בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את ביטוי הגנים באמצעות מכונות גרעיניות פונקציונליות המופקות מהתאים. זה מושג על ידי קציר ראשון בנפיחות של תאי ההלה. לאחר מכן, התאים מחוברים על ידי הורדה ולאחר מכן צנטריפוגה כדי לגלול את הגרעינים בשלב השלישי.

הגרעינים מופקים במלח, מרוכזים ועוברים דיאליזה על מנת להשיג מנגנוני ביטוי גנים מסיסים ופונקציונליים. בסופו של דבר, ניתן להעריך את הפונקציונליות של התמציות הגרעיניות על סמך פעילויות השעתוק והשחבור שלהן כפי שהוערכו עם RNA פולימראז מצומד למערכת שעתוק ושחבור. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הכנת תמצית גרעין בתפזורת, הוא שבטכניקה זו ניתן להשתמש בכמות קטנה של תאים להכנת תמצית הגרעין.

התחל בציפוי תאי הלה על שלוש צלחות של 150 מילימטר עם מדיה DMEM בתוספת FBS ואנטיביוטיקה מגדל את התרביות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עד שהתאים מגיעים לשטף Co 90% בשלב זה שואבים את המדיה מתרביות תאי HELOC ושוטפים אותם פעם אחת עם 13 מיליליטר טמפרטורת החדר. PBS לצלחת ואז לשאוף. ה-PBS מעמיד כל צלחת על צדה למשך מספר שניות ושואב את שאר ה-PBS.

לאחר מכן, השתמש במרים תאים כדי לגרד את התאים לקצה התחתון של כל צלחת, ולאחר מכן משוך את התאים בצינור איינור של 1.5 מיליליטר. לבסוף, גלולה את התאים במיקרו פוגה למשך חמש דקות במאה פעמים G ובארבע מעלות צלזיוס. כעת שאפו את ה-PBS מכדור התא והעריכו את נפח התא הארוז או PCV על ידי התבוננות בהדרגה על הצינור.

לאחר מכן הוסף נפח כפול של מאגר היפוטוני מאשר ה-PCV לגלולת התא. יש לנער את השפופרת בעדינות כדי להשהות. התאים מעבירים בעדינות את תרחיף התאים למעלה ולמטה עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לעקור אשכולות תאים לפי הצורך.

לאחר מכן גלולה את התאים באותם תנאי צנטריפוגה כמו קודם. לאחר הצנטריפוגה יש לשאוב בזהירות את שכבת החיץ ההיפוטונית. התאים יתחילו להתנפח ונפח התא יגדל לכ-750 עד 1000 מיקרוליטר.

הוסף מאגר היפוטוני חדש לנפח סופי של 1.5 מיליליטר והשהה מחדש את התאים במאגר. שוב. לבסוף, דגרו את התאים הנפוחים התלויים על הקרח למשך 10 דקות בזמן שהתאים מתקררים. שטפו הומוגנייזר למטה עם מאגר היפוטוני ולאחר מכן הניחו אותו על קרח יחד עם התאים.

לאחר מכן בעזרת מגב משימה עדין כמו מגבון קים, יבש את העלי. השתמש בקצה מיקרו פיפטה מורחב של 1000 מיקרוליטר כדי להסיר את המאגר מלמטה. כעת השתמש בפיפטה כדי להעביר את התאים הנפוחים המצוננים לתוך הדאון למטה.

הוא החלק המסובך ביותר בהליך זה לכניסה להצלחה בדוק אם יש ליזה. לאחר כל ירידה במיקרוסקופ, הזיזו לאט את העלי ההדוק של המורדות למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להכין את התאים תוך הקפדה על הימנעות מבועות. לאחר מכן, העבירו Eloqua של חמישה מיקרוליטר של תרחיף תאי lys לצינור einor והוסיפו 10 מיקרוליטר של טריאן כחול ו-15 מיקרוליטר של XPBS אחד.

הוסף את תמיסת התא לשקופית ובדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אור לליזה, גרעיני תאי הליס ייראו כחולים לאחר שלושה אונקיות. אין מספיק ליזה מכיוון שתאים חיים רבים נראים לעין. אחרי חמישה אונקיות, יש מספיק ליזה.

לבסוף העבירו את תאי ה-lys לצינור ה-einor המקורר מראש וסובבו את תרחיף התא למשך חמש דקות במיקרו-פוגה ב-1500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו בזהירות את הסופר נאטין לצינור חדש מבלי לשבש את הגלולה. כעת, העריכו את נפח הגרעין של התיקון או PNV על ידי התבוננות בהדרגתיות על הצינור.

מלאו קצה מיקרו פיפטה עם מאגר מלח נמוך במחצית ה-PNV. לאחר מכן הכנס את קצה המיקרו פיפטה לתוך הגרעינים בתחתית צינור האיינור. משפריץ לאט את המאגר לתוך הגרעינים תוך ערבוב עדין.

החלק בעדינות את הצינור כדי לוודא שהגלולה מושעה לחלוטין. לאחר מכן, מוסיפים מאגר מלח גבוה במחצית ה-PNV ומערבבים במהירות פעם אחת על ידי היפוך הצינור. סובב את הצינור למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לבסוף, סובב את הגרעינים במיקרו פוגה למשך 15 דקות ב-18,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. התחל בהעברת 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט למיקרו חסרונות צוננים. סובבו את התמצית הגרעינית העשירה במלח למשך 15 דקות בטמפרטורה של 14,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס לאחר הצנטריפוגה, הפכו את המיני ראקון והניחו אותו בצינור EOR בודד חדש.

לאחר סיבוב של שתי דקות ב-1000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס, התמצית הגרעינית העשירה במלח תתרכז לכ-115 מיקרוליטר. כעת העבירו 45 מיקרוליטר של תמצית גרעינית עתירה מלח למיני SLIs של דיאליזה. ודא שתחתית המגלשה נמצאת עם החלק התחתון של המצוף.

לאחר מכן הנח את ה-SLIs ב-500 מיליליטר של מאגר דיאליזה צונן. לבסוף, מערבבים את האליקוטים במשך שעה עד שעתיים בארבע מעלות צלזיוס, התמצית הגרעינית תיראה עכורה לאחר דיאליזה. איור זה מציג נתונים מייצגים המשווים תגובת שעתוק וחיתוך של RNA פולימראז בתמצית גרעינית בקנה מידה קטן לעומת תמצית גרעינית בתפזורת.

כאשר מבנה A-C-M-V-D-N-A הודגר בתמציות בתפזורת או בקנה מידה קטן, רמות דומות של ה-pre-mRNA המתהווה סונתזו בנקודת הזמן של חמש הדקות לאחר הוספת אלפא ומנין כדי לחסום שעתוק נוסף, חומרי הביניים של השחבור ותוצרי החיבור הצטברו עם הזמן עם קינטיקה דומה בשני סוגי התמציות. תוצאות מייצגות אלו מאשרות כי היעילות של מערכת השעתוק והשחבור של RNA פולימראז שני המצומד דומות בתמציות גרעיניות בתפזורת ובקנה מידה קטן. כדי להדגים את התועלת של התמצית בקנה מידה קטן, הוכנו תמציות שיטה מתאי הלה שטופלו במעכב השחבור E 7 1 0 7 או בתרכובת הבקרה השלילית Platy analy F ולאחר מכן בוצעה בדיקת שעתוק ושחבור RNA פולימראז שני מצומד כפי שמודגם באיור זה שעתוק על ידי RNA פולימראז שניים התרחשו ביעילות בתמציות שהוכנו הן מהמשובץ F והן מ- E 7 1 0 7 שטופלו תאים.

לעומת זאת, שחבור התרחש כרגיל בתמצית שהוכנה מהתאים שטופלו בניתוח F, אך בוטל בתאים שטופלו ב-E 7 1 0 7. נתונים אלה מספקים הוכחת היתכנות לשימוש בתמציות גרעיניות בקנה מידה קטן לטיפול מיוחד בתאים בקנה מידה קטן. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך פחות מחמש שעות.