מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

טכניקה סטנדרטית זו מייצרת כיסויים של זכוכית (cover slips) מצופים ג'לטין המסומן פלואורסצנטית, המתאימים לבדיקות כמותיות של פירוק מטריצה על ידי פודיה פולשניות (invadopodia). לאחר ציפוי הכיסויים בג'לטין המסומן פלואורסצנטית, זרע את התאים וטפח אותם לצורך פירוק המטריצה. לאחר מכן, קבע וצבע את התאים בפלואורסצנט עבור חלבוני סימון של פודיה פולשניות, רכוש את התמונות וכמת את פירוק המטריצה.

תוצאות טיפוסיות יכולות לכמת את ההבדלים בפירוק המטריקס המתווך על ידי podia בין תאים שעברו מניפולציה דיפרנציאלית של גנים נבחרים או טיפול בחומרים פרמקולוגיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת לוחות כיסוי מצופים בג'לטין עם פלואורסצנציה הומוגנית היא קשה להשגה בשל ציפוי לא אחיד של ג'לטין פלואורסצנטי או טיפול לא נכון בלוחות כיסוי מצופים בג'לטין. את הפרוצדורה ידגימו פרופסורית למחקר עוזרת Karen Martin, עמיתה פוסט-דוקטורנטית Mandy Ammer וסטודנטים לתארים מתקדמים Elise Walk, Karen Hayes ו-Steve Markwell.

כדי להכין את תמיסת המלאי הבלתי מסומנת של 5% gelatin sucrose, ערבבו את ה-gelatin וה-sucrose ב-PBS והמיסו לחלוטין בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, אחסנו בטמפרטורה של 4 °C. המשיכו לניקוי כיסות הזכוכית.

חלקו כיסוי זכוכית (cover slip) בודד לכל באר בלוח תרביות רקמה מפלסטיק בעל 24 באערים, והוסיפו לכל באר 500 microliters של 20% nitric acid והדרימו למשך 30 דקות. לאחר הסרת תמיס ה-nitric acid, שטפו את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים במים דא-יוניים. לאחר מכן בצעו ציפוי.

הוסיפו לכל זכוכית כיסוי 500 µL של poly-L-lysine בריכוז של 50 µg/mL, והדגרירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את תמיסת ה-polylysine ושטפו שלוש פעמים עם PBS. ציפוי ב-Poly-L-lysine מקל על ציפוי והצמדה אחידים של הג'לטין המסומן שמעליו. הניחו פלטות בעלות 24 בארות על קרח והוסיפו לכל אחת 500 µL של glutaraldehyde בריכוז 0.5% שהוכן טרי.

דגרו את הצלחות על קרח למשך 15 דקות. בצעו שלושה שטיפות עם PBS קר ולאחר מכן שאבו את כל שאריות ה-PBS לפני ציפוי הג'לטין. בינתיים, במהלך הדגירה עם הגלוטראלדהיד, המיסו מחדש את הג'לטין המצומד ל-Oregon Green 488.

בהתאם לפרוטוקול היצרן, חמם את התמיסה ואת תמיסת המלאי הלא-מסומנת של 5% gelatin sucrose ל-37 °C. לאחר מכן, דלל 500 µL של gelatin מסומן בתוך ארבעה milliliters של gelatin לא-מסומן. העבר באמצעות פיפטה 100 µL מתערובת ה-4 88 gelatin המדוללת אל כל לבישון (cover slip).

השתמש בכמות ג'לטין מספיקה כדי לצפות את זכוכית הכיסוי ללא צורך בפיזור ידני. חשוב לשמור על תערובת הג'לטין המדוללת עם 4 88 בטמפרטורה של 37 מעלות במהלך תהליך הציפוי כדי למנוע התמצקות מוקדמת. כמו כן, משלב זה ואילך, שמור את זכוכיות הכיסוי בחושך ככל האפשר כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית) פוטנציאלי.

לאחר שכל זכוכית הכיסויים מצופות בצלחת אחת, החזק את הצלחת בזווית והסר עודפי ג'לטין מכל באר באמצעות שאיבת ואקום. לאחר מכן, הדגר את זכוכית הכיסויים המצופות בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת זכוכית הכיסויים שלוש פעמים ב-PBS, הוסף 500 µL של sodium burrow, hydride, sodium burrow.

ההידריד גורם לתסיסה ובועות קטנות יופיעו על וסביב כל זכוכית כיסוי. הדגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפחית ולהשבית גלוטראלדהיד שאריתי. הסירו את תמיסת ה-sodium borohydride באמצעות שאיבה בוואקום, תוך תנועת ניגוב מהירה מסביב לכל באר. היזהרו לא לשאוב זכוכיות כיסוי צפות שהסתייגו מהתחתית של פלטת תרביות הרקמה במהלך הטיפול ב-sodium borohydride. לאחר שלושה שטיפות ב-PBS, הדגרו את זכוכיות הכיסוי ב-70% ethanol למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

באמצעות טכניקה סטרילית, העבירו את לביש cover slip המכיל את הפלטות למכבד זרימה למינרית לתרביות תאי B מסוג שני, ושטפו את ה-cover slips שלוש פעמים ב-PBS סטרילי בעזרת מחט ופינצטה סטריליות. העבירו בזהירות את ה-cover slips לבאר ריקה של פלטת 24 בארין חדשה, והביאו את ה-cover slips לשיווי משקל עם מצע התרבית עבור סוג התאים הספציפי הנבדק.

כעת זרעו את התאים ישירות על ליתרי הזכוכית (cover slips) לאחר זמן אינקובציה מתאים. עבדו את הדגימות לצורך דימות פלואורסצנציה אימונואלקטרולוגית (immunofluorescence) כדי להרכיב את הדגימות. הניחו טיפה של prolonged gold anti fade או ריאגנט דומה על סלייד של מיקרוסקופ, מקמו בזהירות את ליתר הזכוכית ההפוך, ורכשו תמונות לצורך ניתוח.

ניתוח זה מספק את השטח הנורמלי של פירוק המטריצה ביחס לשטח התאים או למספר התאים. הוא שימושי לניתוח שדות ראייה מיקרוסקופיים שלמים שבהם נוכחים תאים מרובים שטופלו באופן קולקטיבי עם גורמי גדילה מסוג irna או סוכנים טיפוליים. עבור ניתוח זה, תמונות נאספות בהגדלה נמוכה יותר, המספיקה כדי לאסוף ביעילות מידע על אוכלוסיות של תאים.

פתחו את התמונה ב-ImageJ. בדקו את מידע קנה המידה ובחרו את המדידות. בחרו באפשרויות השטח (area) והגבלה לסף (limit to threshold). חשבו את שטח הפירוק באמצעות תמונת הג'לטין הפלואורסצנטית, ותקנו תאורה לא אחידה על פני הג'לטין על ידי חיסור סף הרקע, והגדירו את ערכי העוצמה העליונים והתחתונים של הפיקסלים בתמונה.

בתמונות הבאות, השתמשו בכפתור set בחלון הסף (threshold) כדי להגדיר את אותו סף עבור כל התמונות, כדרך אובייקטיבית לבחירת אזור הפירוק. השתמשו בפונקציית analyze particles כדי למדוד את הסף באזורי פירוק המטריקס.

בחר גודל חלקיק הגדול מאפס כדי להסיר רעשים מהבחירה. הצג קווי מתאר כדי לזהות את האזורים המעניינים (regions of interest). לאחר מכן, סמן "הצג תוצאות" (display results) ו"סיכום" (summarize) כדי להציג את המדידות, במידה והשרטוט תיחם באופן ספציפי את כל אזורי הפירוק.

העתיקו את מדידת השטח הכולל לגיליון אלקטרוני; אם נבחרו אובייקטים נוספים, כגון פסולת (debris), רשמו רק את השטחים של אזורי העניין (regions of interest) הרלוונטיים. כדי לחשב את שטח התאים, פתחו את תמונת ה-foid והצביעה ובצעו סף (threshold) לתמונה כדי לקבוע את ערכי עוצמת הפיקסלים העליונים והתחתונים, כך ששולי התאים ייבחרו בתמונות הבאות. השתמשו בכפתור ה-set בחלון הסף כדי לקבוע את אותו סף עבור כל התמונות.

כאמצעי אובייקטיבי לבחירת שטח התאים, השתמש בפונקציית analyze particles כדי למדוד את סף השטח של התאים. בחר גודל חלקיק הגדול מאפס כדי להסיר רעשים מהבחירה.

הצג קווי מתאר כדי לזהות אזורים לניתוח, בדוק את תוצאות התצוגה וסכם כדי להציג מדידות שטח. אין לסמן. כלול חורים אם קיימים רווחים בין תאים לצביר.

כעת בחרו. העתיקו את תוצאות השטח עבור אזורי העניין הרלוונטיים לגיליון אלקטרוני וחשבו את שטח פירוק הג'לטין ביחס לשטח התאים הכולל. גישה חלופית היא לנרמל את שטח הפירוק למספר התאים, כפי שנקבע על ידי ספירת גרעינים שנצבעו ב-DAPI.

דבר זה חשוב אם המניפולציות משנות את שטח התא הממוצע. עבור גישה זו, השתמשו בתוסף nucleus counter לספירה אוטומטית של הגרעינים. התאימו את האפשרויות כדי למטב אותן עבור התמונות שלכם. אם הגרעינים חופפים באופן נרחב, ספירה אוטומטית עשויה שלא לספק מנייה מדויקת במקרה זה.

ניתן להקל על הספירה הידנית באמצעות תוסף סופר התאים (cell counter) כאשר הפעולה מבוצעת כהלכה. לוחות כיסוי מצופים באופן אחיד בג'לטין המשוייך ל-Oregon Green 488. מספר ארטיפקטים עלולים להיווצר במהלך הציפוי והעיבוד של לוחות כיסוי מצופי ג'לטין.

לדוגמה, ציפוי לא אחיד נובע מכיסוי לא תקין של זכוכית הכיסוי במהלך תהליך הציפוי עקב ערבוב לקוי, פריסה ידנית או התמצקות חלקית של תערובת הג'לטין. שריטות מעידות על הסרה של המטריקס המצופה על ידי חריצה עם מחטים או פינצטה במהלך הטיפול. התייבשות של פני השטח של זכוכית הכיסוי במהלך תקופות אחסון ממושכות עלולה להוביל למראה של "מרוצף" (cobblestone). אזור זה משקף דהייה פוטו-כימית (photo bleaching) של פני השטח של הג'לטין הפלואורסצנטי במהלך ההדמיה, עקב חשיפה לאור בעוצמה גבוהה או למשך זמן ממושך.

שימו לב כי כיסוי זכוכית (cover slip) שהוכן כהלכה מראה פלואורסצנציה הומוגנית כאשר הוא נצפה תחת מיקרוסקופ. המטריצות הדקות שנוצרות במהלך הליך זה מספקות אמצעי רגיש להערכת יכולתם של תאים לפרק ECM. לדוגמה.

תמונות אלו לוכדות את פעילות פירוק המטריקס של הפודיום הפולש של תא סרטן ראש וצוואר מסוג OSC 19. כאן תאים נזרעו על זכוכית כיסוי של ג'לטין המשורשרת ל-Oregon Green 488 והדמיות בוצעו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המוצגת הן בתמונות דו-ממדיות (2D) והן בתמונות תלת-ממדיות (3D). תאי OSC 19 אלו, שזרעו על זכוכית כיסוי של ג'לטין המשורשרת ל-Oregon Green 488, סומנו עם Phalloidin המשורשר ל-Rhodamine ונוגדנים ל-anti-cort actin, שנראו באמצעות נוגדן משני ANOR 647 וצובעו בצבעי פסאודו-ירוק את החלק הפולש.

פודיה (Podia) ניכרות בתמונה הממוזגת כריכוזים ציטופלזמיים מוקדיים של F actin ו-cortan החופפים לאזורים של פינוי ג'לטין (gelatin clearing). הוויזואליזציה מדגימה כיצד הפודיה הפולשות חודרות לתוך ה-ECMA; נפח משני נוצר כדי להראות קצה בתוך התא שבו נוכחות פודיה פולשות. מבט מהקצה הגבי מדגים פודיה פולשות המוחדרות לתוך הג'לטין שמתחתיהן.

מבט על הקצה הבטני מראה בליטות ב-Veda podia ואזורים של פירוק ג'לטין מתחת לכיסוי הזכוכית, כאשר אזורים בצבע אדום מייצגים את המטריצה הירוקה. תמונות אלו מציגות כמה מהשלבים החשובים לכימות של תאים המפרקים מטריצת ג'לטין מנורמלת בתוך תמונה מיקרוסקופית שלמה. כל התמונות הפלואורסצנטיות הומרו לסולם אפור כדי להציג בצורה טובה יותר את סף הצבע האדום ואת סימוני אזורי העניין.

תמונה זו של גלטין מצומד ל-Oregon Green 488 מראה את האזורים הכהים שבהם התרחש פירוק. באמצעות סף (Thresholding) של תמונת הגלטין, מודגשים אזורי הפירוק שמהם נמדדים אזורי עניין נבחרים לצורך חישוב שטח הפירוק. תמונה זו מראה rumine, foid וצביעה של f actin כמצופה.

הסף בתמונת האקטין מדגיש את שטח התא הכולל ממנו נבחרים שטחי התאים למדידה. באופן דומה, ניתן להחיל את הטכניקה על תמונות של גרעיני תאים הצבועים ב-DAPI. פאנל זה מדגים שלבים נבחרים המעורבים בכימות פירוק ג'לטין פלואורסצנטי על ידי תאים בודדים בתוך אוכלוסייה תאית מעורבת.

כימות פשוט זה הוא של תא OSC 19 בודד שעבר טרנספקציה ומבטא באופן יתר recombinant cort actin המהוזה ל-flag epitope tag. שימו לב כי ניתן לנתח את פירוק המטריקס על ידי תאים שעברו טרנספקציה גם בתוך אוכלוסייה מעורבת של תאים שעברו טרנספקציה ותאים שלא עברו טרנספקציה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור מספר דברים.

ראשית, ודאו שהסממנים התאיים הפלואורסצנטיים שלכם אינם חופפים לצבע של הג'לטין הפלואורסצנטי. בעת איסוף התמונות, חשוב לבחור שדות על בסיס נוכחות של תאים. אין לחפש באופן סלקטיבי אזורים של פירוק, שכן הדבר עלול להטות את הנתונים עקב השונות בין קווי התאים והתגובות לסוכנים טיפוליים שונים.

יש לאפטימיזציה של גורמים כגון זמן פירוק מספר המושבים ובחירת חלבון לסמימון אימונופלואורסצנטי עבור הניסוי הספציפי שלכם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים כיסויי זכוכית (cover slips) המצופים באופן אחיד בג'לטין פלואורסצנטי מתוך בדיקות פירוק המתווכות על ידי beta podia, וכן לגבי שיטות לכימות של פירוק המטריקס.