בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS
1 בנובמבר 2007
בידוד של לימפוציטים באמצעות MACS Miltenyi ערכת מהווה דרך אמינה לטהר תאים שלמים homogenates רקמת הלימפה. תאים מטוהרים באמצעות מערכת Miltenyi הם בדרך כלל ≥ 96% טהור. הנה, אנחנו מדגימים את הצעדים שננקטו כדי לבודד תאים מסוג CD4 + T, אחת ערכות רבים המוצעים על ידי Miltenyi.
זהו מגנט Max MIDI. מצוין עליו: זהירות, שדות מגנטיים חזקים ביותר. שלום, אני מלאני מתיו מהמעבדה של מייק קולינס באוניברסיטת קליפורניה ארווין, מהמחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה.
היום נדגים הכנה של תאי T חיוביים ל-CD4 באמצעות סלקציה שלילית תוך שימוש בערכות של Milton Biotechnology. כאן יש לנו את ה-Minimax ואת ה-Minimags; ה-Minimax משמש להפרדות גדולות יותר, שבהן ניתן להעביר עד 10⁹ תאים דרך עמודה המתאימה ל-Minimax, בעוד שה-Minimags משמשים לנפחים קטנים בהרבה של תאים.
לכן, בהתאם לשאלה אם אתם מבצעים הפרדה חיובית או שלילית, תסמנו את התאים באמצעות הנוגדן המתאים. על הנוגדנים קיימים חרו지를 מגנטיים שייקשרו למגנט. במקרה של ברירה שלילית, התאים שאתם מעוניינים בהם יעברו דרך העמודה ותוכלו לאסוף את תרחיף השטיפה, שיכיל את התאים המבוקשים.
עלי לציין שהטכניקות שאני מראה לכם הלילה אינן סטריליות. לכן, אם ברצונכם להשתמש בתאים אלה לתרבית תאים, עליכם לבצע הכל במנדף לתרביות רקמה עם מכשירים סטריליים. כך שעל אף שאני מראה לכם הכנה של תאי T חיוביים ל-CD4, רבות מהטכניקות הללו ישימות לטיהור של סוגי תאים אחרים באמצעות ערכות הביוטכנולוגיה של Miltenyi.
בשלב זה, הסרתי את קשרי הלימפה מהעכבר, ואני מראה לכם כיצד לבצע זאת בפירוט בגיליון שבעה של JoVE: הכנת קשרי לימפה לדימוי דו-פוטוני. כעת אני עומד לדחוס את קשרי הלימפה לתלי תאים בודדים בתוך מסנני תאים של 70 micron. כעת אדחוס את קשרי הלימפה לתלי תאים בודדים באמצעות גבו של מזרק בנפח 6 mL.
הקשריות הלימפה נמצאות ב-RPMI בתוך מסנן, וחשוב ליצור תרחיף תאים בודדים תקין. הסיבה לכך שאנו מבצעים זאת במסנן היא כדי להבטיח שלא יהיו גושי תאים. לאחר שאסיים את הטחינה, אוציא את המסנן מהתווך ואשתמש בכל מה שעבר דרך המסננת כדי לקבל את תרחיף התאים הבודדים.
במהלך הגריסה, יש לוודא שכל הרקמה מפורקת באופן מקסימלי. מתלים של תאים בודדים אלו הם המקור ממנו נטהר את תאי ה-T החיוביים ל-CD4. כעת סיימתי לגרוס את הרקמה, וניתן לראות שמרבית קשרי הלימפה כמעט ואינם קיימים עוד.
נותרו לנו עדיין כמה פיסות קטנות של שומן וסוג של קליפה של קשרי לימפה כאן, יחד עם מעט רקמה חיבורית, שכולם נדבקו יחד מששת קשרי הלימפה. וכעת אני מסיר את מסנן התאים. ניתן לראות כאן שהתווך עכור מאוד.
הוא מלא בתאים מהתליה של תאי יחיד (single cell suspension) כדי להבטיח שנקבל את מספר התאים המקסימלי מהמסנן, שכן חלקם יידבקו אליו. אני שוטפת אותו עם מספר מיליליטרים של מדיום, ולאחר מכן מעבירה בפיפט את כל המדיום למבחנה מסוג Falcon של 15 מיליליטר ומסובבת אותה בצנטריפוגה כדי להשקיע את התאי למטרת טיהור מאוחר יותר. להלן תלית תאי היחיד שלי, לאחר סבוב בצנטריפוגה והשקעה ב-300 G למשך 10 דקות.
אם אתם מעריכים כי תהיה אוכלוסייה גבוהה של תאים מתים בסספנסיות התאים הבודדים שלכם, מומלץ להשתמש בערכה להסרת תאים מתים מבית Miltenyi Biotec. כעת, לאחר שהשקעתי את התאים בצנטריפוגה, אשפוך את המצע ואבצע ליזיס של תאי דם אדומים, ולאחר מכן אספור את התאים ואשתמש בערכה לברירה שלילית של תאי T חיוביים ל-CD4 עבור תאים ספציפיים אלו. אוקיי, כעת אבצע ליזיס של RBC.
אנו עומדים לבצע ליזיס לתאי הדם האדומים שהשקענו יחד עם הלימפוציטים על ידי הורדת האוסמולריות של התמיסה, תחילה באמצעות הוספת מים ולאחר מכן החזרתה לריכוז של 1x על ידי הוספת 10X-D-B-P-S. הלימפוציטים שלנו עמידים יותר לשינויים באוסמולריות מאשר תאי דם אדומים, אך עדיין עלינו לעבוד במהירות כדי למנוע ליזיס של הלימפוציטים, דבר שאינו רצוי. חלק מהעבודה המהירה כולל הכנה מראש של הנפחים הדרושים לליזיס לפני הוספת המים למערכת.
אני רוצה להוסיף את ה-10 X-D-B-P-S מספר שניות לאחר הוספת המים, כדי להבטיח שלא אגרום לליזיס של הלימפוציטים בעוד שאלייז את תאי הדם האדומים. לכן, אני לוקח 900 µL של מים, שזה כמעט מיליליטר, ו-100 µL של 10 X-D-B-P-S.
שתי הפעולות מוכנות לביצוע. בשלב הליזיס, אני מוסיף את המים, ממתין מספר שניות, אולי מנער מעט את המבחנה ואז מוסיף 10 X-D-B-P-S ומנער את המבחנה שוב. ואם אתם מבצעים ליזיס לכמות גדולה של תאי דם אדומים, תראו שנוצר גוש גדול ולא אמורפי של כל ממברנות התאים השבורות.
יש לנו כאן כמות קטנה ממנו, וניתן לראות שמדובר במעט ממברנות תא שבורות. לכן, לאחר ביצוע הליזיס, למקרה שהתרחשה טעות בפיפטור, אני נוהג להוסיף לתאים מספר מיליליטרים של מצע גידול כדי לוודא שהאוסמולריות נכונה ושלא נמשיך בתהליך הליזיס. אוקיי, כעת יש לי את הלימפוציטים בתרחיף של תאים בודדים.
שוב, ביצעתי את הליסיס של תאי הדם האדומים וכעת אני עומד לסובב אותם בצנטריפוגה כדי להשקיע אותם. לפני שאעשה זאת, אספור אותם באמצעות המוסימטר (hemo cytometer) כדי לקבוע כמה נוגדנים עלינו להוסיף עבור ערכת הבחירה השלילית של תאי T חיוביים ל-CD4. אוקיי, כעת אני סובב את התאים בבופר Max, וניתן לראות שהמשקוב לבן הרבה יותר לאחר שביצענו את הליסיס של ה-RBC.
כעת אבצע סלקציה שלילית עבור תאי T חיוביים ל-CD4. לכן, אני אשפוך את כל המדיום, את כל באפר ה-Max שבו השקעתי את התאים. לאחר מכן אסמן אותם באמצעות תערובת נוגדני הביוטין, שזהו השלב הראשון בסלקציה השלילית עבור תאי T חיוביים ל-CD4.
לאחר מכן אני מדגיר במקרר למשך 10 דקות. אוקיי, התאים שלי סיימו את הדגירה הראשונית שלהם. כעת אוסיף את האנטיביוטיקה למיקרו-בידס ואחזיר אותם למקרר למשך 15 דקות.
עבור הפרדת תאים ספציפית זו, אנו משתמשים בעמודת LS מבית Miltenyi Biotec, ומה שנעשה הוא להניח אותה על המחזיק המגנטי ולהכין את העמודה על ידי העברת 3 mL של max buffer דרכה. נפתח את העמודה ונניח אותה כך שהשיניים פונות פנימה אל המגנט. כעת אוסיף את ה-max buffer לעמודה, ותראו אותו יורד בעמודת ה-LS ומתחיל לטפטף מהחלק התחתון. אין לחשוש מכך שהעמודה תתייבש.
מתח הפנים של הנוזל ימנע ממנו להתייבש עד להוספת התאים. לפני הוספת התאים, חשוב לאפשר ל-max buffer לחלחל באופן מלא דרך העמודה. כעת, לאחר דגירה של 15 דקות עם חרוזי biotin מגנטיים שהספגתי על התאים ב-max buffer, אשפוך את הבאפר ואשחה אותם מחדש בכמות באפר המתאימה למספר התאים שלנו.
לכן תצטרכו לבדוק את הפרוטוקול של ה-milli tiny עבור זאת. ולאחר מכן אני אעביר אותם לעמודה ששטפנו זה עתה עם max buffer. כעת נוסיף את תרחיף התאים לעמודה.
ומכיוון שזוהי עמודת ברירה שלילית, נסוף את התאים שעברו דרכה, שבמקרה זה אמורים להיות כולם תאי T חיוביים ל-CD4. כעת אשטוף את העמודה עם 12 ml של max buffer, ושוב, נסוף את התמיסה היוצאת, שאמורה להכיל רק תאי T חיוביים ל-CD4. כעת אסחרב את תאי ה-T החיוביים ל-CD4, אתלה אותם מחדש, ולאחר מכן אסמן אותם בצבע המתאים שבו אשתמש לצורך דימוי tau.
אני עומד לקחת גם דגימה קטנה מהתאים שסיננתי ולסמן אותם עם anti CD three ו-anti CD four, ולהעביר אותם ב- FACS כדי לוודא שיש לי אוכלוסייה נקייה של תאי T חיוביים ל-CD four. הנה מבט על התאים שסובבנו הרגע בצנטריפוגה. זו אמורה להיות אוכלוסייה טהורה של תאי T חיוביים ל-CD three ו-CD four.
הרגע הצגתי בפניכם סלקציה שלילית של תאי T חיוביים ל-CD4. באמצעות ערכת Miltenyi Biotec, אנו נבצע העברה אדופטיבית של תאים אלו לעכבר ונשתמש בו עבור אחד מניסויי ה-T Photon machine שלנו. בהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את בידודם של תאי CD4+ T באמצעות ערכת Miltenyi MACs, שיטה מהימנה לטיהור לימפוציטים מהומוגנאטים של רקמות לימפואידיות שלמות. התהליך מניב תאים שהם בדרך כלל בדרגת טוהר של ≥ 96%.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- טכניקות לטיהור תאים
רקע
- בידוד לימפוקיטים הוא קריטי למחקרים אימונולוגיים שונים.
- ערכת Miltenyi MACs נמצאת בשימוש נרחב בשל יעילותה ואמינותה.
- תאי CD4+ T ממלאים תפקיד משמעותי בתגובה החיסונית.
- רמות טהרה גבוהות הן חיוניות ליישומים המשכיים.
מטרת המחקר
- להדגמת שיטת סלקציה שלילית לבידוד תאי CD4+ T.
- להדגשת היעילות של ערכת Miltenyi MACs.
- לספק מדריך שלב-אחר-שלב עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במגנטים מסוג Max MIDI להפרדת תאים.
- טכניקה להכנת ברירה שלילית.
- יישום של ערכות Miltenyi biotechnology.
- עיבוד של נפחים גדולים של תאים באמצעות עמודות ייעודיות.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי CD4+ T ברמת טוהר גבוהה.
- הדגמה של יעילות ערכת Miltenyi MACs.
- אספקת פרוטוקול מהימן עבור חוקרים.
- הדגמה של השימוש במגנטים להפרדה של תאים.
מסקנות
- ערכת Miltenyi MACs היא כלי יעיל לבידוד לימפוציטים.
- רמות טוהר גבוהות של תאים מבודדים משפרות את תוצאות הניסוי.
- ניתן ליישם שיטה זו במסגרות מחקר אימונולוגיות מגוונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בידוד של תאי CD4+ T בדרגת טוהר גבוהה מקשרי לימפה של עכברים מאפשר ביצוע מהימן של בדיקות אימונולוגיות המשך ומחקרי העברה אדופטיבית. פרוטוקול סלקציה שלילית זה, המשתמש בטכנולוגיית Miltenyi MACS, תומך בתיקוף של מטרות ובסריקה פנוטיפית על ידי אספקת תאי T פונקציונליים שלא עברו מגע (untouched) בדרגת טוהר של ≥96%. שיטה זו מפחיתה את השונות הניסויית ומגבירה את הביטחון החזוי במחקרים של אימונולוגיה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד תאי T מסוג CD4+ לצורך בדיקת היפותזות טיפוליות והבהרת מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מספק תאי T מסוג CD4+ נאיביים (naïve) שלא עברו מניפולציה, לצורך הערכת מעורבות המטרה ללא ארטיפקטים של הפעלה.
- ערך חיזוי: בידוד ברמת טוהרה גבוהה תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות אימונומודולטוריות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות ותוקפות עבור בדיקות תפקודיות ופרופיליל cytokines המשכיים.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות שמירה על טוהר התאים וחיוניותם באופן עקבי.
- יכולת הרחבה (Scalability): תאימות לעמודות LS לעיבוד מספרים גדולים של תאים, התומכת בסינון בעוצמה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטיות למחלה על ידי אספקת תאי CD4+ T ראשוניים מעכבר לצורך העברה אדופטיבית.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות הכנת תאים סטנדרטית.
- הפחתת סיכונים: מחזק את הביטחון החזוי בתוצאות הדימות והמדידות הפונקציונליות על ידי מזעור סוגי תאים מזוהמים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות מוקדם ועד למחקרי דימוי פרה-קליניים, במיוחד כאשר היא מקושרת לזרימות עבודה של כריתת קשרי לימפה ודימוי ב-2-פוטונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד תאי CD4+ T פונקציונליים למחקרי מנגנון.
- סינון (Screening): מספק תאים המוכנים לבדיקה עם פלטים כמותיים לצורך תיקוף בציטומטריה של זרימה ומדידות תפקודיות.
- אנליטיקה: מאפשר הערכת טוהר לאחר בידוד באמצעות FACS באמצעות צביעת CD3/CD4, ובכך תומך בקבלת החלטות מבוססות נתונים (go/no-go).
- מחקר תרגומי: מקשר לדמיון פרה-קליני באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T מבודדים למעקב in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לבידוד לימפוציטים לשימוש חוזר, הישימה בפרויקטים של אימונולוגיה ואימונו-אונקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במסלולים המתווכים על ידי תאי T.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של בידוד תאים ראשוניים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת של המשך או עצירה (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בפיתוח אימונומודולטורים.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטות על קידום מודגשים בסיכון, המבוססים על נתונים מהימנים של מעורבות המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעיבוד רקמות ראשוניות ובטכניקות הפרדת תאים מבוססות חרוזי מגנט.
- תלוי בעמודי Miltenyi LS, במחזיקים מגנטיים ובמערכות בופר מתאימות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך ספירת תאים עקבית, הערכת חיוניות ותיקוף FACS.
- שיקולי התאמה כוללים ביצוע סטרילי לעומת ביצוע לא סטרילי בהתאם לשימוש הסופי (למשל, תרבית תאים לעומת העברה אדופטיבית).
- מגבלות מעשיות כוללות לחץ תאי פוטנציאלי במהלך שלבי הגריסה והליזיס, דבר המחייב טיפול עדין לשמירה על החיוניות.
