Heterotypic תלת ממדי במבחנה מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור מודלים טיפוסיים תלת מימדיים של התפתחות סרטן השחלות בשלב מוקדם. ראשית, ליצור קווי תאים אימורטליים H turt שמקורם ברקמות אפיתל ופיברובלסטים ראשוניים ותקינים של השחלות. לאחר מכן, כדי לשחזר את הארכיטקטורה in vivo ואת האינטראקציות המורכבות של תאי התא הקיימות בתרבית המשותפת של השחלות, קווי תאי אפיתל וסטרומה במודלים תלת מימדיים של ספרואידים S ממשיכים לתקן ולהכתים את תרביות האורגנואידים ולנתח ביטוי של סמנים ספציפיים על מנת לחקור תכונות מולקולריות של אינטראקציות אפיתל סטרומליות.

התוצאות שהתקבלו מראות כיצד שינויים בתא תאי הסטרומה של מודלים טיפוסיים תלת מימדיים יכולים להשפיע על הפנוטיפ של תאי אפיתל בתרבית משותפת. מודלים טיפוסיים תלת מימדיים יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר של סרטן השחלות, כגון חקירת מקורות מחלה זו והבהרת תפקידה של המיקרו-סביבה הסטרומלית בהתחלה והתפתחות של גידול. היישומים של טכניקות אלה מתרחבים לאבחון וטיפול במחלות בהשוואה לשיטות תרבות תלת מימדיות אחרות.

ניתן ליישם טכניקה זו על מגוון רחב יותר של נפחי תרבית תאים ויישומים במורד הזרם. לדוגמה, ניתן להשתמש בהומו תלת מימדי ובתרביות טיפוסיות לבדיקת סמים במבחנה. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות מודל אחרות, כגון בחקר סוגי גידולים מוצקים אחרים או במחלה שפירה.

העבר את רקמת השחלה הטרייה למעבדת תרבית התאים במדיום גידול פיברובלסטים שחלתי רגיל אימורטליזציה בתוספת אנטיביוטיקה ותעלולים נוספים. שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר PBS כדי להסיר את כל תאי האפיתל שנשארים מחוברים באופן רופף לרקמה. לאחר מכן, העבירו את הדגימה בתוספת PBS לכלי תרבית P 100 נקי בעזרת מכשירים סטריליים, העבירו את הרקמה לכלי תרבית נקי P 100 יבש שני.

חותכים את הרקמה לחתיכות של 0.5 סנטימטר רבוע ומעבירים כל חתיכה לכלי P 100 נפרד. המשיכו לחתוך את הרקמה לחתיכות בגודל של פחות ממילימטר רבוע אחד. לאחר מכן הוסף 20 מיליליטר של מדיה ומוניטור תרבית INOF GM לצמיחת תאים באמצעות מיקרוסקופ פאזה.

ודא שהתאים נדבקים למנה תוך 24 שעות. עקוב אחר צמיחת התאים באמצעות מיקרוסקופ פאזה תאים בדרך כלל נצמדים לצלחת תוך 24 שעות לאחר שבוע. הסר כל רקמה שאינה נדבקת על ידי שאיפה, חדש את המדיה ולאחר מכן האכילו מחדש תרביות פעמיים בשבוע תוך שבוע עד שלושה שבועות כאשר מושבות התאים בגודל של כ-500 מיקרון.

בודד את השיבוטים באמצעות נסיעות ודיסקי שיבוט מצופים. על מנת לאשר 100% תאים פיברובלסטיים. צלח דגימה מקו התאים על החלקות כיסוי זכוכית ובצע צביעה אימונו-פלואורסצנטית לסמן פיברובלסטי, סמן אפיתל וסמן תאי אנדותל.

יום אחד לפני התמרה רטרו-ויראלית של מעבר H Turt, תא הפיברובלסטים הרגיל של השחלות מבודד ממנה אחת של P 100 לשלוש מנות P 100. ניתן לרכוש או לייצר נתן ויראלי מוכן מראש באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים להעברת מיטת תינוק של תאי HEC 2 9 3 T. להכנת תמיסת הפולי המה, שקלו 1.5 גרם פולי המה, והניחו בבקבוק סטרילי.

הוסף ביולוגיה מולקולרית של 95 מיליליטר, כיתה, אתנול מוחלט ומים מזוקקים בדרגת תרבית תאים של חמישה מיליליטר. מניחים את תמיסת הפולי המה באמבט מים בחום של 65 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה. מצפים את כלי תרבית הרקמות בתמיסת פולי המה טרייה.

יבש באוויר את כלי תרבית התאים בתוך מכסה המנוע הלמינר. ניתן להשתמש בנדנדה עדינה על פלטפורמת נדנדה כדי להבטיח ציפוי אחיד של כלים או צלוחיות בגודל גדול יותר. אם תמיסת הפוליוס מתייבשת מהר מדי, המשטח לא יהיה חלק.

אם תרצה, טפל בפיברובלסטים לפני תרבית תלת מימדית, למשל, לאינדוקציה של הזדקנות, טפל בתאים במינונים תת-קטלניים של מי חמצן. שחזר והרחיב את תרביות תאי ה-INOF והאפיתל במבחנה כדי להכין מספיק תאים להקמת סטרואידים הטרוטופיים תלת מימדיים. לאחר שטיפת PBS של חמש דקות, הוסף 15 מיליליטר בינוני לצלחת הפולי המה.

בינתיים, הוסף טריפסין לתאי הפיברובלסטים הרגילים של השחלות כדי לנתק אותם מצלחת התרבית. לאחר שלוש עד חמש דקות, נטרלו את הטריפסין בנפח שווה של אמצעי תרבית וקצרו את התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר בינוני וערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה או מערבולת עדינה.

לאחר מכן השתמש בדגימה של 10 מיקרוליטר כדי לספור תאים ברי קיימא באמצעות כחול טריאן. כעת הוסף 4 מיליון תאי INOF למדיום שכבר חולק לצלחת המצופה פולי המה. הרכיבו את נפח המדיה של התרבות ל-20 מיליליטר ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני.

עקוב אחר הצטברות התאים לסטרואידים רב-תאיים במיקרוסקופ פאזה כדי להזין מחדש את תרביות הספרואידים S כל יומיים-שלושה. הניחו את הצלחות בזווית על פיפטה. אפשר לספרואידים להתיישב והסר בזהירות כ -16 מיליליטר מהמדיה המותשת בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר.

מוסיפים לתרבות 16 מיליליטר מדיום טרי וחוזרים לחממה ביום השביעי. צור תרביות הטרוסקופיות טיפוסיות על ידי הוספת תאי אפיתל לפיברובלסטים phe. ראשית, הכינו תרחיפים של תאי אפיתל בשחלות על ידי טריפסין כפי שתואר קודם לכן לאחר ספירת תאים.

שטפו פעם אחת במדיום INOF GM כדי למנוע העברת גורמי גדילה ממצע הגידול האפיתלי. לאחר חידוש המדיום של תרביות ה-OID הפיברובלסטים, הוסף את תאי האפיתל ביחס של ארבעה לאחד פיברובלסטים לתרבית תאי אפיתל. ה-OIDs ההטרוטופיים ב-INOF GM מאכילים תרביות טיפוסיות כל יומיים-שלושה למשך 14 ימים נוספים.

עבור אימונוהיסטוכימיה, תקן את ה-PHE עם פורמין ניטרלי, גלולה את ה-PHE והחלף את הפורמלין באתנול 70%. המשך לעיבוד לפרפין באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים המשמשים לרקמות אנושיות. ניתן לחתוך סטרואידים משובצים בפרפין ולצבוע אותם ב-h ו-e של סמנים מולקולריים ספציפיים באמצעות כימיה אימונו-היסטית.

לחלופין, שטפו את הסטרואידים ב-PBS וקבעו 4%para פורמלדהיד. לאחר מכן הטמע את הדגימות במדיום OCT והקפאה מהירה לחיתוך קריוסטט וצביעה אימונו-פלואורסצנטית לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. שטפו את הסטרואידים ב-PBS ונתקו על ידי טריפסין או עיכול אקוטן ב-37 מעלות צלזיוס.

ניתן לקדם דיסוציאציה מוחלטת של סטרואידים לתרחיף תא בודד על ידי פיפטינג של התמיסה למעלה ולמטה עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד. הקפד לא להגדיל את התאים, נטרל את התגובה בנפח שווה של מדיום תרבית והסר גושי תאים על ידי העברת המתלה דרך מסננת תאים של 40 עד 70 מיקרון. לאחר מכן גלולה את התאים ושטפו עם PBS וספרו מחדש את מספר התאים הרצוי בעובדות חוצצים ומכתימים בהתאם להוראות היצרן במעבדה שלנו, הפכנו חלקית תאי אפיתל בשחלות ותרבית תאים אלה עם פיברובלסטים שחלתיים רגילים ומזדקנים כדי לחקות התפתחות סרטן שחלות בשלב מוקדם.

בשחלה לפני גיל המעבר צביעה אימונו-פלואורסצנטית של פיברובלסטים שחלתיים נורמליים מורטלים מראה שגם פיברובלסטים שחלתיים נורמליים ראשוניים וגם פיברובלסטים שחלתיים נורמליים אימורטליים מבטאים חלבון ספציפי לפיברובלסטים, אך הם אינם מבטאים ציטוקרטין שבע ומבטאים מנטון. תאי פיברובלסטים שחלתיים רגילים שגודלו לבד בצורה תלת מימדית PHE מציגים מורפולוגיה סיבובית ומטריצה חוץ-תאית בשפע. כאן, פיברובלסטים שחלתיים רגילים נחשפו למי חמצן כדי לגרום להזדקנות במשך שבעה ימים ולאחר מכן תרבית עם תאי אפיתל שחלות שעברו טרנספורמציה חלקית למשך 14 יום.

כדי להבחין בין שני סוגי התאים, הסטרואידים שהתקבלו היו צבועים במערכת החיסון עבור mim one כסמן התפשטות ו-pan cytokeratin כסמן אפיתל. כימות הנתונים מצביע על כך שהמיקרו-סביבה המזדקנת מקדמת תכונות ניאופלסטיות של תאי אפיתל שעברו טרנספורמציה חלקית, בעוד שמיקרו-סביבה רגילה מעכבת התקדמות ניאופלסטית, מאפיינים היסטולוגיים של תאים נורמליים וממאירים שאינם ניתנים לזיהוי כאשר התאים מתורבתים כחד-שכבות משוחזרות. כאשר התאים עוברים לתרבית ספרואידית, למשל, ניתן לזהות מאפיינים היסטולוגיים של סרטן שחלות תאים שקופים בתרביות תלת מימדיות של קווי תאי סרטן שחלות תאים שקופים, אך לא בתרביות חד-שכבתיות של אותם תאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר תרביות טיפוסיות תלת מימדיות שבעזרתן ניתן לחקור את האינטראקציות בין תאי אפיתל וסטרומליים. במהלך היווצרות הגידול המוקדמת. בעת הגדרת תרבית תלת מימדית, חשוב להתאים את מספרי התאים בהתאם ליישום במורד הזרם, מה שמאפשר אובדן מסוים של חומר במהלך העיבוד.

לאחר השליטה, ניתן להגדיר תרביות תלת מימד תוך שעה אחת לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון זרימה ציטומטרית בשילוב עם פרופיל מיקרו-קרני ביטוי גנים כדי לנתח את השינויים הגלובליים בביטוי הגנים המתרחשים בתרביות טיפוסיות תלת מימדיות אך אינם מתגלים בתנאי תרבית חד-שכבתית. זה יאפשר ניתוח של מסלולי האיתות הדו-כיווניים המתרחשים במיוחד תחת תרבית ליבה תלת מימדית. מיקרו-סביבה.