הערכה תפקודית של תנועתיות מעיים ודלקת דופן מעי במכרסמים: ניתוח בדגם סטנדרטי של מניפולצית מעיים
11 בספטמבר 2012
ileus לאחר הניתוח (POI) הוא סיבוך של ניתוח בטן מוביל לתחלואה ואשפוז ממושך. בגלל אסטרטגיות מניעות או טיפול חסרות מחקר התעצם הוא הכרחי. לכן הקמנו מודל עכבר סטנדרטי וריאלי כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של POI וללמוד אפשרויות טיפוליות פוטנציאליות.
המטרה הכללית של הניסויים הבאים היא לבצע מניפולציה של המעי כדי לחקור את ההתפתחות וההחלמה של איליאוס לאחר ניתוח (postoperative ileus) במודל של מכרסמים; זאת מושג על ידי מניפולציה סטנדרטית של המעי הדק בין שני מapplicators של צמר גפן לחים. לאחר מכן, מנותחים מעבר בדרכי העיכול ובמעי הגס כדי למדוד את התנועתיות לאחר הניתוח. לבסוף, מבוצעים ניתוח היסטוכימי ותרבית איברים של השכבה השרירית החיצונית (muscularis externa) של המעי הדק כדי לבחון את רמות הדלקת.
התוצאות המתקבלות מראות חדירה חזקה של גרנולוציטים נויטרופיליים לתוך ה-me וייצור עודף של חמצן חנקני (nitric oxide) בתרביתי me, הגורמים לעיכובים בזמני המעבר במערכת העיכול ובמעי הגס. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח הנוגעות להתפתחות ולפתרון של איליאוס לאחר ניתוח, ובבחינת מניעה או טיפול פוטנציאליים. את הפרוצדורה ידגים מריו לווייסון, טכנאי מהמעבדה שלנו. לאחר מתן 0.8 עד 1% isoflurane בחמצן לעכבר זכר, הנח את החיה במצב שכיבה על הגב והשתמש בסרט דביק כדי לקבע את הגפיים.
השתמש בגירוי כאב קל כדי לבדוק סדציה עמוקה. לאחר מכן, בצע לפרוטומיה חצצית (median laparotomy) באורך של שני סנטימטרים. בשלב הבא, הכנס שני רטרקטורים סטריליים כדי להשאיר את הבטן פתוחה, הוצא בזהירות את המעי הדק שמאלה והנח אותו על גזה מכותנה רטובה.
בעזרת שני מקלוני צמר לחים, רוקנו את תכני הלומן של כל המעי הדק על ידי גלגול סימולטני של המקלונים מהפורי (pori) אל העקום (cecum). החזירו את המעי לחלל הפריטונאום ללא פיתול כדי למנוע איסכמיה או חסימה מכנית, ובסגירת שתי שכבות של תפרי פוליאמיד לא-ספיגים רציפים במידה 5.0. סגרו את החתך הבטני.
הניחו את בעל החיים תחת מנורת חימום ועקבו אחריו עד להתאוששות מההרדמה. לאחר מכן, החזירו את העכבר לכלובו ואפשרו לו גישה למזון ולמים. למחרת.
לאחר הרדמה מלאה של העכבר, יש להרחיב בזהירות את ראשו ולהשתמש בפינצטה קהה כדי לשלוף את הלשון. מלאו מזרק של 1 ml לפחות ב-100 µL של dextran מסומן בفلואוריסצאין. חברו את המזרק לקטטר עורקי והחדירו בזהירות את הקטטר כסונדה קיבבית אל תוך הקיבה. הזריקו במהירות 100 µL של FITC dextran והוציאו את הקטטר.
אפשרו לבעל החיים להתעורר והמתינו 90 דקות. לאחר 90 הדקות, בצעו המתת חסד לעכבר והוציאו את כל מערכת העיכול מהקיבה ועד לרקטום. הניחו את המעי על משטח פוליסטירן והימנעו ממתיחה.
בשלב הבא, מדדו את האורך המלא של המעי הדק ואת המעי הגס. השתמשו בקנולות כדי לקבע את המעיים למסדי הפוליסטירן. חלקו את המעי הדק ל-10 מקטעים שווים ואת המעי הגס לשלושה מקטעים שווים.
לאחר חיתוך המעי בנקודות הסימון, שטפו את המקטעים פעם אחת עם 1 mL של Krebs halei, bicarbonate buffer, או KHB. העבירו את המקטעים למבחנות של 2 mL המסומנות ברצף, ובצעו ערבוב חזק במכשיר vortex ולאחר מכן צנטריפוגה של הדגימות. לאחר מכן, העבירו את העל-נוזל (supernatant) למבחנות נקיות ומסומנות של 1.5 mL.
יש לאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לניתוח. בשלב הבא, יש להעביר בפיפטה מנות כפולות של 100 µL מכל עליית הנוזל (supernatant) לתוך פלטת 96 בארות שחורה, ולהשתמש בקורא פלואורסצנציה לקריאת הפלטה לצורך בדיקת זמן מעבר מעי הגס לאחר הרדמה שבועית של החיה.
בדקו בקפידה את פתוחות המעי הגס על ידי החדרת פיסטולה. השתמשו בחוטב (probe) כדי לחלול דרך פי הטבעת אל המעי הגס. הכניסו כדור זכוכית בקוטר שני מילימטרים, למרחק של שלושה סנטימטרים לתוך המעי הגס, והוציאו את החוטב.
הפעילו טיימר באופן מיידי. הניחו את העכבר בכלוב שקוף ועקבו אחריו במשך הזמן שיידרש עד להפרשת הכדור. לצורך ניתוח היסטוכימי של דגימות מהחלק האמצעי של המעי הגס.
לאחר חיתוך מקטעי רקמה מהמעי והטבלתם ב-KHB קר בצלחת ממולאת סיליקון, השתמשו במחטי חרקים כדי להקבע את קרום הבטן (mesentery) לצלחת. חתכו את המקטעים לאורכו של הגבול המזנטרי ומתוחו את הרקמה ל-120% מאורכה ומרוחבה. קבעו את הרקמה בעזרת מחטים, החל מהמזנטריום, באופן מכני.
הפרידו את ה-muscularis externa או את ה-me מה-tunica mucosa. קבעו וצבעו את הדגימות בהתאם לחלק הכתוב של פרוטוקול זה לתרבית. ה-me.
24 שעות לאחר הליך המניפולציה של המעי, יש להסיר את כל המעי הדק ולהניח אותו ב-KHB קר המכיל penicillin, G ו-streptomycin. חתכו את המעי למקטעים באורך שלושה סנטימטרים והצמידו כל מקטע לצלחת זכוכית מצופה סיליקון באמצעות מספריים עדינים. הסירו את הקהריון והשחילו את המעי על מחט תמיכה (nodding needle) בעזרת פינצטה חדה.
חתוך בעדינות את ה-ME באמצעות מקלון לח. הפשט אותו מהסוב-מוקוזה והנח אותו ב-KHB קר בתוספת Ps. לאחר מכן, חתוך את רצועות ה-ME לחתיכות באורך של שני עד ארבעה מילימטרים והדגרה אותן ב-KHB קר מאוד בתוספת PS למשך 30 דקות. שטוף את הדגימה מספר פעמים.
לאחר מכן, העבירו כ-50 עד 60 milligrams של הרקמה לפלטה סטרילית בעלת 24 בארות המכילה 500 µL של DMEM. הדגירו את הרקמה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך 24 שעות. אספו את העל-נוזל (supernatant) וסובבו אותו בצנטריפוגה ב-1000 RCF למשך חמש דקות.
לאחר מכן, קפיאו את הרקמה באופן מהיר (snap freeze) בחנקן נוזלי לצורך מדידות של ציטוקינים או חמצן חנקתי (nitric oxide). לבסוף, ייבשו את רקמת השריר במשך 30 שניות באמצעות נייר סופג נקי ולאחר מכן שקלו אותה. הפרמטר החשוב ביותר להערכת חומרת האיליאוס לאחר ניתוח הוא בדיקת מעבר גסטרואינטסטינלי (GIT) in vivo.
איור זה מדגים התפלגות טיפוסית של FITC dextran לאורך דרכי העיכול בביקורות שלא טופלו ובעכברים שעברו מניפולציה של המעי 24 שעות לאחר הניתוח. כפי שמוצג כאן, בעקבי ניתוח דמה נצפה מערכת עיכול תקינה עם מרכז גאומטרי מחושב בצאקום. בעוד ש-Im הוביל לעיכוב משמעותי בריקון מערכת העיכול ביהנוני הפרוקסימלי, בניתוח מוטיליות המעי הגס באמצעות כדור זכוכית, עכברי ניתוח דמה הפרישו את הכדור תוך 48 עד 200 שניות, ו-Im האריך את זמן ההפרשה ל-470 עד 775 שניות למדידת הדלקת.
בתוך ה-ME נותחו רמות הלוקוציטים באמצעות היסטוכימיה או אימונוהיסטוכימיה, כפי שניתן לראות כאן. נצפו מעט נויטרופילים פולימורפנוקלאריים בעכברי ביקורת, עם זאת, דלקת במעי הדק הובילה לחדירה חזקה שלהם. רבים מהמתווכים הדלקתיים המשתחררים מהתאים קשים לזיהוי ברקמה.
תרביות של ליזאטים של איברים מאפשרות זיהוי של סמני דלקת בתרבית. נוזל העל, מתווך מייצג ב-POI, הוא nitric oxide, או nno, המהווה מוליך עצבי מעכב מרכזי במערכת העיכול. איור זה מראה כי לא ניתן היה לזהות nno ב-me.
בתרביות איברים, בתמלילי-על של ביקורת ובבעלי חיים בעכברים שעברו ניתוח דמה (sham), נצפו רמות nno בסיסיות. עם זאת, תרביות של עכברים שעברו מניפולציה מעיתית ייצרו משמעותית יותר nno לאחר דגירה של 24 שעות. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצע מניפולציה מעיתית זו תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשרות איליאוס לאחר ניתוח בעכברים וכיצד לנתח את חומרת המצב.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים מודל מכרסמים סטנדרטי למחקר של איליאוס לאחר ניתוח (POI) באמצעות מניפולציה של המעי (IM), תוך התמקדות בדלקת בשכבת השריר החיצונית (ME) והשפעתה על מוטיליות מערכת העיכול. הפרוטוקול כולל הערכה in vivo של מעבר תוך-מעי ומעבר קולוני, כמו גם שיטות להפרדה ולניתוח של ה-ME כדי להבחין בין תגובות דלקתיות במדורים שונים של דופן המעי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- פיזיולוגיה של מערכת העיכול
- אימונולוגיה
- מודלים חייתיים של מחלות
רקע
- דלקת של מערכת העיכול מעורבת במגוון מחלות בבני אדם.
- השריר החיצוני (muscularis externa - ME) הוא שכבה בעלת יכולת חיסונית גבוהה של דופן המעי, המכילה תאי מערכת חיסון תורשניים.
- איליאוס לאחר ניתוח (Postoperative ileus - POI) הוא סיבוך שכיח לאחר ניתוח בבטן, המאופיין בחוסר תנועתיות ממושכת של המעי עקב דלקת, במיוחד ב-ME.
- מתווכי דלקת כגון IL-6, IL-1β וחמצן חנקני (NO) מעורבים בפתוגנזה של POI.
מטרת המחקר
- להקים ולהדגים מודל מכרסמים הניתן לשחזור של POI באמצעות מניפולציה מעית.
- להעריך את מעבר התוכן במערכת העיכול ובמעי הגס כמדדים למוטיליות לאחר ניתוח.
- לאפשר ניתוח אימונולוגי של ה-ME וה-tunica mucosa, תוך הבחנה בין התגובות הדלקתיות שלהם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מניפולציה סטנדרטית של המעי הדק בעכברים תחת הרדמה באמצעות מקלוני צמר גפן לחים.
- הערכת מעבר במערכת העיכול באמצעות מתן FITC-dextran דרך הפה וניתוח מקטעי של נתיב ה-GI בעקבות זאת.
- מדידת מעבר במעי הגס באמצעות הכנסה ומדידת זמן ההפרשה של כדור זכוכית.
- הפרדה של ה-ME מה-tunica mucosa לצורך ניתוחים היסטוכימיים, אימונוהיסטוכימיים וניתוחי תרבית איברים.
- מדידה של סממנים דלקתיים, כולל חדירת לוקוציטים וייצור של nitric oxide, בתרביות ME.
תוצאות עיקריות
- מניפולציה של המעי הובילה לעיכובים משמעותיים הן במעבר במערכת העיכול והן במעבר במעי הגס בהשוואה לקבוצות הביקורת.
- נצפתה חדירה חזקה של גרנולוציטים נויטרופיליים ב-ME בעקבות IM.
- תרביות איברים של ME מעכברים שעברו מניפולציה הפיקו רמות גבוהות משמעותית של חנקן חמצני לאחר 24 שעות בהשוואה לקבוצות הביקורה ובעלי חיים שעברו ניתוח דמה.
- ממצאים אלו מאשרים את תפקידה של הדלקת ב-ME בפיתוח ובשימור של POI.
מסקנות
- המודל המתואר משרה באופן מהימן POI ומאפשר ניתוח מפורט של תהליכים דלקתיים בדופן המעי.
- הפרדה וניתוח של ה-ME חיוניים להבנת תגובות חיסוניות ספציפיות למדור.
- פרוטוקול זה ניתן להעברה למודלי מחקר אחרים הבודקים תפקוד ודלקת של מערכת העיכול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים סטנדרטיים של מכרסמים למניפולציות במעי מאפשרים הערכה קפדנית של מוטיליות המעי ודלקת ספציפית למדור, ובכך מספקים מידע ישיר לצורך תיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים עבור איליאוס לאחר ניתוח והפרעות גסטרו-אינטסטינליות קשורות. הערכה כמותית של מעבר גסטרו-אינטסטינלי וקולוני, לצד פרופיל אימונולוגי של ה-muscularis externa, תומכת בביטחון ניבוי של היפותיזות מכניסטיות וברציפות תרגומית במחקרים פרה-קליניים. גישה זו מחזקת את קבלת ההחלטות בניהול פורט폴יו על ידי הבהרת סיכון ביולוגי ונקודות סיום פונקציונליות בגילוי תרופות למערכת העיכול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולים דלקתיים ומנגנונים נוירומודולטוריים העומדים בבסיס איליאוס לאחר ניתוח.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי כימות חדירה של תאי מערכת החיסון ושחרור מדיאטורים ב-muscularis externa.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות מדידה ישירה של פגיעה בניידות ותוצרי דלקת.
- מספק פלטפורמה הניתנת לשחזור לצורך הערכה מונחית-השערה של התערבויות מועמדות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק קריאות in vivo מותקפות למעבר במערכת העיכול ובמעי הגס, התומכות בתהליכי סינון במורד הזרם.
- מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות מוטיליות כמותיות ונקודות קצה אימונולוגיות לצורך הדירות (reproducibility).
- מכין מערכות ביולוגיות להערכת תרכובות ניתנת להרחבה (scalable) המכוונת למוטיליות ודלקת במעי.
- תומך במוכנות של הבדיקה להשוואה בין התערבויות פרמקולוגיות וגנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים למנגנונים רלוונטיים למחלה שנצפו ב-postoperative ileus ובדלקת במעי.
- מבטיחה רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח ביומרקרים ספציפיים למדור.
- מספקת בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על נתונים כמותיים של מוטיליות ודלקת.
- מחזקת אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי הבחנה בין תגובות של הרירית לבין תגובות של ה-muscularis externa.
שילוב של תהליכי עבודה וקווי עיבוד
מודל זה משתלב ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, על ידי אספקת נקודות קצה תפקודיות ואימונולוגיות חסונות in vivo למחקר של מערכת העיכול.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מסלולים דלקתיים ונוירומודולטוריים בהפרעות של מוטיליות המעי.
- סריקה: מציע בדיקות מעבר ודלקת כמותיות וניתנות לשחזור לצורך הערכת מועמדים.
- אנליטיקה: מספק תוצרים מדידים כגון המרכז הגיאומטרי של התפלגות FITC-dextran וכמותיזציה של חנקה חמצנית (nitric oxide).
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה בין ממצאים פרה-קליניים לבין מאפיינים קליניים של איליאוס לאחר ניתוח.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פלטפורמה ניתנת להעברה למגוון מחקרי תפקוד דלקתי ומערכת העיכול.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תנועתיות המעי.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של בדיקות in vivo ו-ex vivo.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ויעילות הון על ידי הבהרה מוקדמת של הסיכון הביולוגי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של תוכניות טיפוליות למערכת העיכול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במודלים כירורגיים במכרסמים ובפיזיולוגיה של מערכת העיכול.
- מחייב גישה לקוראי פלואורסצנציה ותשתית היסטוכימית ואימונוהיסטוכימית.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים לבדיקות מוטיליות ומסעות אימונולוגיות.
- ניתן להתאמה לזני מכרסמים שונים ולמודלים של מחלות במערכת העיכול באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בהפרדה מדויקת של מדורי דופן המעי לצורך ניתוח ספציפי למדורים.
