המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להמיר בדיקת אלייזה מותאמת מראש לציטוקין TNF אלפא לפלטפורמת Xap תוך הערכת זוגות נוגדנים חלופיים. זה מושג על ידי צימוד נוגדן הלכידה מערכת ELIZA, יחד עם שלושה נוגדנים מועמדים אחרים ללכידה לארבע ערכות מיקרוספרה או חרוזים שונות כאשר הם מעורבבים יחד. ארבעת הסטים הללו מאפשרים בדיקה בו-זמנית של כל ארבעת המועמדים עם ארבעה נוגדנים לזיהוי נפרדים כדי לקבוע את זוג הנוגדנים הטוב ביותר.

שני מבחני ה-Xap הבאים נבנים עם שני זוגות הנוגדנים האופטימליים ביותר. לאחר מכן משווים את ביצועי הבדיקות לאלה של בדיקת EISA המקורית ביחס לעוצמת האות, הטווח הדינמי והרגישות. התוצאות מראות כי נוגדנים דומים יכולים לתפקד בצורה שונה מאוד באותם תנאים וכי ניתן לסנן מספר נוגדנים בו זמנית באמצעות בדיקת Luminex Xap החושפת כי הבדיקה הגדילה את הרגישות והטווח הדינמי בהשוואה ל-EISA.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו EIS A הוא שבדיקות אימונולוגיות מבוססות xap מאפשרות לחוקר לבדוק מספר מטרות, או כמו במקרה זה, לבדוק מספר נוגדנים בו זמנית. לזהות את הנוגדן הטוב ביותר שהודגם. ההליך יהיה אריקה לופז, מדענית שותפה בתאגיד לומינקס.

התחל פרוטוקול זה בבחירה והכנה של ארבעה נוגדנים ללכידה וארבעה נוגדנים לזיהוי ספציפיים ל-TNF אלפא אנושי כמתואר בפרוטוקול הכתוב. כמו כן, הכינו נוגדן אישור אחד ספציפי למין המארח של נוגדני הלכידה. הביאו את הריאגנטים בערכת צימוד הנוגדנים לטמפרטורת החדר.

סמן ארבעה צינורות תגובה עם מספרי אזור החרוזים שנבחרו לתגובת הצימוד. העבירו את תכולת ארבעת הבקבוקונים של מיקרוספירות מג פלקס לארבעת צינורות התגובה המסומנים בארגון. שטפו כל אחת מערכות החרוזים פעמיים ב-500 מיקרוליטר של מאגר הפעלה והפעילו כל ערכת חרוזים עם תמיסות הסולף ONHS ו-EDC כמתואר בערכת צימוד הנוגדנים.

מדריך למשתמש לאחר דגירה של 20 דקות על מסובב, חזור על שלב הכביסה הקודם עם החרוזים המופעלים כעת בסך הכל שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר הפעלה. לכל שטיפה הכינו ארבע תמיסות נפרדות של 500 מיקרוליטר. כל אחד מהם מכיל 7.5 מיקרוגרם של מאגר השבתת נוגדנים לכידה.

הוסף את ארבעת פתרונות הנוגדנים הללו לצינורות התגובה שלהם. מערבל כל צינור מיד ודוגר במשך שעתיים על מסובב. חזור על שלב הכביסה עם החרוזים הזוגיים כעת בסך הכל שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר הכביסה הכלול בערכת צימוד הנוגדנים.

לאחר שלב הכביסה האחרון, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל צינור תגובה כדי לספק ריכוז מלאי סופי של 5 מיליון חרוזים מצומדים נוגדנים למערבולת מיליליטר, ולאחר מכן סוניקציה של צינורות התגובה כדי לפזר את החרוזים. ספרו את מספר החרוזים שהתאוששו לאחר תגובת הצימוד באמצעות מונה תאים או ציטומטר המו. ההתאוששות מתגובת הצימוד היא בדרך כלל מעל 90%אשר שתגובת הצימוד הייתה מוצלחת על ידי הכנת פתרונות בדיקה של מלאי החרוזים המצומדים עבור כל סט עם ריכוז סופי של 100 חרוזים למיקרוליטר במאגר בדיקה, הכן דילול של מיני האנטיס של FICO המסומן בסימן.

נוגדן אישור IgG בארבעה מיקרוגרם למיליליטר במאגר בדיקה מביא 50 מיקרוליטר מכל תמיסת בדיקה לארבע בארות של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות בסך הכל 16 בארות. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לשמונה מהבארות כדי למדוד רקע ו-50 מיקרוליטר של נוגדן אישור מדולל לשמונה הבארות הנותרות. מערבבים את התגובות בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים בעזרת פיפטר רב ערוצי.

מכסים את הצלחת ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר צלחת. הנח את הצלחת על מפריד צלחת מגנטי למשך דקה עד שתיים כדי להוציא את החרוזים מהתמיסה. לאחר מכן הסר את הנוזל על ידי היפוך הצלחת בכוח בזמן המפריד מעל מיכל פסולת.

שטפו כל באר פעמיים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה והוצאת ה-SANE מהצלחת בצורה דומה. באמצעות מפריד הלוחות המגנטי השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה חמש פעמים עם פיפטר רב ערוצי. נתח על מכשיר luminex xap כגון מכשיר magix.

עוצמת האות הפלואורסצנטי של תגובה זו עומדת ביחס ישר לכמות החלבון על פני החרוזים, ומספקת הערכה מהירה של הכמות היחסית של החלבון המחובר לחרוזים. כדי לקבוע את זוג הנוגדנים היעיל ביותר במבחן ה-xap, הכינו תערובת ראשונית של כל ארבעת ערכות החרוזים על ידי הוספת 10 מיקרוליטר מכל אחד ל-0.96 מיליליטר של מאגר הבדיקה. הכן את תמיסות הנוגדנים לזיהוי על ידי דילול כל נוגדן למיקרוגרם אחד למיליליטר במאגר הבדיקה.

גם מאגר בדיקה. הכן את תקן חלבון אלפא TNF של מערכות מו"ר ו-d ב-2000 פיקוגרם למיליליטר ודלל את ה-Streptavidin R FICO eryn לשמונה מיקרוגרם למיליליטר. הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת החרוזים המצומדת לנוגדנים לכל אחת מ-16 הבארות של צלחת 96 בארות תחתונה עגולה של CoStar לבדיקת הסינון.

לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לשמונה מתוך 16 הבארות כדי למדוד רקע. לאחר מכן פיפטה 50 מיקרוליטר מתקן TNF אלפא לשמונה הבארות האחרות כדי למדוד את התגובה. דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור תוך כדי ניעור על שייקר צלחת בדיקה.

לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר מכל אחד מארבעת נוגדני הזיהוי לארבע בארות, שתיים מהן בארות רקע, ושתיים הן בארות תגובה. דגירה למשך 30 דקות באותם תנאים לאחר הוספת 50 מיקרוליטר של מגיב SAPE לכל הבארות. דגירה שוב למשך 15 דקות באותם תנאים.

הנח את הצלחת על מפריד צלחת מגנטית למשך דקה אחת. לאחר מכן הסר את הנוזל על ידי היפוך הצלחת בכוח בזמן המפריד מעל מיכל פסולת. פיפטה 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל אחת מ-16 הבארות.

לאחר מכן הסר את הנוזל מהחרוזים באמצעות הפרדה מגנטית. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל אחת מ-16 הבארות. קרא את הצלחת עם מכשיר הבחירה של Luminex mag המתייחס למדריך למשתמש להפעלה תקינה.

בחר זוג נוגדנים העונה על עוצמת האות הרצויה. לאחר בחירת הטוב ביותר ללכידת נוגדנים, יש לדלל 100 מיקרוליטר של הנוגדן יחד עם מלאי פעימות ל-10 מיליליטר עם מאגר בדיקה. הוסף 50 מיקרוליטר מהחרוזים המדוללים ל -78 בארות של שתי צלחות תחתונות עגולות של CoStar 96 בארות.

כל לוחית תשמש להערכת הביצועים של נוגדן זיהוי אחר. לאחר מכן, הכינו עקומה סטנדרטית של 12 נקודות המתחילה ב-8,000 פיקוגרם למיליליטר ומסתיימת ב-4 פיקוגרמים למיליליטר. עם מערכות המו"פ.

תקן TNF Alpha מוסיף שש שכפולים של 50 מיקרוליטר מכל דילול לכל אחת מהלוחות, בתוספת שש בארות עם 50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה כל אחת כרקע בסך הכל 78 בארות לצלחת. דגרו את הצלחות למשך שעה בטמפרטורת החדר מוגנות מפני אור תוך כדי ניעור על שייקר צלחת בדיקה. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של נוגדן הזיהוי הראשון לכל 78 הבארות של הצלחת הראשונה.

חזור על הפעולה עבור נוגדן הזיהוי השני בצלחת השנייה. דגרו את הצלחות למשך 30 דקות באותם תנאים. לאחר מכן הוסף את 50 המיקרוליטר של מגיב SAPE לכל הבארות של כל צלחת.

לאחר ניעור שתי הלוחות למשך 15 דקות מוגנות מפני אור, הנח את הלוחות על מפרידי לוחות מגנטיים למשך דקה אחת. הסר את הנוזל על ידי היפוך בכוח של הצלחת כשהוא על המפריד מעל מיכל פסולת. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל אחת מ-78 הבארות על הצלחות לפני הוצאת הנוזל מהחרוזים המגנטיים היא לפני.

לאחר הוספת מאות מיקרוליטר של מאגר בדיקה לחרוזים בכל אחת מ-78 הבארות שעל הצלחות, נתח את הלוחות במכשיר בחירת המג תוך התייחסות למדריך למשתמש להפעלה תקינה. בהתאם להוראות הכלולות במערכות ה-R וה-D, TNF Alpha T NF SF אנושי אחד ערכת DUO סט ELI A. מדוד את התגובה שנוצרת על ידי התקן המסופק עם ערכת המו"ר והפיתוח.

חזור על בדיקת ה-ELI שלוש פעמים נוספות והחלף את מערכות ה-R וה-D ללכוד ולזהות נוגדנים בנוגדנים של הספקים האחרים. לשם הפשטות, התאימו את הנוגדנים לפי הספק, העריכו כל זוג באופן עצמאי כנדרש בפורמט EISA עם כל אחד משלושת תקני החלבון TNF Alpha. מבחני Luminex Xap בוצעו כמולטיפלקס כדי להעריך את כל ארבעת נוגדני הלכידה כתערובת על ידי שילוב של ארבע קבוצות של נוגדני אלפא TNF יחד עם מיקרוספירות Mag PLX, נוגדני הלכידה הוערכו עם כל אחד מארבעת נוגדני הזיהוי הביוטיניים בנפרד, כך שניתן היה לקבוע את האינטראקציה של נוגדן זיהוי אחד עם כל אחד מארבעת נוגדני הלכידה בו זמנית.

התוצאות הצביעו על כך שזוג הנוגדנים ממערכת ה-DUO של מערכות r ו-d ביצע את הביצועים הטובים ביותר עם תגובה שהתקבלה ב-6,183 עוצמת פלואורסצנטיות חציונית או יחידות MFI. כמו כן, נצפה כי נוגדני הזיהוי מ-Millipore ו-ABAM סיפקו תגובה סבירה בבדיקת XAP כאשר בשילוב עם מערכות RD לוכדות נוגדנים, נוגדני הלכידה מ-Millipore, ACAM ו-Novus ייצרו תגובה פחות רצויה במבחן XAP. פרוטוקול הסט של מערכות r ו-d DUO שימש להשוואת ארבעת זוגות הנוגדנים בפורמט EISA.

פרוטוקול מערכות מו"פ ו-d שימש עם כל זוגות הנוגדנים מכיוון שהוא משקף פרוטוקולי EIA טיפוסיים הנמצאים בשימוש נרחב כיום, והוא מקביל לפרוטוקולים המשמשים בטכנולוגיית xap. בדיקות EISA הראו שזוג הנוגדנים ממערכות r ו-d שוב נתן את התוצאות הטובות ביותר. זוג הנוגדנים מ-Acam לא הפיק תגובה, וזוגות הנוגדנים מ-Millipore ו-Novas הפיקו תגובות צנועות על מנת להעריך כל שינוי בתגובתיות הנוגדנים.

עם התקן, כל ארבעת זוגות הנוגדנים נבדקו עם שלושה תקני חלבון אלפא TNF רקומביננטיים שונים משלושה ספקים שונים. הנתונים מראים כי תקני חלבון אלפא TNF רקומביננטי משלושת הספקים נתנו תוצאות שוות. חלבון האלפא TNF ממערכות r ו-d שימש ליצירת עקומות סטנדרטיות עם מבחני ELSA ו-XAP.

בעוד שבדיקת ELI A נעשתה עם זוג הנוגדנים של מערכת r ו-d, מבחני ה-xap השתמשו בנוגדני הלכידה של מערכת r ו-d ונוגדני הזיהוי ממערכות r ו-d או Millipore. חלבון האלפא TNF ממערכות r ו-d דולל כדי לייצר טווח ריכוזים מ-8,000 עד 4 פיקוגרם למיליליטר בלבד. זוג הנוגדנים ממערכות r ו-d הניב את התוצאה הצפויה בבדיקת Xap עם תגובה גדולה מ-20,000 MFI כפי שהוצג.

כאשר נעשה שימוש בנוגדני הזיהוי מ-Millipore עם בדיקת Xap במקום נוגדן הזיהוי של מערכות r ו-d, התגובה הייתה כ-30% מהתגובה שהתקבלה עם נוגדן הזיהוי ממערכות RD. הקו הירוק בתרשים זה מייצג את העקומה הסטנדרטית של ה-ELA, עם טווח TNF אלפא המומלץ על ידי היצרן של 16 עד 1000 פיקוגרם למיליליטר. בשל מגבלת הספקטרופוטומטר, לא ניתן היה להגדיל את טווח בדיקת אליזה.

יתר על כן, הטווח הדינמי והרגישות של שתי השיטות מומחשים טוב יותר כאשר הם משורטטים בסולם לוג. ניתן לראות הבחנה ברורה בין שיפוע תגובת ה-EISA לבין התגובות ממבחני ה-xap ומצביעה עוד יותר על יכולת מגבילה יותר לזיהוי TNF alpha עם EL iza בריכוזים גבוהים ונמוכים כאחד. גבולות הזיהוי או ה-LOD עבור שתי מבחני TNF alpha xap הפונקציונליים הוערכו על ידי זיהוי ריכוז האלפא הנמוך ביותר של TNF עם רמת תגובה נצפית גדולה מהרקע, בתוספת סטיית התקן או SD פי שלושה משישה שכפולים.

כאן ניתן לראות שכאשר משתמשים בצמד מערכות r ו-d, ריכוז האלפא הנמוך ביותר של TNF ב-3.91 פיקוגרם למיליליטר ייצר תגובה של 66 MFI, שהיא גדולה יותר מהתגובה לרקע פלוס שלוש פגישות SD. קריטריון זה. כאשר נעשה שימוש בנוגדנים לזיהוי מיליפורי עם מערכות ה-r וה-d, גבול הזיהוי היה פחות מ-7.81 פיקוגרם למיליליטר.

במקרה זה, ריכוז האלפא השני הנמוך ביותר של TNF נוצר בתגובה מקובלת של 17 MFI גדול מהתגובה של ריכוז האלפא הנמוך ביותר של TNF בתוספת פי שלושה מסטיית התקן שלו. באופן דומה, מגבלת הזיהוי עבור קבוצת צמד מערכות r ו-d אלייזה הוערכה בין 63 ל-31 פיקוגרם למיליליטר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שלבים אחרים כמו בדיקה, מטריצות דגימה שונות או ריכוזי נוגדנים במדווח על מנת לייעל עוד יותר את בדיקת ה-xap.