להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות
26 ביולי 2012
מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.
מטרת הליך זה היא להשתמש באלקטרופורציה intrauterine (ברחם), כדי להדמיות ולבצע מניפולציה גנטית של דנדריטים וקוצים בקליפת המוח ובהיפוקמפוס של עכבר. הדבר ממושג תחילה על ידי הזרקה של תמיסתו של הפלסמיד ה-DNA הרצוי לתוך הפטירה הלטראלית של עוברים ברחם. לאחר מכן, נעשה שימוש במיקומים שונים של אלקטרודות Palo.
בהתאם להזרקת ה-DNA, מבצעים אלקטרופורציה לקליפת המוח או להיפוקמפוס, ולאחר מכן ממתינים לשלב postnatal או לשלב בוגר רצוי. עכברים עוברים פרפוזיה והמוחות נאספים. לבסוף, המוחות נחתכים באמצעות ויברטום.
בסופו של דבר, ניתן להדמות דנדריטים וקוצים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לטכניקה של אלקטרופורציה יחידנית ישנם מספר יתרונות בהשוואה לשיטות למחקר דנדריטים וקוצים. למעשה, טכניקה זו מאפשרת ראשית לחקור היבט זה ישירות in vivo.
יתרה מכך, בהשוואה ליצירת עכברי knockout, אלקטרופורציה היא גישה מהירה לבחינת ההשפעה של השתקה גנטית או ביטוי גנים ב-don white ו-spine, לא רק במבנה תאי ספציפי, אלא גם בנקודה ספציפית של ההתפתחות. שימוש במערכת השרה (inducible system) באלקטרופורציה הוא גם כלי שימושי לזיהוי אינטראקציה תפקודית בין גנים המעורבים בהתפתחות ה-don write וה-spine. ואכן, בניגוד לווירוסים, למשל, קשה לנו לשלב מספר רכיבי HNA או מספר גנים של tons באותה אוכלוסיית תאים. לתחילת הפרוצדורה, דללו DNA לריכוזים הרצויים במים והוסיפו צבע fast green לריכוז סופי של 0.05%. השתמשו במכשיר micropipette puller כדי למשוך מחטי זכוכית להזרקה.
הניחו עכברה בהריון בתא השראת הרדמה באמצעות isof fluorine ופתחו את זרימת החמסן לשני ליטרים לדקה. כאשר בעל החיים מאבד את רפלקס הכתיבה, העבירו אותו למסכת טרום-ניתוח. טפטפו טיפת IGEL לכל עין והשתמשו במכונת גילוח חשמלית כדי להסיר את הפרווה מהבטן.
נקה את האזור הגולח פעם אחת עם כלורהקסידין כדי לאסוף שיער שנותר. העבר את בעל החיים למסכת הרדמה שנייה באזור הניתוח, כאשר גבו מונח על פד חימום. התחל בניתוח לאחר אובדן רפלקס הכף (petal reflex).
לבשו מסכה וכפפות סטריליות וכסו את בעל החיים בסדין סטרילי. נקו את האזור הגזור לפחות שלוש פעמים עם כלורהקסידין. השתמשו בסכין מנתחים כדי לבצע חתך אנכי לאורך קו האמצע דרך העור.
בעזרת מספריים, בצעו חתך דומה בשרירי הבטן לאורך המרפק הליניארי. בחרו את העוברים הנגישים ביותר.
הניחו פינצטת טבעת בין שני עוברים ומשכו בזהירות את שרשרת העוברים החוצה מחלל הבטן. מרגע זה ואילך, שמרו על לחות העוברים באמצעות PBS סטרילי ומחומם מראש. השתמשו בפינצטת טבעת.
שנו בעדינות את מיקום העובר בתוך שק השער (amniotic sack) וייצבו את הראש בין הטבעות. לחצו בעדינות כדי לדחוף את העובר למעלה, קרוב יותר לדופן הרחם. בעזרת היד השנייה, קחו את מחזיק הקפילרית והחדירו בזהירות את המחט למרכז ההמיספירה כדי להגיע לחדר הצדי (lateral ventricle).
תוך הקפדה על מזעור תנועת המחט על פני דופן הרחם ומניעת פגיעה בכלי דם, לחצו על הדוושה כדי להזריק כ-0.5 µL של תמיסת DNA ירוקה. מקמו את האלקטרודות בצדי ראשו של העובר, כאשר הדוושה החיובית נמצאת באותו צד של הפקעת המוזרקת עבור אלקטרופורציה של הקורטקס, או בצדו ההפוך של הפקעת המוזרקת עבור אלקטרופורציה של ההיפוקמפוס. לאחר מכן, החילו חמישה פולסים חשמליים של 30 V למשך 50 ms במרווחי זמן של שנייה אחת.
הימנעו מהעברת זרם חשמלי דרך השליה, שכן הדבר יוביל למות העוברים. כדי להגדיל את סיכויי ההישרדות, יש להזריק ולבצע אלקטרופורציה לכל העוברים בתוך פחות מ-30 דקות. עם הסיום, שטפו ב-PBS את חלל הבטן, והשתמשו בפינצטת טבעת כדי להחזיר את קרן הרחם למקומה המקורי. השתמשו בתפרי ויקריל (vicryl) ספיגים לסגירת דופן הבטן והעור. הניחו את בעל החיים בתא התאוששות עד להתעוררותו.
לאחר מכן, העבירו את העכבר לכלוב המונח על משטח חימום 24 ו-48 שעות לאחר הניתוח. עקבו אחר התנהגות העכבר כדי להעריך כאב, סבל או מצוקה, ושקלו את בעל החיים לצורך ניתוח המוחים. בשלבים הפוסטנטליים, השתמשו במכשיר רעידה (vibrator) כדי לבצע חיתוך של מוחות שעברו פרפוזיה וקיבוע מוקדם, והצמידו את החיתוכים ב-aqua poly mount לצורך הדמיית דנדריטים וקוצים.
איור זה מציג דוגמאות של תאים שעברו אלקטרופורציה בקליפת המוח, ב-ca one ובסיבוב המשנני (dentate gyrus) של ההיפוקמפוס, כאשר עכברים מסוג type עברו אלקטרופורציה ב-E 14.5, והמבנה של GFP והמוחות נאספו ביום ה-14 לאחר הלידה. על ידי הזרקה של נפח קטן של תמיסת DNA, סומנים מספר מצומצם של תאים, דבר המאפשר ויזואליזציה של ההסתעפות הדנדריטית של תאים בודדים חיוביים ל-GFP, כמו גם של הקוצים שלהם בהגדלה גבוהה יותר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להזריק נפח קטן של DNA כדי להתמקד במספר קטן של תאים בלבד, ובכך להיות able להדגים ולכמת את ה-don't write in the spine או את ה-electro neuros.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול לאלקטרופורציה בתוך הרחם (in utero electroporation) של קליפת המוח וההיפוקמפוס בעכברים בשלב E14.5. שיטה זו בעלת ערך רב לחקר דנדריטים וקוצים (spines) באזורי מוח אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מניפולציה גנטית
רקע
- אלקטרופורציה מאפשרת ויזואליזציה ומניפולציה גנטית של נוירונים.
- הטכניקה מתמקדת באזורי מוח ספציפיים במהלך ההתפתחות העוברית.
- זה מעניק יתרונות על פני מודלים מסורתיים של עכברי knockout.
- מחקרים במודלים חיים (in vivo) יכולים לחשוף אינטראקציות גנטיות המשפיעות על התפתחות דנדריטים וקוצים סינפטיים.
מטרת המחקר
- להדמיה ומניפולציה של דנדריטים וקוצים במוח של עכבר.
- להערכת ההשפעות של ביטוי גנים ודיכוי גנים.
- לפיתוח גישה מהירה לחקר מבנים נוירונליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת DNA פלסמי לתוך החדרי הצדיים של עוברים.
- אלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות להעברת פולסים חשמליים.
- הערכה פוסטנטלית של מבנה המוח ותפקודו.
- ויזואליזציה של דנדריטים וקוצים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
תוצאות עיקריות
- אלקטרופורציה מוצלחת של קליפת המוח וההיפוקמפוס.
- ויזואליזציה של הסתעפויות דנדריטיות וקוצים בתאים חיוביים ל-GFP.
- הדגמת יעילות הטכניקה למחקרי in vivo.
- זיהוי אינטראקציות גנטיות המעורבות בהתפתחות נוירונלית.
מסקנות
- אלקטרופורציה תוך-רחמית (In utero electroporation) היא כלי רב עוצמה לחקר מבנים עצביים.
- השיטה מאפשרת מניפולציה גנטית ממוקדת באזורי מוח ספציפיים.
- היא מציעה חלופה מהירה לטכניקות מסורתיות של שינוי גנטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אלקטרופורציה תוך-רחמית (IUE) מאפשרת מניפולציה גנטית מהירה ודימוי של מבנים נוירונליים במוח של עכבר בשלבי התפתחות באופן in vivo, ובכך היא נותנת מענה ישיר לצורך במודלים רלוונטיים פיזיולוגית לגילוי תרופות מוקדם למערכת העצבים המרכזית (CNS). גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית ובתיקוף מטרות (target validation) על ידי מתן אפשרות למודולציה גנטית מדויקת מבחינה זמנית ומרחבית בקליפת המוח ובהיפוקמפוס. הגמישות של IUE מאיצה את בחינת ההשערות ואת תעדוף תיק הפיתוח עבור מטרות הקשורות לתפקוד סינפטי ולהתפתחות נוירונלית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של תפקוד גנים בפיתוח נוירונלי בתוך סביבות רקמה טבעיות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מתן אפשרות למחקרי הגברה או אובדן של תפקוד (gain- and loss-of-function) באזורי מוח ספציפיים ובחלונות התפתחותיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות למניפולציה גנטית קומבינטורית in vivo.
- מאיץ את רמת הביטחון החיזויית בבחירה ובתעדוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות נוירונליות רלוונטיות פיזיולוגית לסריקת פנוטיפ והדמיה כמותית בהמשך התהליך.
- מאפשר סימון הדיר של אוכלוסיות נוירונליות דלילות לצורך ניתוח דנדריטים וקוצים ברזולוציה גבוהה.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי אספקה וביטוי גנטי עקביים באזורי מוח מטרים.
- משפר את המוכנות לסריקת תרכובות המשפיעות על המבנה או התפקוד הסינפטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים לארכיטקטורה נוירונלית ולדפוסי ביטוי גנים הרלוונטיים למחלה.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות תמיכה בבקרת ביטוי גנים הניתנת להשראה בשלבים התפתחותיים מוגדרים.
- מספקת פלטפורמה להערכת סמנים ביולוגיים תרגומיים של שלמות דנדריטית וסינפטית.
- מפחית את הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים על ידי מידול תפקוד גנים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
IUE משתלב בממשק שבין השלב המוקדם של הגילוי למחקר הפרה-קליני, ומגשר בין ממצאים in vitro לאימות in vivo עבור מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים עבור גנים המווסתים את התפתחות הדנדריטים והקוצים.
- סריקה: מספק פלטי דימוי כמותיים הניתנים לשחזור לצורך ניתוח השוואתי של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה בעלת תוכן גבוה (high-content) של ענפיות דנדריטית וצפיפות קוצים באוכלוסיות נוירונליות מוגדרות גנטית.
- מחקר תרגומי: מסייע בהלימה בין מודלים פרה-קליניים למנגנוני מחלה אנושיים על ידי מתן אפשרות לוויסות גנטי זמני מדויק.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכה מהירה של מספר מטרות גנטיות או שילובים שלהן באותה מערכת ניסויית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מציע מניפולציה גנטית מהירה, ניתנת להרחבה וסטנדרטית בהשוואה למודלים מסורתיים של knockout.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להערכה תפקודית מוקדמת in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות CNS בהסתמך על נתונים חזקים in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים עובריים, תכנון מבנים גנטיים ודימוי קונפוקלי.
- דורש גישה לציוד ייעודי להזרקה מיקרוסקופית, אלקטרופורציה ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הובלת DNA, פרמטרי אלקטרופורציה ופרוטוקולי דימוי.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זני עכברים שונים או שלבים התפתחותיים שונים.
- מוגבל לאזורי מוח נגישים ולחלונות התפתחותיים כפי שנתמך על ידי הפרוטוקול.
