Name: טיהור הזרימה Cytometry מבוסס ס cerevisiae זיגוטות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: למדו שיטת זיגוטות שמרים S. cerevisiae באמצעות מיון ציטומטריית זרימה דו-שלבי להשגת טוהר של כ-90%. הפרוטוקול מאפשר בידוד אוכלוסיות זיגוטות טהורות לחקר מעברי הפלואיד לדיפלואיד בתאים אוקריוטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר ר &#39;מיכאל Sramkoski לעזרה עם cytometry זרימה, ד&quot;ר Purnima Jaiswal וד&quot;ר די וו עבור קלט מוקדם יותר ואיליה Aylyarov לעזרה באיורים. נתמך על ידי NIH גרנט R01GM089872 וCytometry &amp; Core מתקן הדמיה מיקרוסקופית של קייס מרכז הסרטן המקיף (P30 CA43703).

<ol><li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerskowitz%2C+I+%22Control+of+cell+type+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Mating+type+and+mating-type+interconversion%22">Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion</a>. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).</li>
<li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li>
<li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li>
<li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li>
<li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li>
<li>Dujon, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDujon%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Yeast+Saccharomyces%3A+Life+Cycle+and+Inheritance%22">Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance</a>. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).</li>
<li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+yeast+mating+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li>
<li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mating%3A+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li>
<li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+mating+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li>
<li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+D+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%2C+2005+Edition%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition</a>. , Cold Spring Harbor Press. (2005).</li>
<li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li>
<li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+on+the+move%3A+insights+from+yeast+vacuole+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הזמינות של זיגוטות מטוהרות צריכה להקל על מחקרים ביוכימיים כולל transcriptomics, פרוטאומיקה וlipidomics, כמו גם חקירה של מנגנונים שבאמצעותם זיגוטות עוברות מחזור תא כניסה מחדש, שיפוץ דופן תא, מאפייני ניצנים וירושה, וכו &#39;לחלופין, זיגוטות יכולות להיות שנוצרו החל עם זנים שנשאו מוטציות אופייניות באחד או שני ההורים. יתר על כן, זיגוטות המטוהרות, כמו לתאי ההפלואידים או דיפלואידי, אפשר להקפיא במדיום המכיל גליצרול 15% ולאחר מכן הפשירו לפקח היבטים של ניצנים חוזרים. <p class="jove_cont...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב / ציוד </td><td> מקור </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, GFP קידוד cytoplasmic 11) </td><td> א Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, הקידוד RPL25 התמזג mCherry </td><td> א ג&#39;ונסטון </td><td></td></tr><tr><td> sonicator הפישר FB120 </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td></tr><tr><td> צינור פוליפרופילן עם מסננת כובע </td><td> BD פלקון </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> microfuge קירור </td><td> טומי </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> פתרון נדן הזרימה cytometry </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Cytometer זרימת דגם ההשתקפות iCyt </td><td> סוני </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ deconvolution DeltaVision </td><td> אפלייד Precision </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ epifluorescence הזקוף </td><td> ליקה </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> ניסוח גלוקוז CSM הערות: לצלחות אגרו, פשוט כוללות אגרה 2% (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור הזרימה cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

זיגוטות הן ביניים מהותיים בין הפלואידים ומדינות דיפלואידיים במחזור החיים של אורגניזמים רבים, כולל שמרים (איור 1) 1. S. cerevisiae זיגוטות תוצאה מהאיחוי של תאים מסוג ההפלואידים הזדווגות מובחן (מאטה, MATalpha) ולהצמיח diploids היציב המקביל שיוצרים ברציפות רבה כמו 20 צאצאי דיפלואידי כתוצאה מחטיבות mitotic להדהים הסימטריות 2. היווצרות הזיגוטה היא בניצוחו של רצף מורכב של אירועים: בתהליך זה, גורמי הזדווגות מסיסות נקשרים לקולטנים מאותו המקור, מפעילים מפלי איתות קולטן בתיווך המאפשרים הפסקה של מחזור התא ומגיע לשיא באיחוי תאי תאים. זיגוטות עשויות לשמש מודל למולידו או תפקוד של תאי גזע. למרות שדברים רבים כבר למד על היווצרות זיגוטות ולמרות זיגוטות שמשו כדי לחקור שאלות תא מולקולרית של כללי significance, כמעט כל המחקרים נעשה שימוש בתערובות הזדווגות שבזיגוטות מעורבבות עם רוב אוכלוסייה של תאי ההפלואידים 3-8. היבטים רבים של הביוכימיה של היווצרות הזיגוטה והחיים המתמשכים של הזיגוטה לכן יישארו לא נחקרו. דיווחים על טיהור זיגוטות שמרים לתאר פרוטוקולים המבוססים על תכונות שיקוע 9, אולם, הליך המבוסס על שקיעה זו לא הניב כמעט 90% טוהר בידות שלנו. יתר על כן, יש לו את החסרון שתאים נחשפים לסורביטול hypertonic. לכן פתחנו הליך טיהור תכליתית. לצורך כך, זוגות של תאי ההפלואידים מבטאים חלבוני ניאון אדומים או ירוקים היו שותף מודגרות-לאפשר היווצרות הזיגוטה, שנקטף בזמנים שונים, וכתוצאה מכך זיגוטות טוהרו באמצעות פרוטוקול מיון cytometry מבוסס זרימה. טכניקה זו מספקת הערכה חזותית נוחה של טוהר והתבגרות. הטוהר הממוצעשל השבר כ 90%. על פי העיתוי של קציר, זיגוטות בדרגות שונות של בשלות ניתן לשחזר. את הדגימות המטוהרות מספקות נקודה נוחה של יציאה ללימודים &quot;omic&quot;, להתאוששות של צאצאים ראשוניים, ולחקירה שיטתית של תאי אב זה.

כדי לטהר זיגוטות של<em&gt; ס cerevisiae</em&gt;, תאי ההפלואידים מסוג ההזדווגות נגדי הונדסו חלבונים אדומים או ירוקים ניאון, שיתוף מודגרות-לאפשר היווצרות הזיגוטה, ומופרד באמצעות פרוטוקול זרימת cytometry מבוסס. החלק מאוד המועשר מאפשר לימודים, התאוששות שלאחר מכן &quot;omic-&quot; של צאצאים ראשוניים, ובדיקה שיטתית של המורפוגנזה הזיגוטה.

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

זיגוטות הן תוצרי ביניים חיוניים בין מצבים הפלואידיים (haploid) לדיפלואידיים (diploid) במחזור החיים של אורגניזמים רבים, כולל שמרים (איור 1) 1. *S. cerevisiae*...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק אוכלוסייה מטוהרת של זיגוטות שמרים. דבר זה מושג תחילה על ידי ביטוי של Polyzonin מתויג ב-GFP ציטופלזמי או ב-mCherry, בתאים הפלואידיים של סוגי הזיווג המנוגדים; התאים גדלים עד לשלב הלוגריתמי, ולאחר מכן משולבים ומודגדים יחד כדי לאפשר יצירה של זיגוטות.לאחר מכן אוספים את תערובת ההזדווגות וממיינים אותה באמצעות ציטומטריית זרימה במצב התאוששות (recovery mode) כדי לבודד תאים כפולי-חיוביים לאדום ולירוק. תת-אוכלוסייה זו כוללת ישויות טרום-זיגוטיות וזיגוטיות כאחד. כדי לטהר את הדגימה עוד יותר, אוכלוסיית התאים הכפולי-חיוביים לאדום ולירוק עוברת סבב שני של מיון באמצעות ציטומטריית זרימה.שימוש במצב טוהר (purity mode). הליך זה מניב טוהר ממוצע של 90%zygotes בהתבסס על בדיקה ויזואלית וכימות של התאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היתרונות של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טיהור מבוסס שיקוע, הם הבאים.ראשית, טכניקה זו מספקת הערכה חזותית נוחה של טוהר והבשלת הזיגוטים. שנית, בביצוענו, רמת הטוהר הממוצעת של הפракציה הזיגוטית היא כ-90%, רמה גבוהה בהרבה מזו של שיטות קיימות. שיטת הניקוי שלנו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות ביולוגיות מרכזיות הנוגעות למעבר מהפלואידי לדיפלואידי בתאים איקריוטיים ברמה המולקולרית, שכן קיימת שמירה משמעותית על התהליך בין איקריוטים נחונים לגבוהים.לפיכך, חקר זיגוטים של שמרים אמור לקדם הבנה כללית של ביולוגיית הזיגוט. ניתן לטעון כי זיגוטים יכולים להיחשב גם כמודל לתפקוד של תאי אב או תאי גזע Grow s cera, VCA, Matt A and Matt alpha BY 47 41. גדלו תאי Haid על ידי מריחה של מקלוני שמרים קפואים על מצע גידול מוצק של אגר ודגירה של הצלחות בטמפרטורת החדר או ב-30 °C עד להופעת מושבות ביום שלפני טיהור הזיגוטים. סמנו שני מבחנות קוניות של 50 ml לתרבית של tabloids שעברו טרנספורמציה עם soluble GFP ו-RPL 25 M.Cherry. זרעו תרבית אחת עם tabloids שעברו טרנספורמציה ומבטאים soluble GFP בציטופלזמה, ואחת עם tabloids שעברו טרנספורמציה ומבטאים חלבון ריבוזומלי בודד.RPL 25 מאוחה עם m cherry. גדלו את התרביות בערבוב למשך לילה בטמפרטורה של 23 °C עד להגעה ל-A 600 שלא יעלה על 1.0. כדי לבצע הצלבה, התחילו בהתאמת הצפיפות האופטית של כל דגימה ל-1.0 במצע טרי, שווה בקירוב ל-3×10⁷ תאים למיליליטר.בשלב הבא, ערבבו נפחים שווים של שתי התרביות במצע טרי, בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter. בצעו ערבוב מהיר (Vortex) קצר שלוש פעמים, ולאחר מכן ערבבו ב-Vortex למשך 10 שניות. מקמו את קצה הפ pipette סנטימטר אחד מעל פני התמיסה.צילחת CSM גלוקוז בטמפרטורה. הפעילו טיימר לספירה לאחור של 30 דקות ופזרו באופן מיידי טיפות של 40 µL של התרביות המעורבבות לאורך פריפריה של הצילחת, כך שיכסו את ההיקף שלה. הניחו לצלחות להתייבש על משטח העבודה ללא המכסה למשך כ-30 דקות.לאחר שהנוזל נספג, כסו את הצלחות והשאירו אותן ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך 1.75 עד 2.5 שעות. תהליך של צמיחה מקוטבת יוצר מורפולוגיה אופיינית דמוית schmo. במהלך שלב ה-schmo, שני תאי ה-haid ממשיכים לצמוח זה לעבר זה עד להשגת מגע בין-תאי.היתוך תאים עוקב מוביל להיווצרות הזיגוטה. הזיגוטה הצעירה נכנסת מחדש למחזור התא המיטוטי, מה שיוצר את הניצן הדיפלואידי הראשון שלה. לאחר הדגירה, הניחו את הצלחות על קרח ואספו את הדגימות על ידי שטיפת אזורי טיפות מיובשים בודדים 10 עד 20 פעמים עם 150 microliters של CSM glucose קר.אספו את תמיסת השטיפה למבחנות קוניות של 15 milliliters על קרח. לאחר מכן, תוך שמירה על הדגימות על קרח, בצעו סוניקציה באמצעות מתמר (probe sonicate) לכל אחת מהמבחנות 10 פעמים ב-60% amplitude. לאחר הסוניקציה, ודאו באמצעות מיקרוסקופ פאזה כי נותרו מעט אגרגטים או שאינם נותרים כלל; הצפי הוא ש-15 עד 50% מהתאים יגבשו זיגוטים. בשלב זה, השאירו את מבחנת התאים במצב אנכי, ללא הפרעה, על קרח למשך 10 דקות כאמצעי זהירות כדי לאפשר לכל האגרגטים שנותרו לשקוע.שאבו את 90% העליונים של הנפח וסננו אותם דרך צינור פוליפרופילן בעל רשת ניילון ומכסה עם מסננת. בניסוי טיפוסי, משחזרים 10⁷ תאים מצלחת אחת ובארבעה מיליליטר של CSM. מיון תאי גלוקוז מבוצע באמצעות flow cytometer מדגם Sony eyesight reflection עם HAPS 1 בעל טיפ של 100 micron.התחילו בבחירת לייזרי העירור בתוכנת win list 3D עבור עירור GFP. השתמשו בלייזר Argonne ion הכחול בעוצמה של 500 milliwatt באורך גל של 488 nanometers עבור עירור M cherry. השתמשו בלייזר בעוצמה של 100 milliwatt באורך גל של 561 nanometers בתוכנת הבקרה HAPS.ודאו שמצב התאושה (recovery mode) נבחר, ושלחץ המעטפת למיון מוגדר ל-21.5 pounds per square inch עם תדר טיפות של 43, 400 drops per second ולחץ דגימה של 20.5 pounds per square inch. בסו את פרמטרי המיון על סמך גרף של פיזור קדימה (forward scatter) מול פיזור אחורי (back scatter) כדי לבצע gating לתאים חיים. שימו לב כי מכשיר ה-Sony eyesight שבו נעשה שימוש כאן מציין באופן ייחודי את גרף הפיזור הצדי כפיזור אחורי, אך פיזור אחורי זה שקול תפקודית לפיזור צדי. הגדירו גרף פליטה של M cherry מול GFP כדי לחלק את האירועים לארבעה רבעים.אדום חיובי, ירוק שלילי, אדום חיובי, ירוק חיובי, אדום שלילי, ירוק שלילי ואדום שלילי, ירוק חיובי. השתמשו בתאים שאינם פלורסצנטיים כסטנדרט לקביעת הרביע השלילי לאדום והשלילי לירוק. עבור המיון הראשוני.בחר במצב התאוששות (recovery mode) ואסוף את הדגימות לתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה מקוררות המכילות 250 milliliters של CSM glucose קר. לאחר האיסוף, שקע את התאים במשך 10 שניות במהירות מקסימלית במיקרו-צנטריפוגה מקוררת. לאחר הסבב, שאב את תמיסת הזרימה והשעה אותם מחדש ב-500 microliters של CSM glucose קר.מאחר שלא ניתן להגיע להעשרה גבוהה באמצעות מיון בודד, בצעו סוניקציה קצרה בעזרת מתמר (probe) לדגימה המזוהה חלקית פעמיים בעוצמה של 60% amplitude. מיינו את התאים שוב, הפעם תוך שימוש באפשרות purity mode על תאים חיוניים (viable cells), והפיקו גרף פליטה של M cherry לעומת GFP של המשקע, התאים המזוהים, והשעיקו מחדש את המשקעים ב-0.5 עד 1.0 milliliters של CSM glucose. לאחר הסבוב, העבירו 0.5 milliliters לכל אחת מהבארים בלוח של 24 בארים, ולאחר מכן נערו את התאים למשך 15 דקות.בפלטות של 24 בארות בטמפרטורה של 23 degrees Celsius כדי לאפשר התאוששות מטבולית. להכנת פדי agros, הרתיחו תרחיף של 1.5%agros ב-CSM glucose בתוך מבחנה קונית של 15 milliliter. ערבבו את התמיסה קצרה במערבל וורטקס ולאחר מכן העבירו דגימות של 0.3 milliliter מתמיסת ה-agro למשטח של לפחות שתיים עד שלוש זכוכיות מיקרוסקופ סטנדרטיות; כסו מיד את הזכוכיות בזכוכית שנייה.אין להפעיל לחץ. יש להמתין 10 דקות לקירור השקופיות. אם לא נעשה שימוש מיידי בפסנתי ה-aros, יש להניחם בתא לח (humidified chamber) בטמפרטורת החדר מבלי להסיר את השקופית העליונה.ניתן לאחסן אותם למשך יום אחד. לאחר מכן, הסירו בעדינות את השקופית העליונה על ידי החלקתה אופקית. תוך הקפדה על השארת משטח חלק ומניעת הפרעה לשכבת ה-aros, טפטפו במהירות, תוך דקה עד שתיים, מנות של 1 µL של תאים ששקעו על רפידות ה-aros, ללא מגע עם המשטח.כסו מיד את הדגימה בעזרת כיסוי זכוכית ריבועי, והסִירו עודפים באמצעות להב תער בעל שפיץ יחיד. השתמשו במזרק כדי למרוח וזלין לאורך שולי כיסוי הזכוכית. צלמו תמונות באמצעות מערכת delta vision עם עדשת שמן 100x ללא binning. שדה ראייה אידיאלי הוא כזה המציג שכבה בודדת של תאים עם מרווח מספיק ביניהם כדי להבחין בין תאים בודדים. צלמו במרווחים של 0.2 עד 0.4 micron לאחר השלמת הדמיון.בצעו דקונבולוציה באמצעות תוכנת soft works 5.0 0.0 ועבדו באופן מינימלי עם דקונבולוציה סטנדרטית של 20 מחזורים. התאימו את עוצמת הפלואורסצנציה האדומה לעומת הירוקה כדי למזער כל אות רקע בתמונות ה-DeVol כדי להעריך את הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים בתאים שעברו טרנספורמציה; התאים נותחו באמצעות ציטומטריה זרימתית לפני ואחרי ביצוע ההכלאה. באופן מהותי, כל הטרנספורמנטים של M cherry היו אדומים וכל הטרנספורמנטים של GFP היו ירוקים.שימו לב כי למרות שאות ה-M cherry היה פחות אינטנסיבי מאות ה-GFP, הוא זוהה הן באמצעות ציטומטריה והן באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התאים מוינו, והתאים הבהירים ביותר, המופיעים ברביע R two, נבחרו ותורגדו יחד עם הטרנספורמנט של ה-GFP למשך 2.5 שעות, כפי שניתן לראות כאן. המדגם החיובי לאדום ולירוק ייצג 8.89% מכלל האוכלוסייה לאחר ההכלאה.דגימה זו הועשרה ל-52.4% לאחר מיון ההשגחה הראשון, ולאחר מכן הועשרה עוד יותר במיון הניקיון השני, כאשר 21 תכשירים דומים של תאים חיוביים לאדום וחיוביים לירוק נבחנו תחת מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה. כדי להעריך את מספר הזייגוטים, נמצא כי הניקיון הממוצע היה 90%. המזהמים היו או הפלואידים (haplos) ירוקים או אדומים, או זוגות של הפלואידים שהיו במגע, וזאת כדי לקבוע את קינטיקת הופעת הנבט הזייגותי הראשוני, כמו גם את השכיחות והפיזור של מיקומי נבטים זייגותיים מדיאליים, לטרליים וטרמינליים. הפלואידים הוקצו להכלאה למשך 1.75 שעות או 2.5 שעות, מוינו באמצעות ציטומטריית זרימה ונבחנו לאחר מכן תחת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפיגנית.כאשר התאים נאספו לאחר 1.75 שעות, יותר מ-50% מהם היו ללא ניצות והיו מדיאליים. ניצות לטראליות או טרמינליות היו מיוצגות באופן שווה לאחר 2.5 שעות. עם זאת, היה מספר שווה בקירוב של זיגוטים בכל אחת מארבע הקטגוריות: ללא ניצות, ועם ניצות מדיאליות, לטראליות או טרמינליות.נראה כי מבנה הזייגוטים נשאר ללא שינוי במהלך הטהרה. שימו לב כי ה-GFP חודר לגרעין וניתן למצוא אותו בגרעין גם כאשר הגרעינים טרם התאחו. תאי ES בולטים כספירות שחורות שאינן פלואורסצנטיות.התוצר הסופי של תהליך הטיהור מניב אוכלוסייה מגוונת בשלבי התפתחות שונים. זיגוטים המסומנים באות A, לא עברו היתוך. זיגוטים מסוג B הם ללא חמאה (unbuttered).לסוג C יש ניצן קטן, לסוג D יש ניצן גדול יותר, וזיגוטים מסוג E עומדים לעבור Cytokinesis; שימו לב גם כי רבים מהזיגוטים המוקדמים עדיין מראים קו חלוקה מרכזי שאינו פלואורסצנטי, וכי ניתן לראות לעיתים קרובות את מבנה ההורשה של ה-valar נמתח מהזיגוט אל תוך הניצן. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לכלול הן את מיון ההתאוששות והן את מיון הטוהר העוקב. מצאנו כי המיון השני הוא המפתח להגברת טוהר הזיגוטים במוצר הסופי.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ביצוע מיון של זיגוטים מטוהרים באמצעות ציטומטריית זרימה, הערכת רמת הטוהר בשיטות מיקרוסקופיות, ואופן קיבוע וצילום של זיגוטים באמצעות מיקרוסקופיית דקונבולוציה פלואורסצנטית.

flow-cytometry-based-purification-of-s-cerevisiae-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה יעילה להשגת מטוהרים שברים meiotic קיימא מהעכבר testis מתואר, המשלבת תא מעודן דיסוציאציה פרוטוקול עם מיון פלורסנט התא הפעיל (FACS). שיטה זו מנצלת את ההבדלים בתוכן דנ"א צפיפות גרעינית של שברים meiotic בדידים.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

אנו מדווחים על מכשיר שיטה חדשה ללמוד תאי עוברים. תאים בודדים מסודרים דווקא מערכי microcavity. כליאת 3D שלהם היא צעד לקראת סביבות 3D נתקלו בתנאים פיסיולוגיים מאפשרת התמצאות אברון. על ידי שליטת צורת תא, התקנה זו ממזערת השתנות שדווחה מבחני תקן.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

אנו מתארים אסטרטגיית מיון עבור זרעונים של עכברים באמצעות זרימה ציטומטרית. הזרעונים ממוינים לארבע אוכלוסיות טהורות ביותר, כולל עגולות (שלבי זרע 1-9), התארכות מוקדמת (שלבי זרע 10-12), התארכות מאוחרת (שלבי זרע 13-14) וזרעונים מוארכים (שלבי זרע 15-16). צביעת DNA, גודל וגרגיריות משמשים כפרמטרים לבחירה.

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

עבודה זו מתארת ​​את סטנדרטיזציה של שיטה להשיג אוכלוסיות תאים נבט מטופלים מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים. זהו פרוטוקול פשוט המשלב דיסוציאציה פשוטה מכנית, מכתים עם Hoechst-33342 ו propidium iodide, ו FACS מיון, עם יישומים רחב במחקרים השוואתיים של ביולוגיה הרבייה הגברית.

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

מאמר זה מתאר זרימה מבוססת-סריג cy, מבוסס הפרוטוקול כדי לכמת הרכבה עצמית חלבון בשני S. cerevisiae ס ו HEK293T תאים.

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

בדיקה זו היא שיטה פשוטה לכמת תאים hematopoietic בפיתוח זברה עוברית. תאי דם של דגי זברה מנותקים נתונים לניתוח ציטומטריה זרימה. זה מאפשר גילוי של מומים בדם בבעלי חיים מוטנטים ולאחר שינוי גנטי.

שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

כאן אנו מתארים שיטה ציטומטרית חדשנית לזרימה לבידוד פרוספקטיבי של אריתרואיד יחידה יוצרת התפרצות מוקדמת (BFU-e) ואריתרואיד יחידה יוצרת מושבה (CFU-e) ישירות ממח עצם וטחול טריים של עכבר. פרוטוקול זה, שפותח על סמך נתוני תעתיק חד-תאיים, הוא הראשון לבודד את כל אבות האריתרואידים של הרקמה בטוהר גבוה.

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

למדו שיטת זיגוטות שמרים S. cerevisiae באמצעות מיון ציטומטריית זרימה דו-שלבי להשגת טוהר של כ-90%. הפרוטוקול מאפשר בידוד אוכלוסיות זיגוטות טהורות לחקר מעברי הפלואיד לדיפלואיד בתאים אוקריוטיים.

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס

גלה סרטונים נוספים