בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS
1 בנובמבר 2007
בידוד של לימפוציטים באמצעות MACS Miltenyi ערכת מהווה דרך אמינה לטהר תאים שלמים homogenates רקמת הלימפה. תאים מטוהרים באמצעות מערכת Miltenyi הם בדרך כלל ≥ 96% טהור. הנה, אנחנו מדגימים את הצעדים שננקטו כדי לבודד תאים מסוג CD4 + T, אחת ערכות רבים המוצעים על ידי Miltenyi.
זהו מגנט Max MIDI. כתוב עליו, זהירות שדות מגנטיים חזקים ביותר. שלום, אני מלאני מתיו מהמעבדה של מייק קולינס באוניברסיטת קליפורניה ארווין, המחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה.
היום נדגים לכם הכנה של תאי T חיוביים ל-CD4 באמצעות ברירה שלילית (negative selection) תוך שימוש בערכות של Milton Biotechnology. כאן יש לנו את ה-minimax ואת ה-minimax magnets; ה-minimax משמש להפרדות גדולות יותר. ניתן להעביר עד 10⁹ תאים דרך עמודה המתאימה ל-minimax, ואילו ה-minimax magnets משמשים לנפחי תאים קטנים בהרבה.
לפיכך, בהתאם לשאלה אם אתם מבצעים הפרדה חיובית או שלילית, תסמנו את התאים באמצעות הנוגדן המתאים. על הנוגדנים יש חרוזים מגנטיים שייקשרו למגנט. במקרה של ברירה שלילית, התאים שמעניינכם יעברו דרך העמודה ותוכלו לאסוף את ה-EL pollutant, שיכיל את התאים המבוקשים.
עלי לציין שהטכניקות שאני מראה לכם הערב אינן סטריליות. לכן, אם ברצונכם להשתמש בתאים אלו לתרבית תאים, עליכם לבצע את כל הפעולות בתוך מabilis תרביות רקמה (tissue culture hood) עם מכשירים סטריליים. כך שמרغم העובדה שאני מראה לכם הכנה של תאי T חיוביים ל-CD4, רבות מהטכניקות הללו ישימות לטיהור של סוגי תאים אחרים באמצעות ערכות הביוטכנולוגיה של Miltenyi.
ובכן, הסרתי את קשרי הלימפה מהעכבר, ואני מראה לכם כיצד לעשות זאת בפירוט בגיליון שבעה של JoVE בנושא הכנת קשרי לימפה לדימות בפוטונים בודדים. כעת אני עומד לטחון את קשרי הלימפה לתליה של תאים בודדים בתוך מסנן תאים של 70 מיקרון. ובכן, כעת אטחון את קשרי הלימפה לתליה של תאים בודדים באמצעות גב של מזרק של 6 מיליליטר.
קשרי הלימפה נמצאים בתוך מסנן בתוך תמיסת RPMI, וחשוב להכין תרחיף תאים בודדים תקין. הסיבה לכך שאנו מבצעים זאת במסנן היא כדי לוודא שאין גושי תאים. לאחר סיום הריסוק, אוציא את המסנן מהמדיום ואשתמש בכול מה שעבר דרך המסננת כדי לקבל את תרחיף התאים הבודדים.
בעת הגריסה, יש לוודא שכל הרקמה מפורקת ככל האפשר. מתלי תאים בודדים זה הוא המקור ממנו נטהר את תאי ה-T החיוביים ל-CD4. טוב, סיימתי כעת לגרוס את הרקמה וניתן לראות שרוב קשרי הלימפה כמעט ואינם קיימים.
נותרו לנו עדיין חתיכות קטנות של שומן וסוג של קליפה של קשרי לימפה כאן, עם מעט רקמה חיברית, שכולם דבקו יחד מכל ששת קשרי הלימפה. וכעת אני מסיר את מסנני התאים. ניתן לראות כאן שהמדיה עכורה מאוד.
הוא מלא בתאים מתליה של תאים בודדים כדי להבטיח שנקבל את מספר התאים המקסימלי מהמסנן, שכן חלקם יידבקו אליו. אני שוטפת אותו עם מספר מיליליטרים של מצע, ולאחר מכן מעבירה בפיפט את כל המצע למבחנת Falcon של 15 ml ומסובבת אותה בצנטריפוגה כדי להשקיע את התאים לצורך טיהור מאוחר יותר. להלן תליה התאים הבודדים שלי, לאחר סבוב וסמיכה ב-300 G למשך 10 דקות.
אם אתם צופים לאוכלוסייה גבוהה של תאים מתים בתליה של התאים הבודדים שלכם, מומלץ להשתמש בערכה להסרת תאים מתים של Miltenyi Biotec. כעת, לאחר שהשגתי משקע (pellet), אני אשפוך את המצע ואבצע ליזיס של תאי דם אדומים, לאחר מכן אספור את התאים ואבצע על תאים ספציפיים אלו סלקציה שלילית של תאי T חיוביים ל-CD4 באמצעות ערכה מתאימה. אוקיי, עכשיו אני אבצע ליזיס של RBC.
אנו הולכים להמיס את תאי הדם האדומים שהשקענו יחד עם הלימפוציטים על ידי הפחתת האוסמולריות של התמיסה, תחילה באמצעות הוספת מים ולאחר מכן החזרתה לריכוז של 1x על ידי הוספת 10X-D-B-P-S. הלימפוציטים שלנו עמידים יותר לשינוי באוסמולריות מאשר תאי דם אדומים, אך עדיין עלינו לעבוד במהירות כדי למנוע את המסת הלימפוציטים, דבר שאיננו מעוניינים בו. חלק מהעבודה המהירה כולל הכנה מראש של הנפחים הדרושים להמסה לפני הוספת המים למערכת.
אני רוצה להוסיף את ה-10 X-D-B-P-S כמה שניות לאחר הוספת המים, כדי להבטיח שלא אגרום לליזיס של הלימפוציטים ושאבצע ליזיס לתאי הדם האדומים. לכן, אני לוקח 900 µL של מים, שזה כמעט מיליליטר, ו-100 µL של 10 X-D-B-P-S.
שני הפיפטים מוכנים לשימוש. בשלב הליזיס, אני מוסיף את המים, ממתין מספר שניות, אולי מנער מעט את המבחנה ואז מוסיף את ה-10 X-D-B-P-S, ומנער את המבחנה שוב. ואם אתם מבצעים ליזיס לכמות גדולה של תאי דם אדומים, תראו שנוצר מעין גוש אמורפי גדול של כל ממברנות התאים השבורות.
יש לנו כאן כמות קטנה, וניתן לראות שמדובר במעט ממברנות תאים שבורות. לכן, לאחר ביצוע הליזיס, למקרה שהייתה טעות בפיפטור, אני נוהג להוסיף מספר מיליליטרים של מצע לתאים כדי לוודא שהאוסמולריות תקינה ושלא תתרחש ליזיס נוספת. אוקיי, כעת יש לי את הלימפוציטים בתרחף של תאים בודדים.
שוב, ביצעתי את הליסיס של תאי הדם האדומים וכעת אספין אותם כדי ליצור משקע. לפני שאעשה זאת, אספור אותם באמצעות המוסימטר (hemo cytometer) כדי לקבוע כמה נוגדנים עלינו להוסיף עבור ערכת הסלקציה השלילית של תאי T חיוביים ל-CD4. אוקיי, כעת אני מספין את התאים בבופר Max, וניתן לראות שהמשקע לבן הרבה יותר לאחר ביצוע הליסיס של ה-RBC.
כעת אבצע סלקציה שלילית לתאי T חיוביים ל-CD4. לכן, אשפוך את כל המצע, את כל ה-max buffer שבו צנטריפוגתי את התאים. לאחר מכן, אסמן אותם באמצעות תערובת נוגדני הביוטין, שזהו השלב הראשון בסלקציה שלילית לתאי T חיוביים ל-CD4.
לאחר מכן אני מדגירה במקרר למשך 10 דקות. אוקיי, התאים שלי סיימו את הדגירה הראשונית. כעת אני אוסיף את האנטיביוטיקה למיקרובידס (microbeads) ואחזיר אותם למקרר למשך 15 דקות.
עבור הפרדה ספציפית זו של תאים, נשתמש בעמודת LS מבית Miltenyi Biotec; מה שנעשה הוא להניח אותה על המחזיק המגנטי ולהכין את העמודה על ידי העברת 3 mL של max buffer דרכה. נפתח את העמודה ונמקם אותה כך שהשיניים יפנו פנימה לכיוון המגנט. כעת אוסיף את ה-max buffer לעמודה, ותראו אותו יורד דרך עמודת ה-LS ומתחיל לטפטף מהחלק התחתון. אין צורך לחשוש מכך שהעמודה תתייבש.
מתח הפנים של הנוזל ימנע ממנו להתייבש עד להוספת התאים. לפני הוספת התאים, חשוב להמתין עד שהבופר MAX ייספג לחלוטין בעמודה. כעת, לאחר דגירה של 15 דקות עם חרוזי המגנט הביוטין שפיזרתי על התאים בבופר MAX, אשפוך את הבופר ואשחה אותם מחדש בכמות בופר המתאימה למספר התאים שלנו.
לכן תצטרכו לבדוק את הפרוטוקול של ה-milli tiny עבור זאת. כעת אני אעביר אותם לעמודה שזה עתה שطفנו עם max buffer. עכשיו נוסיף את תרחיף התאים לעמודה.
ומכיוון שזוהי עמודת ברירה שלילית, אנו נאסוף את התאים שעברו דרכה, ובמקרה זה, כולם אמורים להיות תאי T חיוביים ל-CD4. כעת אני שוטף את העמודה עם 12 ml של max buffer, ושוב, אנו אוספים את התסננת, שאמורה להכיל תאי T חיוביים ל-CD4 בלבד. כעת אני אסחרר את תאי ה-T החיוביים ל-CD4, אתלה אותם מחדש, ולאחר מכן אסמן אותם בצבע המתאים שבו אשתמש לצילום tau.
אני אקח גם מדגם קטן של התאים שזיקקתי, אסמן אותם עם anti CD three ו-anti CD four ואעביר אותם בבדיקת FACS כדי לוודא שיש לי אוכלוסייה נקייה של תאי T חיוביים ל-CD four. הנה מבט על התאים שסובבנו זה עתה. זו אמורה להיות אוכלוסייה טהורה של תאי T חיוביים ל-CD three ו-CD four.
כך הצגתי בפניכם את הברירה השלילית של תאי T חיוביים ל-CD4. באמצעות ערכת ה-Miltenyi Biotec, אנו נבצע העברה אדופטיבית של תאים אלו לעכבר ונשתמש בו באחד מניסויי ה-T Photon והמכונה שלנו. בהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את בידודם של תאי CD4+ T באמצעות ערכת Miltenyi MACs, שיטה מהימנה לטיהור לימפוציטים מהומוגנאטים של רקמות לימפואידיות שלמות. התהליך מניב תאים שהם בדרך כלל בדרגת טוהר של ≥ 96%.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- טכניקות לטיהור תאים
רקע
- בידוד לימפוקיטים הוא קריטי למחקרים אימונולוגיים שונים.
- ערכת Miltenyi MACs נמצאת בשימוש נרחב בשל יעילותה ואמינותה.
- תאי CD4+ T ממלאים תפקיד משמעותי בתגובה החיסונית.
- רמות טהרה גבוהות הן חיוניות ליישומים המשכיים.
מטרת המחקר
- להדגמת שיטת סלקציה שלילית לבידוד תאי CD4+ T.
- להדגשת היעילות של ערכת Miltenyi MACs.
- לספק מדריך שלב-אחר-שלב עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במגנטים מסוג Max MIDI להפרדת תאים.
- טכניקה להכנת ברירה שלילית.
- יישום של ערכות Miltenyi biotechnology.
- עיבוד של נפחים גדולים של תאים באמצעות עמודות ייעודיות.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי CD4+ T ברמת טוהר גבוהה.
- הדגמה של יעילות ערכת Miltenyi MACs.
- אספקת פרוטוקול מהימן עבור חוקרים.
- הדגמה של השימוש במגנטים להפרדה של תאים.
מסקנות
- ערכת Miltenyi MACs היא כלי יעיל לבידוד לימפוציטים.
- רמות טוהר גבוהות של תאים מבודדים משפרות את תוצאות הניסוי.
- ניתן ליישם שיטה זו במסגרות מחקר אימונולוגיות מגוונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בידוד של תאי CD4+ T בדרגת טוהר גבוהה מקשרי לימפה של עכברים מאפשר ביצוע מהימן של בדיקות אימונולוגיות המשך ומחקרי העברה אדופטיבית. פרוטוקול סלקציה שלילית זה, המשתמש בטכנולוגיית Miltenyi MACS, תומך בתיקוף של מטרות ובסריקה פנוטיפית על ידי אספקת תאי T פונקציונליים שלא עברו מגע (untouched) בדרגת טוהר של ≥96%. שיטה זו מפחיתה את השונות הניסויית ומגבירה את הביטחון החזוי במחקרים של אימונולוגיה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד תאי T מסוג CD4+ לצורך בדיקת היפותזות טיפוליות והבהרת מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מספק תאי T מסוג CD4+ נאיביים (naïve) שלא עברו מניפולציה, לצורך הערכת מעורבות המטרה ללא ארטיפקטים של הפעלה.
- ערך חיזוי: בידוד ברמת טוהרה גבוהה תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות אימונומודולטוריות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות ותוקפות עבור בדיקות תפקודיות ופרופיליל cytokines המשכיים.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות שמירה על טוהר התאים וחיוניותם באופן עקבי.
- יכולת הרחבה (Scalability): תאימות לעמודות LS לעיבוד מספרים גדולים של תאים, התומכת בסינון בעוצמה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטיות למחלה על ידי אספקת תאי CD4+ T ראשוניים מעכבר לצורך העברה אדופטיבית.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות הכנת תאים סטנדרטית.
- הפחתת סיכונים: מחזק את הביטחון החזוי בתוצאות הדימות והמדידות הפונקציונליות על ידי מזעור סוגי תאים מזוהמים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות מוקדם ועד למחקרי דימוי פרה-קליניים, במיוחד כאשר היא מקושרת לזרימות עבודה של כריתת קשרי לימפה ודימוי ב-2-פוטונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד תאי CD4+ T פונקציונליים למחקרי מנגנון.
- סינון (Screening): מספק תאים המוכנים לבדיקה עם פלטים כמותיים לצורך תיקוף בציטומטריה של זרימה ומדידות תפקודיות.
- אנליטיקה: מאפשר הערכת טוהר לאחר בידוד באמצעות FACS באמצעות צביעת CD3/CD4, ובכך תומך בקבלת החלטות מבוססות נתונים (go/no-go).
- מחקר תרגומי: מקשר לדמיון פרה-קליני באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T מבודדים למעקב in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לבידוד לימפוציטים לשימוש חוזר, הישימה בפרויקטים של אימונולוגיה ואימונו-אונקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במסלולים המתווכים על ידי תאי T.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של בידוד תאים ראשוניים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת של המשך או עצירה (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בפיתוח אימונומודולטורים.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטות על קידום מודגשים בסיכון, המבוססים על נתונים מהימנים של מעורבות המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעיבוד רקמות ראשוניות ובטכניקות הפרדת תאים מבוססות חרוזי מגנט.
- תלוי בעמודי Miltenyi LS, במחזיקים מגנטיים ובמערכות בופר מתאימות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך ספירת תאים עקבית, הערכת חיוניות ותיקוף FACS.
- שיקולי התאמה כוללים ביצוע סטרילי לעומת ביצוע לא סטרילי בהתאם לשימוש הסופי (למשל, תרבית תאים לעומת העברה אדופטיבית).
- מגבלות מעשיות כוללות לחץ תאי פוטנציאלי במהלך שלבי הגריסה והליזיס, דבר המחייב טיפול עדין לשמירה על החיוניות.
