי הסרה מלאה של 500 microliters של SDS lysis buffer. זכרו כי כל שארית של lysis buffer תדלל את ה-agros בעת החימום, והחרוז יהיה רגיש יותר להמסה בשלבים הבאים.לאחר הסרה מלאה של תמיסת הליזיס (lysis buffer), הוסף 300 µL של שמן מינרלי. דגרי את הדגימה למשך שתיים וחצי דקות על בלוק חימום בטמפרטורה של 90 °C. היזהר לא לערבב, לנער או לגרום לתנודות בטמפרטורה.לאחר שתי דקות וחצי, דגרו את הדגימה על קרח למשך 10 דקות. לצורך ביצוע דנטורציה, הסירו את השמן המינרלי והוסיפו למבחנה 1 מיליליטר של sodium hydroxide בריכוז 0.1 molar; נערו בעדינות והפכו את המבחנה חמש עד שש פעמים.דגרו את הדגימה למשך 15 דקות. באמבט מים המכוון ל-37 °C, תוך היפוך כל שלוש עד ארבע דקות, החרוז אמור לצוף בנתרן הידרוקסיד. שימו לב שהחרוז אינו נמצא עוד בתחתית המבחנה.לביצוע טיפול בסולפיט, סובב תחילה את המבחנה בעדינות לאחר הסרת הנתרן הידרוקסיד. הוסף 300 µL של שמן מינרלי ו-500 µL של תמיסת BIS sulfite. הקפד להימנע מחשיפה לאור והדגר את המבחנה למשך שלוש שעות וחצי במקלח מים של 50 °C.כעת בצעו דנטורציה. ראשית, דגרו את הדגימה על קרח למשך שלוש דקות לפני הסרת השמן המינרלי ותמיסת ה-BIS sulfite. לאחר סבוב קצר במצנטריפוגה, הוסיפו מיליליטר אחד של sodium hydroxide בריכוז 0.3 molar, ונערו את הפועלה על ידי נקישה והפיכה של המבחנה חמש עד שש פעמים.דגרו את הדגימה למשך 15 דקות. במבחנה בתוך מקבץ מים בטמפרטורה של 37 °C, הפכו את המבחנה כל שלוש עד ארבע דקות; שוב, החרוזים צריכים לצוף בתוך ה-sodium hydroxide לפני תחילת ה-PCR. שטפו את הדגימות תחילה על ידי סבוב עדין בצנטריפוגה.לאחר מכן, הסירו את הנתרן הידרוקסיד והוסיפו מיליליטר אחד של 1x XTE ב-pH 7.5. נערעו במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סבב סנטריפוגה עדין שני, הסירו את ה-1XTE.חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים. לאחר מכן, הוסף 1 mL של מים מזוקקים פעמיים שעברו עיקור באוטוקלאב. נער במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר, סבב בעדינות בפעם שלישית והסר את המים.חזור על השטיפה במים מזוקקים פעמיים. לבסוף, הסר את כל הנוזל העליון (supernatant), כך שיישאר רק חרוז ה-aros. ודא כי ה-pH של הנוזל העליון הוא 5.0.אם הנוזל העליון עדיין בסיסי מדי, שטפו את החרוזיים שוב במים מזוקקים פעמיים. בינתיים, הוסיפו את תערובת ה-PCR של הסבב הראשון לשפופרת ה-PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. החליקו את ה-solid agro speed אל שפת שפופרת ה-einor.לאחר מכן, העבירו בזהירות את ה-agro speed למבחורת PCR, חממו ל-70 °C למשך דקה אחת וערבבו, ולאחר מכן בצעו הגברה כפי שמוצע בפרוטוקול הכתוב. בעקבות סבב ההגברה הראשון, הכינו תגובת PCR לסבב השני תוך שימוש ב-5 µL מתוצר הסבב הראשון כתבנית. ודאו כי הפיפטינג יתבצע מתחת לשכבת השמן המינרלי.המשיכו בביצוע סבב ההגברה השני כפי שהודרך בטקסט כבדיקה דיאגנוסטית. ניתן לחתוך דגימות מהסבב השני באמצעות אנזים הגבלה הספציפי למתילציה או לזן, ולהריץ את תוצרי העיכול באלקטרופורזה על ג'ל אקרילאמיד 8%. כל פס פסו heterogenous שיתקבל מייצג יותר מרצף אחד. כדי לשבט את תוצר הסבב השני, בצעו ליגציה אל הווקטור ושבט TA כפי שמתואר בכתב היד המצורף לסרטון זה. לאחר שיבוט ה-TA, פזרו את כל תערובת התגובה על צלחת אגר LB, המועשרת באמפיסילין, X-gal ו-IPTG, והדגרימו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה.לאחר מכן, הוסיפו את תערובת ה-PCR למושבות (colony PCR master mix) לשפחור ה-PCR כמפורט בפרוטוקול הכתוב. בחרו מושבה חיידקית לבנה מהצלחת בעזרת קצה פפטה וערבבו אותה לתוך 35 µL של תערובת ה-PCR למושבות בשפחור PCR. המשיכו להגביר את התליה כפי שמתואר בטקסט לאחר הגברת ה-PCR; בצעו אלקטרופורזה ל-4 µL מתוצר ה-PCR על ג'ל AGROS בריכוז 1.5%.לבסוף, שלחו כ-30 µL של תוצר ה-PCR לריצוף של חמישה colony PCRs לכל תא. לאחר קבלת תוצאות הריצוף, ניתן לקרוא את דפוסי המתילציה; כל ציטוזין-גואנין מקורי שנותר ככזה היה מתומתיל. לעומת זאת, כל ציטוזין-גואנין מקורי שהפך כעת לתימין-גואנין לא היה מתומתיל בעקבות הגברה של nested PCR באמצעות פריימרים שהומרו בביסולפיט.ניתן לאשר המרה מוצלחת על ידי ויזואליזציה של גודל פרגמנט נכון בג'ל agarose של מטאפזה בודדת. כל ציטה מייצגת אלל הורי אחד ובתאוריה בעלת תבנית מתילציה מודפסת (imprinted) אחת. ניתן לבדוק את תוצרי ה-PCR מסבב שני כדי לזהות זיהום לא מכוון.ניתן להשתמש באנזים הגבלה הרגיש למתילציה של DNA כדי לעכל את תוצר ה-PCR של הסבב השני, במטרה להעריך אם הוא מכיל אלל מתילציה או אלל שאינו מתילציה. במקרה זה, ציטוזין מתילציה בתוך רצף הזיהוי של האנזים נחתך. לעומת זאת, ציטוזין שאינו מתילציה אשר הומר לתימין אינו מזוהה יותר על ידי האנזים ואינו נחתך; כל דגימת ציטה שלב מטאפאזה II המכילה הן אללים מתילציה והן אללים שאינם מתילציה צריכה להי discarded כיוון שהיא מעידה על זיהום על ידי תאי קומולוס או הכללה של גוף קוטבי לאחר הליגציה והטרנספורמציה.ניתן להדמיות הגברה מוצלחת של Colony PCR על ג'ל AROS כדי להבטיח שדגימות עם גודל המוצר הנכון יישלחו לריצוף. בדוגמה זו, גודל האמפליקון הצפוי לאחר ליגציה הוא 56 זוג בסיסים. במקרה זה, לכלון חמישה יש גודל אמפליקון שגוי והוא אינו צריך להישלח לריצוף.הרצף של חמישה שיבוטים (clones) בודדים מביצית בשלב מטאפאזה II אמור להניב חמישה תבניות מתילציה זהות ושיעורי המרה זהים של non CPG. יש להשליך כל דגימה המכילה יותר מתבנית אחת. מכיוון שביציות בביוץ בשלב מטאפאזה II מכילות שני עותקים של כרומוזומים או גוף קוטבי צמוד, קיימת אפשרות לקבל שתי תבניות רצף דומות.יש להשליך נתונים מכל התאים שאתרי המתילציה שלהם שונים באופן משמעותי. מאחר שלא ניתן לשלול זיהום על ידי תאי קומולוס בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור ראשית לשטוף את התאיביצים מספר פעמים במצע טרי, לאחר הטיפול ב-HI IDE, כדי להסיר כמה שיותר תאי קומולוס. שנית, ה-agar בעל נקודת ההמס הנמוכה יתקשה בטמפרטורות הנמוכות מ-65 °C, לכן יש לעבוד בזהירות אך במהירות.ולבסוף, נתרן ביסולפית והידרוקינון רגישים לאור, ולכן יש לעטוף את מבחנות התגובה והתמיסות בנייר אלומיניום.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

מאמר זה מציג שתי שיטות המבוססות על הכלאה פלואורסצנטית באתרו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.

חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק

שמירה על שלמות גנום הביצית נחוצה כדי להבטיח את הנאמנות הגנטית בעובר המתקבל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מדויק לאיתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאי נבט נקביים של יונקים.

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

למדו ניתוח מתילציה ב-DNA ברמת תא בודד בביציות באמצעות bisulfite mutagenesis. שיטה זו מאפשרת חקר רגולציה אפיגנטית בפיתוח עוברי מוקדם ללא זיהום תאים.

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

גלה סרטונים נוספים