Name: המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: למדו כיצד להמיר שיטת ELISA לפלטפורמת Luminex xMAP לזיהוי ציטוקין TNF Alpha. השיטה מאפשרת בדיקה מרובת נוגדנים בו-זמנית עם רגישות וטווח דינמי משופרים לעומת ELISA סטנדרטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי Luminex Corporation.

<ol><li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li>
<li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li>
<li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61(2006).</li>
<li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li>
<li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li>
<li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li>
<li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles%3B+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Roum.+Arch.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li>
<li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li>
<li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA%3A+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li>
<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li>
<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

עבודה זו נעשתה על Luminex חברת הציוד מיוצרים ב Luminex Corporation. R &amp; D מערכות &amp; EMD Millipore הם שותפים אסטרטגיים של Luminex Corporation; רישיון לפתח ולמסחר Xmap זמנית מבחני מבוסס.

המרה של assay ELISA לפלטפורמה Luminex Xmap יכול להיות פשוט כמו החלפת streptavidin peroxidase חזרת (SA-HRP) ב טיפוסית ערכת ELISA עם streptavidin phycoerythrin (SA-PE), ואופטימיזציה של הביצועים. למי שרוצה ליצור immunoassay Xmap מהיסוד, זה יכול להיות מושלם עם פרוטוקול ברור כי גם מאפשר הערכה מהירה, זמנית של זוגות נוגדנים. ריאגנטים לשנת assay Xmap היו מוכנים בקלות באמצעות נוגדן Xmap ערכת צימוד לזוג נוגדנים ללכוד המיועדים MagPlex microspheres ריכוז נמוך. השימוש microspheres ריכוז נמוך מפחית את העלות של פיתוח assay תוך מתן ביצועים assay אותו microspheres ריכוז גבוהה יותר. משך הזמן הנדרש כדי להכין יחד MagPlex microspheres הוא כ 3 שעות, שזה הרבה יותר מהר מאשר 22 - 24 שעות נדרש המעיל גם צלחת ELISA, ואחריו טיפולשל בארות מצופים. הביצועים של assay Xmap הוא גם עדיפה על ELISA מבחינת מגבלה של זיהוי (&lt;4 pg / mL לעומת&gt; 31 pg / mL) ודינמי טווח (&lt;4 pg / mL ל&gt; 8000 pg / mL לעומת 16 pg / mL עד 1000 pg / ml). קוראים פלייט יש מגוון מצומצם OD אשר הוא או 3 או 4 OD, להגביל את הגבול העליון של טווח דינמי assay. אין ספק, לא כל הנוגדנים יעבדו במתכונת ELISA ולא כל הנוגדנים שפועלים היטב ב ELISA ניתנות להעברה בקלות לתבנית assay Xmap. עם זאת, מאז מבחני Xmap ניתן מרובב (כלומר, להפעיל בו זמנית), ניתן להעריך ללכוד כמה שילובים ואת הנוגדנים לזיהוי במקביל לזהות את הצמד הטוב ביותר לשימוש עבור assay. תהליך זה חוסך זמן משמעותי ריאגנטים לעומת הליך פיתוח ELISA, אשר מוגבל להערכת זוג אחד בכל פעם. שניים או יותר זוגות הנוגדנים צריך לבצע שקול, פרמטרים אחרים של assay יכוללשקול לקבוע התאמתו של זוג (למשל, זמינות, עלות וכו &#39;). בנוסף לביצועים assay גמישות משופרת עם assay Xmap, יש גם חיסכון משמעותי בעלויות. כמות מומלצת של נוגדנים נדרש מעיל גם יחידה של צלחת ELISA היא 400ng, בעוד הכמות הדרושה של חרוזים המשמשים 1 היטב assay Xmap הוא כ 7.5 ננוגרם. לפיכך, כמות הנוגדנים הדרוש 1 ELISA גם תספק יותר מ -50 תוצאות הבדיקה, אם נעשה שימוש assay Xmap. עבור יישומים הכוללים דגימות יקרות, Xmap יש גם יתרון משמעותי. היקף המדגם מומלץ ELISA הוא 100 μL ואילו נפח הנדרש assay Xmap יכול להיות חצי מזה, או פחות. לסיכום, המרה של assay ELISA לפלטפורמה Luminex Xmap הוא לא מסובך, יעיל ועלות חיסכון, תוך הפקת assay עם טווח דינמי רגישות מעולה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תאור </td><td> מוכר </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> האדם TNF-α/TNFSF1A DuoSet ערכת ELISA </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> DY210 </td><td> כולל חד שבטיים ו ביוטין נוגדנים polyclonal יחד ו רקומביננטי סטנדרטיים TNF-α חלבון </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> לכידת נוגדנים, שיבוט CH8820 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> ביוטין מצמידים נוגדן איתור, שיבוט AS1 </td></tr><tr><td> חלבון TNF אלפא </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> רקומביננטי TNF-α חלבון רגילה </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> לא זמיןovus </td><td> NBP1-50115 </td><td> לכידת נוגדנים, שיבוט 4H31 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> נובוס </td><td> NB100-78162 </td><td> ביוטין מצמידים נוגדן איתור, שיבוט MAb11 </td></tr><tr><td> חלבון TNF אלפא </td><td> נובוס </td><td> NBC1-18460 </td><td> רקומביננטי TNF-α חלבון רגילה </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> לכידת נוגדנים, לשבט 3C7.2 </td></tr><tr><td> נוגדן Polyclonal כדי TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> איתור polyclonal הארנב נוגדן </td></tr><tr><td> Streptavidin-Phycoerythrin </td><td> אזוב </td><td> SAPE-001 </td><td> כתב מגיב פלורסנט עבור assay Xmap Luminex </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Software xPONENT </td><td> Luminex Corporation </td><td> תואר שניGPIX-XPONENT </td><td> Luminex Instrument </td></tr><tr><td> Xmap נוגדן צימוד (ABC) ערכת </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> כולל מגיב EDC, Sulfo-NHS מגיב, מאגר ההפעלה, מאגר הכביסה, 1.5 התגובה צינורות מ&quot;ל, ו בטפי להחדרת נוזלים חד פעמיים </td></tr><tr><td> MagPlex microspheres, ריכוז נמוך </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> ריכוז נמוך חרוזים (@ 2.5 x 10 6 חרוז / mL) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-ביוטין </td><td> תרמו פישר </td><td> PI-21335 </td><td> Biotinylation ערכת זיהוי הנוגדן ללא שינוי </td></tr><tr><td> טקאן אינסופי F200 Reader </td><td> טקאן </td><td></td><td> ELISA צלחת הקורא </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% PBS-BSA, Assay Buffer </td></tr><tr><td> אחד פיינט נקיים קולי קומפקטי, 115 VAC </td><td> קולמן בן הזוג </td><td> WU-08849-00 </td><td> לייצר תדר הפעלה יעילה של kHz 55 </td></tr><tr><td> Tube מפריד מגנטי </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288-01 </td><td> להפרדה חד צינור 1.5mL המגנטי צעדים לשטוף צימוד </td></tr><tr><td> לוח מגנטי מפריד </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> להפרדה 96 היטב צלחת מגנטית בצעדים לשטוף assay </td></tr></tbody></table>

המרת elisa ללכוד assay luminex xmap באמצעות נוגדן multiplex שיטת הקרנה

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Assay האנזים צמוד immunosorbent (ELISA) כבר זמן רב את הכלי העיקרי לגילוי של analytes של עניין דגימות ביולוגיות הן למחקר מדעי החיים ודיאגנוסטיקה קלינית. עם זאת, ELISA יש מגבלות. הדבר מתבצע בדרך כלל microplate 96-היטב, בארות מכוסים נוגדנים ללכוד, הדורש כמות גדולה יחסית של המדגם לתפוס אנטיגן של עניין. שטח פנים גדול של בארות מחייב הידרופובי של נוגדנים ללכוד יכול להוביל גם הרקע הלא ספציפית מחייב יותר. בנוסף, רוב ELISAs להסתמך על הגברה האנזים בתיווך של אות על מנת להשיג רגישות סבירה. הגברה כזו היא לא תמיד ליניארית תוצאות ולכן ניתן ליצור הטיה. ב -15 השנים האחרונות, התפתחה טכנולוגיה חדשה המציעה את היתרונות של ELISA, אך גם מאפשר קצב העברת נתונים גבוהה יותר, גמישות משופרת, נפח דגימה מופחת, ובעלות נמוכה יותר, עם וו דומהrkflow 1, 2. Luminex Xmap הטכנולוגיה היא (חרוז) microsphere מערך פלטפורמה המאפשרת הן monoplex ואת מבחני זמנית כי ניתן להחיל את החלבון הן חומצות גרעין ויישומים 3-5. החרוזים יש נוגדנים ללכוד משותקת קוולנטית על שטח פנים קטן יותר, המחייב נוגדנים ללכוד פחות כרכים מדגם קטן יותר, בהשוואה ל ELISA, ולא ספציפית מחייב מצטמצם משמעותית. כרכים מדגם קטנים יותר חשובים בעבודה עם דגימות מגבילות כמו הנוזל השדרתי, נוזל סינוביאלי, וכו &#39;6. ריבוב assay תצמצם עוד יותר את נפח דרישות לדוגמה, המאפשר מספר רב של תוצאות ממדגם אחד. שיפורים שנעשו לאחרונה על ידי Luminex כוללים: המערכת החדשה MAGPIX, קטן יותר, זול יותר, קל יותר לשימוש Analyzer, ריכוז נמוך מגנטי MagPlex microspheres אשר מבטל את הצורך צלחות הסינון יקרים לבוא בריכוז עובד מתאים יותר לפיתוח assay ונמוך התפוקה יישומים וכן את הצימוד נוגדן Xmap (ABC) קיט, הכולל פרוטוקול, חומרים כימיים, וחומרים מתכלים הדרושים צימוד חרוזים כדי נוגדנים לכידתו של עניין. (ראה סעיף חומרים לרשימה מפורטת של תכולת הערכה). בניסוי זה, אנו ממירים את assay מראש אופטימיזציה ELISA עבור ציטוקינים TNF-alpha לפלטפורמה Xmap ולהשוות את הביצועים של שתי השיטות 7-11. TNF-alpha הוא סמן ביולוגי המשמש למדידת תגובות דלקתיות בחולים עם מחלות אוטואימוניות. נתחיל צימוד ללכוד ארבעה נוגדנים מועמד ארבע קבוצות microsphere או אזורים שונים. כאשר מערבבים יחד, אלה ארבע קבוצות לאפשר בדיקות סימולטני של כל ארבעת המועמדים עם ארבעה נוגדנים זיהוי נפרדים כדי לקבוע זוג נוגדנים הטובה ביותר, ריאגנטים חיסכון, מדגם וזמן. שני מבחני Xmap בנויים כך עם שני זוגות נוגדנים האופטימלית ביותר והביצועים שלהםבהשוואה לזו של assay ELISA המקורי לגבי עוצמת האות, טווח דינמי, ורגישות.

ELISA ניתן להמיר בקלות assay Luminex Xmap, ובאמצעות היתרונות של נוגדנים, ריבוב כמה יכול להיות מוקרן בו זמנית לזהות נוגדנים זוג אופטימלי, והתוצאה היא רגישות מוגברת טווח דינמי, תוך הפחתת עלות assay.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

בדיקת הספיחה החיסונית מקושרת-אנזים (ELISA) משמשת מזה זמן רב ככלי העיקרי לזיהוי אנליטים רלוונטיים בדגימות ביולוגיות, הן עבור מדעי החיים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להמיר בדיקת ELISA שעברה אופטימיזציה מראש עבור ציטוקין TNF Alpha לפלטפורמת Xap, תוך הערכה של זוגות נוגדנים חלופיים. דבר זה מושג על ידי צימוד הנוגדן התופס (capture antibody) מערכת ה-ELISA, יחד עם שלושה נוגדנים תופסים מועמדים אחרים, לארבעה סטים שונים של מיקרוספירות או חרוזיים כאשר הם מעורבבים יחד. ארבעה סטים אלו מאפשרים בדיקה סימולטנית של כל ארבעת המועמדים עם ארבעה נוגדני זיהוי נפרדים, כדי לקבוע את זוג הנוגדנים המיטבי.שני בדיקות ה-Xap הבאות נבנות עם שני זוגות הנוגדנים האופטימליים ביותר. לאחר מכן, ביצועי הבדיקות מושווים לאלו של בדיקת ה-EISA המקורית ביחס לעוצמת האות, לטווח הדינמי ולרגישות. התוצאות מראות שנוגדנים דומים יכולים להפגין ביצועים שונים מאוד תחת אותם תנאים, וכי ניתן לסנן מספר נוגדנים בו-זמנית באמצעות בדיקת ה-Luminex Xap, מה שמעיד כי לבדיקה זו רגישות וטווח דינמי מוגברים בהשוואה ל-EISA.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון EIS A הוא שבדיקות אימונו-סיי (immunoassays) המבוססות על xap מאפשרות לחוקר לבחון מספר יעדים, או במקרה זה, לבחון מספר נוגדנים בו-זמנית. כדי לזהות את הנוגדן הטוב ביותר שהוצג, הפרוצדורה תבוצע על ידי אריקה לופז, מדענית שותפה ב-Luminex Corporation.התחילו פרוטוקול זה בבחירה והכנה של ארבעה נוגדני לכידה וארבעה נוגדני זיהוי הספציפיים ל-TNF alpha אנושי, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כמו כן, הכינו נוגדן אישור אחד הספציפי למין המארח של נוגדני הלכידה. הביאו את الريאגנטים בערכת הצימוד של הנוגדנים לטמפרטורת החדר.סמנו ארבעה מבחנות תגובה עם מספרי אזורי החרוצים שנבחרו לתגובת הצימוד. העבירו את תכולת ארבעת הבקבוקונים של מיקרוספירות mag plex לארבעת מבחנות התגובה המסומנות. שטפו כל אחת מקבוצות החרוצים פעמיים ב-500 µL של בופר אקטיבציה והפעילו כל קבוצת חרוצים באמצעות תמיסות sulf ONHS ו-EDC כפי שמתואר בערכת הצימוד לנוגדנים.מדריך למשתמש: לאחר דגירה של 20 דקות על רטט (rotator), חזור על שלב השטיפה הקודם עם החרוזיים הפעילים כעת סך הכל שלוש פעמים עם 500 µL של בופר הפעלה. עבור כל שטיפה, הכן ארבעה תמיסות נפרדות של 500 µL, שכל אחת מהן מכילה 7.5 µg של נוגדן לכידה בבופר ביטול פעילות.הוסיפו את ארבעת התמיסות של הנוגדי הלכידה לפרבורות התגובה המתאימות. ערבבו כל פרבורה במערבל Vortex באופן מיידי והדגרימו למשך שעתיים על רוטטור. חזרו על שלב השטיפה עם החרוזים המצומדים כעת סך כולל של שלוש פעמים, באמצעות 500 µL של תמיסות השטיפה המצורפת לערכת הצמיד הנוגדנים.לאחר שלב השטיפה האחרון, הוסיפו 500 microliters של בופר שטיפה לכל מבחנת תגובה כדי להגיע לריכוז מלאי סופי של 5 מיליון חרו지를 המצומדים לנוגדנים ל-milliliter, ערבבו ב-vortex, ולאחר מכן בצעו סוניקציה למבחנות התגובה כדי לפזר את החרוזים. ספרו את מספר החרוזים שהופקו לאחר תגובת הצימוד באמצעות סופר תאים או hemo cytometer. שיעור ההשבה מתגובת הצימוד הוא בדרך כלל מעל 90%. ודאו כי תגובת הצימוד הצליחה על ידי הכנת תמיסות בדיקה של מלאי החרוזים המצומדים עבור כל סט, בריכוז סופי של 100 חרוזים ל-microliter בבופר בדיקה, והכינו דילול של FICO erything labeled antis species.הוסף נוגדן אישור IgG בריכוז של 4 µg/mL בבופר בדיקה (assay buffer). העבר aliquots של 50 µL מכל תמיסת בדיקה לארבעה בארות של פלטה בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה, לסך של 16 בארות. לאחר מכן, הוסף 50 µL של בופר בדיקה לשמונה מהבארות למדידת הרקע, ו-50 µL של נוגדן אישור מדולל לשמונה הבארות שנותרו. ערבב את התגובות בעדינות על ידי פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות פטנטה רב-ערוצית.כסו את הפלטה והדגרימו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מערער פלטות. הניחו את הפלטה על מפריד מגנטי לפלטות למשך דקה עד שתיים כדי למשוך את החרוזים מתוך התמיסה. לאחר מכן, הסירו את הנוזל על ידי הפיכה נמרצת של הפלטה בזמן שהיא על המפריד מעל מיכל פסולת.שטפו כל באר פעמיים על ידי הוספה של 100 µL של באפר בדיקה (assay buffer) והסרת ה-SANE מהפלטה באופן דומה. בעזרת מפריד פלטות מגנטי, השעו שוב את החרוזים ב-100 µL של באפר בדיקה על ידי פיפטור עדין מעלה ומטה חמש פעמים באמצעות פיפט רב-ערוצי. נתחו את הדגימות במכשיר luminex xap, כגון מכשיר magix.עוצמת האות הפלואורסצנטי של תגובה זו פרופורציונלית ישירות לכמות החלבון על פני השטח של החרוזים, דבר המאפשר הערכה מהירה של כמות החלבון היחסית שהוצמדה לחרוזים. כדי לקבוע את זוג הנוגדנים היעיל ביותר בבדיקת ה-xap, הכינו תערובת ראשונית של כל ארבעת סטים של החרוזים על ידי הוספת 10 µL מכל אחד ל-0.96 mL של באפר בדיקה. הכינו את תמיסות הנוגדנים הגילוי על ידי דילול של כל נוגדן ל-1 µg/mL בבאפר בדיקה.גם זהו בופר מדידה. הכין את סטנדרט חלבון TNF alpha מבית r and d systems בריכוז של 2000 picograms per milliliter ומדלל את ה-Streptavidin R FICO eryn לריכוז של eight micrograms per milliliter. הוסף 50 microliters של תערובת חרוזיים מצומדים לנוגדן לכל אחת מ-16 הבארים בלוח CoStar בעל תחתית עגולה עם 96 בארים עבור בדיקת הסריקה.לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של באפר בדיקה לשמונה מתוך 16 הבארים כדי למדוד את הרקע. לאחר מכן, טפטפו 50 µL של סטנדרט TNF alpha לשמונה הבארים הנותרים כדי למדוד את התגובה. דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוגנים מאור, תוך כדי ניעור על מערער פלטות בדיקה.לאחר מכן, הוסיפו 50 µL מכל אחד מארבעת הנוגדנים לגילוי לארבעה בארות, כאשר שתיים מהן הן בארות רקע ושתיים הן בארות תגובה. דגרו למשך 30 דקות תחת אותם תנאים, ולאחר מכן הוסיפו 50 µL של ריאגנט SAPE לכל הבארות. דגרו שוב למשך 15 דקות תחת אותם תנאים.הנח את הפלטה על מפריד מגנטי לפלטות למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר את הנוזל על ידי היפוך נחרץ של הפלטה בעודה על המפריד מעל מיכל פסולת. העבר בפיפט 100 µL של באפר תגובה (assay buffer) לכל אחת מ-16 הבארות.לאחר מכן, הסירו את הנוזל מהחרוזים באמצעות הפרדה מגנטית. כעת, הוסיפו 100 µL של בופר בדיקה לכל אחת מ-16 הבארות. קראו את הפלטה באמצעות מכשיר ה-Luminex mag picks בהתאם למדריך למשתמש להפעלה נכונה.בחרו זוג נוגדנים העומד בעוצמת האות הרצויה. לאחר בחירת הנוגדן הטוב ביותר ללכידה (capture antibody), דללו 100 µL ממלאי הנוגדנים המשוררים לחרוזים ל-10 mL עם באפר למסיי (assay buffer). הוסיפו 50 µL מהחרוזים המדוללים ל-78 בארות של שתי פלטות CoStar בעלות 96 בארות עם תחתית עגולה.כל פלטה תשמש להערכת הביצועים של נוגדן זיהוי שונה. לאחר מכן, הכינו עקומת סטנדרט בת 12 נקודות, המתחילה ב-8,000 picograms per milliliter ומסתיימת בארבעה picograms per milliliter, באמצעות מערכות r and d.הוסיפו שש חזרות של 50 µL של כל דילול של סטנדרט TNF Alpha לכל אחת מהלוחיות, בתוספת שש בארות עם 50 µL של באפר בדיקה (assay buffer) לכל אחת כרקע, לסך של 78 בארות ללוחית. דגרו את הלוחיות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, במוגנות מאור, תוך써 ניעור על מכשיר ניעור ללוחיות בדיקה. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של הנוגדן הראשוני לגילוי לכל 78 הבארות של הלוחית הראשונה.חזור על הפעולה עבור נוגדן הגילוי השני בפלטה השנייה. דגור את הפלטות למשך 30 דקות תחת אותם תנאים. לאחר מכן, הוסף 50 µL של ריאגנט ה-SAPE לכל הבארים בכל פלטה.לאחר ניעור של שתי הפלטות למשך 15 דקות תוך הגנה מאור, הניחו את הפלטות על מפרידי פלטות מגנטיים למשך דקה אחת. הסירו את הנוזל על ידי היפוך נמרץ של הפלטה בעודה על המפריד, מעל מיכל פסולת. לאחר מכן, טפטפו 100 µL של באפר בדיקה (assay buffer) לכל אחד מ-78 הבארים שבפלטות, לפני הסרת הנוזל מהחרוזיים המגנטיים כפי שבוצע קודם לכן.לאחר הוספת 100 µL של באפר בדיקה (assay buffer) לחרוזים בכל אחד מ-78 הבארים בלוחיות, נתחו את הלוחיות במכשיר ה-mag picks בהתאם למדריך למשתמש להפעלה נכונה. פעלו לפי ההוראות המצורפות לערכת ה-ELI A מסוג human TNF Alpha T NF SF one a DUO set של r and d systems. מדדו את התגובה שנוצרה על ידי הסטנדרט שסופק עם ערכת r and d.חזור על בדיקת ה-ELI a שלוש פעמים נוספות, כאשר תחליף את הנוגדנים ללכידה ולזיהוי של r and d systems בנוגדנים של הספקים האחרים. לצורך הפשטות, จับ את הנוגדנים לפי ספק, והערך כל זוג באופן עצמאי כפי שנדרש בפורמט ה-EISA עם כל אחד משלושת סטנדרטים של חלבון TNF Alpha. בדיקות Luminex Xap בוצעו כ-multiplex כדי להעריך את כל ארבעת הנוגדנים ללכידה כתערובת, על ידי שילוב של ארבעה סטים של נוגדני TNF alpha המצומדים למיקרוספירות Mag PLX; הנוגדנים ללכידה הוערכו עם כל אחד מארבעת הנוגדנים לזיהוי הביוטיניליים באופן פרטני, כך שניתן היה לקבוע בו-זמנית את האינטראקציה של נוגדן זיהוי אחד עם כל אחד מארבעת הנוגדנים ללכידה.התוצאות הצביעו על כך שזוג הנוגדנים מהסט DUO של r and d systems הניב את הביצועים הטובים ביותר, עם תגובה של 6,183 יחידות של עוצמת פלואורסצנציה חציונית או MFI. כמו כן, נצפה כי הנוגדנים לזיהוי מ-Millipore ו-ABAM סיפקו תגובה סבירה בבדיקת ה-XAP כאשר שולבו עם הנוגדן ללכידה של RD systems; לעומת זאת, הנוגדנים ללכידה מ-Millipore, ACAM ו-Novus הניבו תגובה פחות רצויה בבדיקת ה-XAP. פרוטוקול הסט DUO של r and d systems שימש להשוואה בין ארבעת זוגות הנוגדנים בפורמט EISA.הפרוטוקול של r and d systems שימש עבור כל זוגות הנוגדנים מכיוון שהוא משקף פרוטוקולי EIA טיפוסיים הנפוצים כיום, והוא אנלוגי לפרוטוקולים המשמשים בטכנולוגיית xap. בדיקות ה-EISA הראו כי שוב זוג הנוגדנים מ-r and d systems הניב את התוצאות הטובות ביותר. זוג הנוגדנים מ-Acam לא הפיק תגובה, וזוגות הנוגדנים מ-Millipore ומ-Novas הפיקו תגובות צנועות, וזאת על מנת להעריך וריאציה כלשהי בריאקטיביות של הנוגדנים.באמצעות הסטנדרט, כל ארבעת זוגות הנוגדנים נבדקו עם שלושה סטנדרטים שונים של חלבון TNF alpha רקומביננטי משלושה ספקים שונים. הנתונים מראים כי הסטנדרטים של חלבון TNF alpha רקומביננטי משלושת הספקים הניבו תוצאות שקולות. חלבון ה-TNF alpha מ-r and d systems שימש ליצירת עקומות סטנדרט עבור בדיקות ה-ELSA וה-XAP.בעוד שבדיקת ה-ELI A בוצעה באמצעות זוג הנוגדים של r and d system, בדיקות ה-xap השתמשו בנוגדן הלכידה של r and d system ובנוגדן הגילוי מ-r and d systems או מ-Millipore. חלבון TNF alpha מ-r and d systems דולל כדי להפיק טווח ריכוזים מ-8,000 ועד ארבעה picograms per milliliter בלבד. זוג הנוגדים מ-r and d systems הניב את התוצאה המצופה בבדיקת ה-Xap, עם תגובה הגבוהה מ-20,000 MFI כפי שמוצג.כאשר נעשה שימוש בנוגדן הגילוי מ-Millipore בבדיקת ה-Xap במקום בנוגדן הגילוי של r and d systems, התגובה הייתה כ-30% מהתגובה שהתקבלה עם נוגדן הגילוי של RD systems. הקו הירוק בתרשים זה מייצג את עקומת הסטנדרט של ה-ELA, שטווח ה-TNF alpha המומלץ על ידי היצרן עבורה היה בין 16 ל-1000 picograms per milliliter. בשל מגבלת הספקטרופוטומטר, לא ניתן היה להרחיב את הטווח של בדיקת ה-Eliza.יתרה מכך, הטווח הדינמי והרגישות של שתי השיטות מודגמים בצורה טובה יותר כאשר הם מוצגים בסולם לוגריתמי. ניתן לראות הבחנה ברורה בין השיפוע של תגובת ה-EISA לבין התגובות של בדיקות ה-xap, דבר המצביע על יכולת גילוי מוגבלת יותר של TNF alpha בשיטת ה-EL iza הן בריכוזים גבוהים והן בריכוזים נמוכים. גבולות הגילוי או ה-LOD של שתי בדיקות ה-xap התפקודיות ל-TNF alpha הוערכו באמצעות זיהוי ריכוז ה-TNF alpha הנמוך ביותר שבו נצפתה רמת תגובה הגבוהה מהרקע, בתוספת פי שלושה מסטיית התקן שלו או ה-SD משש חזרות.ניתן להבחין כאן כי בעת שימוש בזוג של r and d systems, ריכוז ה-TNF alpha הנמוך ביותר, 3.91 picograms per milliliter, הניב תגובה של 66 MFI, שהיא גבוהה מהתגובה עבור הרקע בתוספת של שלוש SD, ובכך עומדת בקריטריון זה. כאשר נעשה שימוש בנוגדן הגילוי של millipore יחד עם נוגדן הלכידה של r and d systems, גבול הגילוי היה נמוך מ-7.81 picograms per milliliter.במקרה זה, ריכוז ה-TNF alpha השני הנמוך ביותר שהפיק תגובה מקובלת היה 17 MFI, ערך הגבוה מהתגובה של ריכוז ה-TNF alpha הנמוך ביותר בתוספת פי שלושה מסטיית התקן שלו. באופן דומה, גבול הגילוי עבור ערכת ה-ELISA מסוג duo set של r and d systems נאמד בין 63 ל-31 פיקוגרם למיליליטר. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שלבים נוספים כגון בדיקה של מטריצות דגימה שונות או ריכוזים שונים של נוגדנים בתוך ה-reporter, וזאת כדי להבטיח אופטימיזציה נוספת של בדיקת ה-xap.

conversion-capture-elisa-to-luminex-xmap-assay-using-multiplex

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שימוש בטכנולוגית microsphere Xmap של Luminex החברה, פתחתי immunoassay Fluorometric Multiplexed (MFIA) לserosurveillance של מיני בעלי חיים שונים במעבדה. MFIA הוא microarray השעיה בי אנטיגן, בקרת רקמה או נוגדנים קשורות קוולנטית לקלקר microspheres צבעים. שיטת בדיקת MFIA כמו גם נושאים שונים לפתרון בעיות מטופלות.

מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

הסרטון מציג את היישום של טכנולוגיית שבב סנאפ עבור חיסונים של סנדוויץ' מרובב ללא תגובתיות צולבת. הפעולה הפשוטה של הצמדת שתי שקופיות מיקרו-מערך, שכל אחת מהן מכילה ריאגנטים שונים, מבטיחה העברת מגיבים ללא זיהום צולב ומסייעת לזהות חלבונים מרובים באמצעות אימונואסיית סנדוויץ'.

טכנולוגיית Snap Chip לאימונואסאי סנדוויץ' מרובב ללא תגובתיות צולבת

סרטון זה מדגים זיהוי חיידקי כמותי מרובה באמצעות מיקרוספרות פוליסטירן מגנטיות קרבוקסיליות הצבועות לקבוצות נפרדות. ההליך כולל היווצרות קומפלקסים של חיידקי חרוזים, הפרדה מגנטית ואנליזה מבוססת זרימה, המאפשרים כימות מדויק וסימולטני של מספר חיידקים באותה תגובה היטב.

זיהוי כמותי של חיידקים באמצעות מיקרוספרות מגנטיות עם תווית צבע

סמנים ביולוגיים למדידה בדגימות ביולוגיות מורכבות יותר ויותר מנחים את קבלת החלטות קליניות. אנו מתארים שיטה רגישה ביותר למדידה בו זמנית לב שרירן מחייב חלבון-C, מגה קריאטין קינאז, וטרופונין לבי בדגימות סרום מנבדקים עם אוטם שריר הלב ונבדקים בריאים.

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

באקלים הנוכחי של משאבים נדירים, צצות טכנולוגיות חדשות המאפשרות לחוקרים לבצע מחקרים זולים יותר, מהירים יותר ומדויקים יותר. כאן אנו מתארים את הפיתוח של בדיקה חיסונית מרובת נוגדנים מבוססי רוק מבוססת חרוזים למדידת חשיפה אנושית למספר פתוגנים סביבתיים בו זמנית.

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

נדגים טכנולוגיה שבב snap לביצוע כריך מרובבת cross-reactivity ללא immunoassays על ידי הצמדת פשוט שתי שקופיות. מנגנון הצמדה משמש באופן אמין מבנק ריאגנטים microarray-כדי-microarray. השבב הצמד יכול לשמש עבור כל התגובות הביוכימי הדורש colocalization של ריאגנטים שונים ללא זיהום צולב.

הצמד הצ'יפ בשביל כריך מרובבת Cross-reactivity חופשי ונטול שהמשגיח Immunoassays

אנו מדגמים בדיקת ECL כפולה פשוטה המשלבת 7 מבחני נוגדנים עצמיים יחד. הבדיקה מסוגלת לבצע סינון ל-T1D ולמחלות אוטואימוניות רבות אחרות, בו זמנית, כולל צליאק, מחלת בלוטת התריס אוטואימונית ותסמונת פוליגלנדולרית אוטואימונית 1.

בדיקת אלקטרוכמילומינסנציה בתפוקה גבוהה של 7 פלקס לבדיקה בו-זמנית של סוכרת מסוג 1 ומחלות אוטואימוניות מרובות

מערכת ניתוח זרימה לבדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים המספקת קריאה של שני עיתונאים שימשה לפיתוח בדיקות נטרול סרולוגיות ונוגדנים מולטיפלקס שיכולות למדוד בו זמנית נוגדני IgG ו- IgM מנטרלים עבור SARS-CoV-2.

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

בהתאם לצורך הדחוף בבדיקות סקר לסוכרת מסוג 1, צליאק ומחלת קורונה 2019, פיתחנו בדיקת אלקטרוכמילומינסנציה בתפוקה גבוהה של 6-Plex כדי לזהות בו זמנית את כל ארבעת הנוגדנים העצמיים של האיונים, נוגדנים עצמיים של רקמות טרנסגלוטמינאז, ונוגדנים לתחום קשירת הקולטן של תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2.

הקרנה מרובת תפוקה גבוהה לסוכרת מסוג 1, מחלות צליאק ו-COVID-19

מערכת ניתוח זרימה פלואורסצנטית דו-ערוצית בעלת שלושה ערוצים שימשה לפיתוח מערכת חיסון מרובת חרוזים המבצעת בו זמנית דגימות סרום עבור IgG ו- IgM שהופקו כנגד אנטיגנים מרובים של מיני בורליה שונים הגורמים לבורליוזיס ליים באירופה ובצפון אמריקה.

זיהוי סימולטני של סוגי נוגדנים שונים בבדיקה סרולוגית מרובת משתתפים

למדו כיצד להמיר שיטת ELISA לפלטפורמת Luminex xMAP לזיהוי ציטוקין TNF Alpha. השיטה מאפשרת בדיקה מרובת נוגדנים בו-זמנית עם רגישות וטווח דינמי משופרים לעומת ELISA סטנדרטית.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

גלה סרטונים נוספים