פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ, לדמיין ולספור את הציטים מזחלי בר. זה מושג על ידי הרדמה ראשונה של הזחל על ידי הנחתו על קרח, הזרקת תמיסת חיץ המכילה נוגד קרישה והחזרת הזחל לקרח כדי לאפשר לציטים להיכנס מחדש למחזור הדם לפני המיצוי. השלב השני הוא ביצוע חתך רדוד בקצה האחורי של הזחל באמצעות אזמל נקי.

לאחר מכן, הזחל נלחץ בעדינות באמצעות מלקחיים רכים. לאחר מכן תערובת הלימפה ההמו של תמיסת החיץ נשאבת באמצעות מיקרו פיפטה ונאספת בצינור מיקרו צנטריפוגה. השלב האחרון הוא לערבב בעדינות את תמיסת הלימפה ההמו עם נפח שווה של תמיסת חיץ ולהעביר 10 מיקרוליטר מהתמיסה על ציטומטר המו כדי לדמיין ולספור את מספר הציטים.

בסופו של דבר, שיטת מיצוי ציטי המו זו יכולה לשמש כשיטה מהירה ויעילה לספירת ציטים ממינים שונים של זחלים ולשמר ככלי לבחינת היבטים פיזיולוגיים של התגובה החיסונית התאית של החרקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לחלץ סוטים של המו מזחלים עם פרוקס מופחת מאוד. דגמי זחלים אחרים מדממים על ידי חיתוך אחד המקצוענים, ללא חילוץ ציטים מהנוזל שיוצא.

בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחלץ המוטיפ ממיני חרקים אחרים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה האקולוגית, כגון כיצד התגובה החיסונית התאית של החרקים משתנה בהתאם לאיכות התזונה, שלב ההתפתחות או חשיפה לפתוגנים שונים. כדי להתחיל בהליך זה, יש להרדים את זחלי הכוכב הלפני אחרון על ידי צינון שלהם על קרח למשך 20 דקות לפני מיצוי ציטי ההמו.

לאחר מכן, הכנס את הקצה הקהה של מחט נימית נקייה בגודל 16 לתוך הצינור המחובר למזרק זכוכית של 20 מיליליטר. השאר את השפופרת המכילה את תמיסת האיסוף פתוחה על ספסל המעבדה. מלאו לאט את הנימים בכ-10 עד 15 מיקרוליטר מאגר.

לאחר מכן הניחו את המחט על כדור חימר המונח ליד המיקרוסקופ המנתח. מניחים את הזחל בצלחת פטרי. יש למקם את החרק על צדו כך שהכדורים ייראו בבירור.

בזמן הצפייה במיקרוסקופ מנתח, החזיקו את הזחל במקומו עם זוג מלקחיים והניחו את המחט קרוב לאחד הכדורים שבהם ציפורן החרק בדרך כלל רכה יותר. לאחר מכן לחץ בעדינות את המחט הנימים על גוף החרק. לאחר שהמחט חדרה לציפורן, הזריק את הנפח הכולל של התמיסה לזחל.

גופו של הזחל יתנפח לאחר ההזרקה, אך הוא לא אמור להתפוצץ או לזלוג. מחזירים את הזחל לצלחת הפטרי הקרה. מקם את החרק בגב כדי למנוע מהמאגר לדלוף החוצה מהפצע.

חזור על הזריקות עבור כל זחל המשמש למיצוי צליעה. לאחר מכן הניחו לכל החרקים להתקרר על הקרח למשך 30 דקות. כעת, הניחו את הזחל בצלחת פטרי מתחת למיקרוסקופ הניתוח.

בצע בזהירות חתך רדוד באורך של כשניים עד שלושה מילימטרים באזור האחורי של הזחל, באמצעות אזמל סטרילי מבלי לפגוע במעי או באיברים פנימיים אחרים. לאחר מכן, סחטו את הזחל בעדינות באמצעות זוג מלקחיים גמישים מפלסטיק תוך איסוף כ-10 עד 20 מיקרוליטר מתערובת ההמו רפיון עם קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר. שוב, היזהר לא לפגוע ברקמות הפנימיות.

לאחר מכן, השליכו את שאריות הזחלים. אסוף את צליעת ההמו מכל זחל בצינורות מיקרו צנטריפוגה נפרדים עם תווית סיליקון, 0.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסף כ-10 עד 20 מיקרוליטר מתמיסת הדגירה לכל דגימת צליעה שנאספה מזחל בודד.

שמור את דגימות המולימפה על קרח בכל עת בשלב זה. מערבבים את דגימת המולימפה ואת תמיסת הדגירה מיד לפני הספירה. הוא מציין.

טיפול זה מאפשר הפרדה נכונה של הציטים ומונע היווצרות גושים. השתמש בקצה פיפטה נקי כדי להעביר 10 מיקרוליטר של דגימת לימפה המו מעורבבת עם תמיסת הדגירה על ציטומטר המו. לאחר מכן, בעזרת מיקרוסקופ מורכב, ספרו ורשמו את מספר הציטים לפחות ב-15 מהריבועים הגדולים של הרשת המרכזית של ההמו ציטומטר.

הוסף ערכים אלה כדי לקבל סכום כולל של מספר הציטים ההמו ב-15 הריבועים. לאחר מכן, יש לשטוף היטב את הציטומטר ההמו ואת החלקת הכיסוי שלו באמצעות בקבוק כביסה עם מים מזוקקים ונטולי יונים. לאחר מכן נגב אותו יבש עם מגבוני קים.

חזור על ההליכים עבור שאר דגימות ההמו צולע וחשב את המספר הממוצע של ציטים למיליליטר של נפח המו צולע עבור כל זחל. תמונת המיקרוסקופיה של השדה הבהיר מציגה את הציטים שחולצו מזחלי גרעין הין ai בהגדלה של פי 20. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בציטים שנאספו כדי לחקור את התגובה החיסונית התאית ולהגדיר בדיקות כגון פגוציטוזיס וכובע, אנקפסולציה נבחרת ופעילות pH אוקסידאז.

בנוסף, ניתן לאסוף R-N-A-D-N-A וחלבון ללא שימוש לבדיקות נוספות על מנת לחקור את התגובה החיסונית התאית הללו בחרקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק זחלים לצורך חילוץ המולימפה וכיצד לאסוף המולימפה המכילים ציטים חיים של המולימפ.