שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול
18 בדצמבר 2012
הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר עכברים הנושאים מערכת חיסון אנושית מהונדסת. זה מושג תחילה על ידי הכנת העכבר לניתוח ולאחר מכן העמסת הטרוקר בחתיכת תימוס בשלב השני. מטריג'ל מעורבב עם תאים שליליים CD 34 וחיוביים ל-CD 34, ולאחר מכן מוסיפים את התערובת לטרוקר.
לאחר מכן, מבני המטריג'ל מושתלים מתחת לקפסולת הכליה. בסופו של דבר, ניתן לנטר את דחיית גידולי המטרה על ידי תאי CD 8 T מהונדסים גנטית על ידי הדמיה חיה של חיות מחמד ומדידות גידול פיזיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות מת' קיימות כמו מודלים של נוירונים מלאים, הוא ששיטה זו מאפשרת לחקור התפתחות תאי גזע אנושיים מהונדסים גנטית בתוך התימוס האנושי ולאחר מכן בדיקת יעילות in vivo של שושלות נגזרות המדגימות את ההליך יהיו שלושה טכנאים מהמעבדות שלנו, גרגורי בריסטול, ברנרד לוין, ושון קים.
בתרשים סכמטי זה, מתואר מודל ה-BLT המותאם ששימש במחקרים אלה ליצירת עכברים כימריים הנושאים מארט, תאי T ספציפיים אחד. השתל משוחזר מתאי CD 34 מתמרים ולא מתמרים שבודדו מכבד עוברי אוטולוגי. חלק קטן מהתאים המומרים מוקפא ומוזרק לעכברים המוקרנים ארבעה עד שישה שבועות לאחר מכן.
בסרטון זה, השתלת המבנה החי מודגמת לאחר שבעלי החיים הפכו איטיים מההרדמה. התחל בגילוח הצד השמאלי של כל עכבר מהמותן ועד הכתף בין מרכז הגב לבטן. לאחר רישום המשקל של כל בעל חיים, אגרוף את אוזניהם למספור ותת עורית, הזריק 0.3 מיליליטר קרפרופן לכל אחת מהכתפיים שלהם.
לאחר מכן הניחו את העכברים על צדם הימני עם הפנים שמאלה. כעת שטפו את הטרוקר של מחט שתל סרטן בגודל 16 עם קצה קובץ עגול עם PBS. בעזרת זוג מלקחיים לאף מחט, הוסף חתיכת תימוס לצלחת PBS ולאחר מכן החזק את הטרוקר אופקי עם המוט.
ממש בתוך הקצה שואבים את הרקמה. החלקת הטרוקר מתחת לקפסולת הכליה והזרקת הרקמה היא אחד ההיבטים המאתגרים ביותר בהליך זה. לאחר מכן, בקש עוזר.
השתמש בפיפטה תזוזה חיובית של eend orph כדי לערבב חמישה מיקרוליטרים של מטריג'ל קר לתוך צינור אחד של תאים תוך ערבוב עדין. שמירה על הטרוקר אופקי. משוך לאט לאחור את המוט בזמן שהעוזר מפזר את ג'ל המטרי.
מערבבים לתוך הטרוקר עבור כל עכבר. ראשית, ספוג את העור החשוף של החיה עם בטדין ולאחר מכן נגב אותו עם מגבון איזופרופנול. פעמיים קובעים את הכתם הכהה ביותר מתחת לעור, המציין את מיקום הטחול.
הכליה נמצאת כחמישה מילימטר גב לטחול באמצעות מלקחיים קהים כדי להרים את העור מעל הכליה. בצע חתך באורך של כ -15 מילימטרים בעור במקביל לטחול. בצע חתך דומה בשכבת שריר הצפק שמתחת.
אצל גברים, הכליה צריכה להיות גלויה ישירות. כל שעליך לעשות הוא ללחוץ על הבטן כדי להוציא אותה החוצה. שמירה על לחץ על הבטן ביד שמאל כדי לשמור על הכליה חשופה אצל נקבות, השתמש תחילה בהמוסטט כדי להרים את השחלה ולאחר מכן גרור החוצה את הכליה כדי לעזור לשמור על האיבר מחוץ לגוף.
תלוש חור קטן בקצה האחורי של קפסולת הכליה ואז החלק את הטרוקר לתוך החור הזה ולאורך הכליה עד שפתח הטרוקר מכוסה לחלוטין על ידי קפסולת הכליה. לאחר מכן בעזרת האצבע הקטנה של יד ימין, הזריקו את הרקמה. כעת השתמש בהמוסטט הסגור כדי לדחוף בעדינות את הכליה בחזרה למקומה.
קשרו תפר אחד בצפק עם קשת כפולה, סחטו את העור כלפי מעלה כמו ארנק, ואז הכניסו אותו לשני קליפסים לפצעים. לבסוף, הניחו טיפה של PBS על כל עין והניחו את העכבר על צדו בכלוב על גבי מצעים כלשהם. אחרי שתשתלו את כל העכברים באותו אופן, ודאו שהחיות חזרו לשכב על הבטן לפני שעזבו אותן.
איור ראשון זה מציג תמונה מייצגת של השתל החי THI בעכברים מואנשים. באיור זה מודגמת ההתפתחות התקינה של רקמת התימוס והתפלגות הרקמה הפיזיולוגית של CD 4 ו-CD 8 חיובי T אנושי. לאחר הבנייה מחדש, בעלי החיים נושאים מערכת חיסון אנושית עם התפלגות תקינה של תאי T חיוביים CD ארבע ו-CD שמונה.
כאן מוצגת תמונה מייצגת של עכבר הנושא גידול מלנומה. האזורים האפורים מציינים את תמונת סריקת ה-CT. האזורים הצבעוניים מצביעים על הפעילות המטבולית של הגידול כפי שזוהתה בסריקת ה-PET.
סריקת ה-CT לבדה בניסוי זה הצביעה על מסת גידול גדולה באזור שצוין על ידי העיגול הלבן. עם זאת, כפי שממחישה הדמיית PET in vivo, אזור זה מורכב בעיקר מרקמה נמקית וצלקת, מה שמדגיש את התועלת של הדמיית PET כדרך רגישה ומדויקת יותר להעריך רגרסיה ופינוי של הגידול. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות אחרות כגון תאי T, פנוטיפ והפעלה ex vivo כדי לענות על שאלות הרלוונטיות לתפקוד תאי T.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את הפקתם ואפיון של תאי T ספציפיים לגידול באמצעות עכברים אנושיים (humanized mice). התהליך כולל השתלה של רקמת תימוס אנושית ותאי גזע המטופואטיים אנושיים שעברו שינוי גנטי לעכברים עם מערכת חיסון לקויה, מה שמוביל לשחזור של מערכת חיסון אנושית לצורך בחינה in vivo של תגובות חיסוניות נגד גידולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- אונקולוגיה
- רפואה תרגומית
רקע
- מודלים של עכברים הומניזים חיוניים לחקר תגובות חיסוניות אנושיות.
- תאי T שעברו שינוי גנטי יכולים לתקוף גידולים ביעילות.
- שיטות קיימות עשויות שלא לחקות באופן מספיק את האינטראקציות של מערכת החיסון האנושית.
- מחקר זה נועד לשפר את ההבנה של תגובות אנטי-גידוליות.
מטרת המחקר
- ליצירת עכברים עם מערכת חיסונית אנושית מהונדסת.
- לניטור יעילותן של תאי CD8 T מהונדסים גנטית נגד גידולים.
- לספק תובנות לגבי התפתחות תאי גזע אנושיים בתוך התימוס.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת העכבר להליכים כירורגיים.
- השתלה של רקמת תימוס מעורבבת עם תאים שעברו טרנסדוקציה, שליליים וחיוביים ל-CD34.
- שימוש ב-Matrigel לבניית השתל.
- ניטור דחיית הגידול באמצעות דימות PET חי ומדידות פיזיות.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של עכברים בעלי מערכת חיסון אנושית תפקודית.
- ניטור יעיל של דחיית גידול על ידי תאי T מהונדסים.
- הדגמת היתרונות של שיטה זו על פני מודלים קיימים.
- תובנות לגבי התפתחותם של תאי גזע אנושיים in vivo.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת מחקר מתקדם של תגובות חיסוניות אנושיות.
- היא מספקת פלטפורמה לבדיקת טיפולים אנטי-גידוליים.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את ההבנה של דינמיקת מערכת החיסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל העכבר האנושי מסוג BLT מאפשר הערכה חזויה של טיפולים גנטיים מבוססי תאי גזע ותפקוד של תאי T מהונדסים בהקשר חיסוני אנושי רלוונטי פיזיולוגית. פלטפורמה זו נותנת מענה לפער קריטי בקווי המחקר הפרה-קליניים של אונקולוגיה ואימונותרפיה, בכך שהיא תומכת בהערכה in vivo של התפתחות תאי מערכת החיסון האנושית, הת녘ה של גידולים ויעילות טיפולית. שילובה מחזק את הביטחון הטרנסלטורי ומפחית סיכונים בקבלת החלטות בשלבים מוקדמים עבור תוכניות לטיפולים תאיים וגנטיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הכוללות תאי מערכת חיסון אנושיים מהונדסים in vivo.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מידול של התפתחות ותפקוד תאי מערכת חיסון אנושיים.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות עבור רצפטורים של תאי T ספציפיים לגידול.
- משפר את רמת הביטחון בניבוי לצורך קידום אימונותרפיות מבוססות תאים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק מערכת in vivo מועמדת להערכה כמותית של פעילות אנטי-גידולית.
- מאפשר מדידה ניתנת לשחזור של נסיגת גידול באמצעות דימוי PET חי.
- תומך בסטנדרטיזציה של פנוטיפ תאי חיסון ובבדיקות תפקודיות לאחר השתלה.
- מכין פלטפורמה חסונה להערכת טיפולים בתאים שעברו מודיפיקציה גנטית לפני מעבר לשימוש קליני.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם אינטראקציות של מערכת החיסון והגידול בבני אדם הרלוונטיות למחלה, לצורך גילוי ביומרקרים טרנסלציונליים.
- מבטיח רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של טיפולים בתאי חיסון מהונדסים.
- תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי אספקת נתוני יעילות ומנגנון in vivo.
- מאפשר הערכה של סילוק הגידול וההישרדות של תאי החיסון בהקשר אנושי (humanized).
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
מודל זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדם, זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) והתיקוף הפרה-קליני עבור מועמדים לטיפול תאי וגנטי המכוונים לסרטן ולהפרעות חיסוניות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקוד של תאי T מהונדסים ומיקוד לגידולים in vivo.
- סריקה: מספק פלטי דימויי PET כמותיים הניתנים לשחזור ותוצאות מדידת גידולים לצורך הערכת מועמדים.
- אנליזה: מספק מדדים חסונים לפנוטיפ של תאי מערכת החיסון ולהערכה תפקודית לאחר השתחלה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין נתוני יעילות in vivo לבין סממנים ביולוגיים ונקודות קצה מכניסטיות הרלוונטיות לתרגום קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לבדיקה איטרטיבית של טיפולים בתאי מערכת חיסון שעברו שינוי גנטי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בפיתוח טיפולים בתאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות יעילות in vivo ותמיכה בזרימות עבודה ניתנות לשכפול ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעוד עדיפויות מותאם סיכון ובקידום נכסי טיפול תאי וגנטי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במניפולציה של תאי גזע אנושיים ובניתוחים בעכברים עם חסר חיסוני.
- מחייב גישה לדימות PET ותשתיות מתקדמות להשכנת בעלי חיים.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים לצורך הדירות (reproducibility) והשוואת נתונים.
- יש להתאים את הפרוטוקולים למודלים שונים של גידולים ולאסטרטגיות שונות של שינוי גנטי לפי הצורך.
- מטיל דרישות בטיחות ביולוגית ורווחת בעלי חיים בשל השימוש ברקמות אנושיות ובמארחים עם מערכת חיסונית לקויה.
