ניסוחים להקפאת ייבוש של חיידקים והשפעתם על הישרדות תא

מטרת הניסוי הבא היא לבחון את ההשפעה של סוגים שונים של פורמולציות לייבוש בהקפאה על הישרדות תאים. ראשית, מכינים פורמולציות שונות לייבוש בהקפאה של תרבית תאים. לאחר מכן, מערבבים כל פורמולציה עם תרבית התאים, מבצעים ייבוש בהקפאה ולאחר מכן רהידרציה, ובסוף מודדים את שיעורי ההישרדות.

התוצאות מראות הבדלים בשיעורי ההישרדות שניתן לקשר לתכונות שאופיינו. שיטה זו יכולה לעזור לכם להבין אילו תכונות פיזיקליות ומבניות של פורמולציה הן חשובות להישרדות תאים במהלך התייבשות. כדי להכין תרבית התנעה של *Pseudomonas putter*, התחילו בהחדרה של מושבה של תאים שגודלו על אגר המועשר ב-triptych soy broth או TSB לתוך 100 milliliters של triptych soy broth, או TSB; דגרו את התרבית בטמפרטורה של 30 °C, בניעור של 130 RPM למשך שבע שעות.

העבירו מנה (aliquot) מהתרבית ל-TSB טרי וגדלו למשך 16 שעות. אספו את התאים על ידי סנטריפוגציה במהירות של 1,500 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את משקע התאים ב-Resus, על ידי תלייתם ב-150 millimolar sodium chloride.

שקעו את התאים באמצעות צנטריפוגה והשעיו אותם שוב. השעימו אותם במצע פורמולציה. להכנת תמיססי פורמולציה להקפאה ויבש תאים.

שקלו את רכיבי המטריקס המתאימים והמיסו אותם במים כדי להגיע לתנאים איזוטוניים. התאימו את התמיסה בעזרת החומר העזר, נתרן כלוריד, או מומסים אחרים התואמים לתאים. כדי להשעות את התאים באופן הומוגני בתמיסה בעלת צמיגות נמוכה, השתמשו במיקסר וורטקס (vortex) על התמיסות בעלות הצמיגות הגבוהה.

הוסיפו מגנט בחישה ונערה את התערובת. לאחר מכן, חלקו את הפורמולציות למבחנות ייבוש בהקפאה שנשקלו מראש ושקלו את המבחנות. שאבו 100 µL מכל דגימה ובצעו דילולים עשוריים, זרעו את הדילולים הרצויים והדגירו אותם בטמפרטורת החדר. אם המבחנות ייסגרו בתוך מייבש ההקפאה, מקמו פקק גומי על כל מבחנה מהתאים שזרעו.

ספרו את התאים בכל פורמולציה. השתמשו בשיטת ה-du noé למדידת מתח הפנים של תערובות החיידקים המייבשות. נקו את טבעת הפלטינה על ידי הנחתה בלהבה חסרת צבע עד שהיא הופכת לאדומה.

באמצעות אצטון ונייר סופג ללא סיבים, שטפו ונגבו את כלי המדידה והשתמשו בלהבה כדי לשרוף את הפנים. מלאו את הכלי בתמיסה והמתינו להתייצבות פני השטח לפני המדידה, עבור תמיסות שדורשות זמן להגעה לשיווי משקל. המערך המשמש כאן יספק נתונים איכותיים עבור פורמולציות בעלות צמיגות גבוהה.

השתמשו בתמיסה בריכוז נמוך יותר כדי למדוד את מתח הפנים והסיקו את המסקנה כי יש להתאים את תנאי הנשוף-קירור (freeze drying) לתכונות הפיזיקליות של הפורמולציה. הפרמטר החשוב ביותר הוא טמפרטורת מעבר הזכוכית או ה-TG של הפורמולציה, המסומנת כ-TG prime עבור הדגימה המרוכזת בהקפאה, המעידה על כך שמים עדיין נוכחים. כדי לקבוע את התנהגות ההקפאה של הפורמולה, הכניסו 5 עד 10 milligrams של הדגימה לכלי אלומיניום עם מכסה עבור קלורימטריה סורקת דיפרנציאלית או DSC.

הכינו כלי ריק כדגימת ייחוס. הגדירו את תוכנית סריקת הטמפרטורה ב-DSC כך שתדמה את שלב ההקפאה בתוכנית הייבוש בהקפאה. הדבר נעשה כיוון שקינטיקת הקירור עשויה להשפיע על ה-TG prime של הפורמולציות שאינן מיובשות לפני תחילת סריקת החימום.

הורידו את הטמפרטורה לרמה הנמוכה משמעותית מה-tg הצפוי. בחרו קצב חימום מתאים עבור הפורמולציות הנבדקות. אות זרימת החום המתועד מבוטא בואטים ויהיה מושפע מקצב החימום.

קצב חימום גבוה יותר יניב אות גדול יותר של TG Prime; הגדירו את טווח הטמפרטורות כך שיכסה הן את ה-TG prime והן את ההמסה של הפורמולציה. לאחר קביעת התנהגות ההקפאה, התאימו את פרמטרי תהליך הנשוף (freeze drying) כך שטמפרטורת הדגימה תהיה תמיד נמוכה מה-TG של הדגימה, ושלחץ התא יאפשר סובלימציה מהירה של קרח ומים ששאריים בפורמולציה. זאת כדי להגן על המוצרים היבשים לאחר הנשוף.

בצעו בקרה על האטמוספירה של הדגימות על ידי איטום הדגימות במייבש ההקפאה לפני שחרור הוואקום בסיום מחזור ייבוש ההקפאה. לחלופין, ניתן למלא את הבקבוקונים באטמוספירה מועדפת. חשוב למנוע חשיפה של הדגימות לתנאי הסביבה, שכן כל לחות או חמצן שיהיו באטמוספירת האחסון ישפיעו על הישרדות התאים.

לבסוף, שקלו את המבחנות כדי לנתח את הדגימות באמצעות קרני X. העמיסו כמות קטנה של המטריצה הבקטריאלית על תושבת דגימה והניחו את תושבת הדגימה בתוך הרפרקטומטר לקרני X. השתמשו בתוכנה התואמת לציוד קרני X כדי לנתח כל שלב גבישי הנוכח בדגימה.

לניתוח המטריקס הבקטריאלי באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית, הצמד כמות קטנה לסרט פחמן המקובע על בסיס (stub) של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). הכנס את מחזיק ה-SEM למכשיר ציפוי (spotter coater), וצפה את הדגימה בזהב ופלדיום או פלטינה לצורך הדמיה של הדגימה. הכנס את מחזיק ה-SEM לתא ובחר את פרמטרי ההדמיה המתאימים.

לדוגמה, במכשיר זה אנו משתמשים במתח האצה של five kilovolt, גודל נקודה (spot size) של שלוש, מרחק עבודה של five millimeters וגלאי אלקטרונים משניים. טבלה זו מפרטת נתונים עבור פורמולציות שונות, כולל אירועים תרמיים שתועדו באמצעות DSC במהלך חימום של הפורמולציות הקפואות, מבנה הדגימות היבשות והמתח הפשטי של תמיסות הפורמולציות. ה-TG prime של סוכרוז הוא minus 40 °C וייתכן שיהיה קשה לזהות ריכוזי סוכרוז נמוכים מ-20% weight per weight.

האירוע התרמי בטמפרטורה של 35- מעלות צלזיוס קשור ככל הנראה לתחילת התמוססות הקרח המוצגת כאן. נתוני הישרדות עבור P putter גרם-שלילי ו-CHLOROPHYL cus גרם-חיובי, המנוסחים בפורמולציות שונות המבוססות על סכרידים. שימו לב כי המגמה של מידת התמיכה של הפורמולציה בהישרדות התאים דומה עבור שני מיני החיידקים.

תרשים זה ממחיש את המתאם בין ההישרדות לאחר ייבוש בהקפאה לבין מתח הפנים של הפורמולציות, דבר המצביע על כך שמתח פנים גבוה יותר מוביל לשיעורי הישרדות גבוהים יותר. תמונות ה-SEM המוצגות כאן מייצגות פורמולציות יבשות עבור ארבעה פולימרים שונים, ששמטריצותיהם נראות כנייר פריך או כגיליונות חלקים מקושרים עם תבניות גליות של חיידקים מוטמעים עבור fi, ccal וסוכרוז. הגיליונות הם בעובי של כמיקרון אחד וברוחב של 10 עד 20 מיקרון, כאשר ל-fi ccal יש פני שטח חלקים יותר, ול-HPMC ו-HEC גיליונות דקים בהרבה.

והחיידקים נראים ביתר קלות, ייתכן משום שיחס הפולימר-חיידקים נמוך יותר בניסוחים מבוססי תאית אלו. יתר על כך, נצפו גבישי מלח עבור HEC ו-HPMC, כאשר באחרונים נראה כמות גדולה יותר של משקעים על פני השטחים של דפי הפולימר. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו הישרדות התאים תלויה בתכונות הניסוח באמצעות הטכניקות המוצגות כאן.