Name: Heterotypic תלת ממדי במבחנה מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: למד ליצור מודלים תלת-ממדיים הטרוטיפיים של סרטן השחלות בשלב מוקדם באמצעות שיתוף תרביות של תאי אפיתל וסטרומה. שיטה זו מאפשרת לחקור את האינטראקציות בין התאים ואת השפעת המיקרו-סביבה הסטרומלית על התפתחות הגידול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה בוצע בקק הספר לרפואה, אוניברסיטת קליפורניה, ארה&quot;ב, ויוניברסיטי קולג&#39; בלונדון, בריטניה. KL ממומן על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק 5 U19 CA148112-02. BG מומן על ידי מענק מפרויקט צדקת ערב המגבית האונקולוגית הגינקולוגית (בריטניה). חלק מעבודה זו בוצעה בUCLH / UCL היה קצת מימון מהמחלקה לבריאות תכניתו של NIHR Biomedical Research Centre המימון.

<ol><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J. Clin. , (2011).</li>
<li>Office for National Statistics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cancer+Statistics+registrations%3A+registrations+of+cancer+diagnosed+in+2008%22">Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008</a>. , England. (2011).</li>
<li>Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+type+and+substage+predict+survival+in+stage+I+and+II+ovarian+carcinoma%3A+insights+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications.</a> Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).</li>
<li>Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+subtypes+are+different+diseases%3A+implications+for+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies.</a> PLoS Med. 5, e232(2008).</li>
<li>Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer%3A+can+we+make+the+clinical+diagnosis+earlier%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier.</a> Cancer. 104, 1398-1407 (2005).</li>
<li>Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impartial+comparative+analysis+of+measurement+of+leukocyte+telomere+length%2FDNA+content+by+Southern+blots+and+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR.</a> Nucleic Acids Res. 39, e134(2011).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repeat+amplification+protocol+%28TRAP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP.</a> Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
<li>Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+fibroblasts+promote+neoplastic+transformation+of+partially+transformed+ovarian+epithelial+cells+in+a+three-dimensional+model+of+early+stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer.</a> Neoplasia. 12, 317-325 (2010).</li>
<li>Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+modelling+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells.</a> Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).</li>
<li>Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+genetic+and+clinical+heterogeneity+in+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers.</a> Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).</li>
<li>Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+biology+models+of+ovarian+and+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer.</a> Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).</li>
<li>Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+description+of+a+3D+in+vitro+model+for+the+study+of+epithelial+ovarian+cancer+%28EOC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC.</a> Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).</li>
<li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases%3A+Biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li>
<li>Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcell-mediated+chromosome+transfer+identifies+EPB41L3+as+a+functional+suppressor+of+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers.</a> Neoplasia. 12, 579-589 (2010).</li>
<li>Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+pathogenesis+of+serous+ovarian+cancer+and+its+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact.</a> J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).</li>
<li>Kurman, R. J., Shih, I. eM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+extraovarian+origin+of+epithelial+ovarian+cancer--shifting+the+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm.</a> Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הביולוגיה של סרטן השחלות האפיתל בשלב מוקדם (EOC) הוא הבין היטב. אולי אחד המכשולים העיקריים בתחום זה במשך שנים רבות היה חוסר הבנה של מקורות הרקמות הספציפיים של המחלה, ושל המשמעות של תפקיד microenvironment בפיתוח EOC. במהלך השנים האחרונות, הוא הפך להיות ברור כי EOC הוא מחלה הטרוגנית עם תת מרובים מובחן histophathological, כנראה עם מקור תאי שונה עבור תת סוגים שונים. לדוגמה, הנתונים הנוכחיים מצביעים על כך שEOCs הרירי בדרגה גבוהה עשויה לנבוע משני תאי שחלת צינור הפרשת האפיתל ותאי אפיתל מ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> ספק </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> PolyHEMA, מתאים לתרבית תאים </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P3932 </td></tr><tr><td> אתנול כיתת ביולוגיה מולקולרי </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> E7023 </td></tr><tr><td> מים סטריליים לתרבית תאים </td><td> VWR </td><td> 12001-356 </td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> M6395 </td></tr><tr><td> בינוני 199 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> M2154 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי Hyclone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30088.03 </td></tr><tr> &lt;td&gt; גנטמיצין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G1397 </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A2942 </td></tr><tr><td> pBABE-hygro-hTERT </td><td> Addgene </td><td> 1773 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> VWR </td><td> 12001-766 </td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-072 </td></tr><tr><td> תא מסננת (40 או 70 מיקרומטר) </td><td> VWR </td><td> 21008-949 21008-952 </td></tr><tr><td> נוגדן אנטי פיברובלסטים פני חלבון, השיבוט 1B10 </td><td> סיגמא </td><td> F4771 </td></tr><tr><td> נוגדן אנטי הפאן cytokeratin (C11) </td><td> סנט קרוז </td><td> SC-8018 </td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine רומיד) </td><td> סיגמא </td><td> 107689 </td></tr><tr><td> TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS </td><td> רוש </td><td> 12013789001 </td></tr><tr><td> TeloTAGGG Assay אורך הטלומרים </td><td> רוש </td><td> 12209136001 </td></tr></tbody></table> לוח 1. ריאגנטים וציוד המכונים במחקר זה.

heterotypic תלת ממדי<em&gt; במבחנה</em&gt; מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

סרטן שחלות אפיתל (EOCs) הם הגורם המוביל למוות ממחלה ממארת גינקולוגית בחברות מערביות. למרות התקדמות בטיפול ניתוחי וטיפולי הכימותרפיה משופרים מבוססים-Platinum, חל שיפור קטן בשיעורי הישרדות EOC במשך יותר מארבעה העשורים 1,2. בעוד בשלב I. גידולי בעלי סיכויי הישרדות 5-שנה&gt; 85%, שיעורי הישרדות בשלב III / המחלה הרביעית הם &lt;40%. לפיכך, השיעור הגבוה של תמותה לEOC ניתן היה להפחית באופן משמעותי אם גידולים התגלו בשלבים מוקדמים יותר, הניתנים לטיפול, עוד 3-5. כיום, בסיס הגנטי וביולוגי המולקולרי של התפתחות מחלה בשלב מוקדם הוא הבין היטב. באופן ספציפי יותר, מעט מאוד ידוע על תפקידו של המיקרו במהלך חניכת גידול, אך גורמי סיכון ידועים לEOCs (למשל גיל וזוגיות) מצביעים על כך שmicroenvironment ממלא תפקיד מרכזי בהיווצרות המוקדמת של EOCs. לכן פתחו מודלים תלת ממדיים heterotypicשל שניהם שחלה הנורמלית ושל סרטן שחלות בשלבים מוקדם. לשחלה הנורמלית, אנחנו משטח שיתוף תרבותי נורמלי שחלות אפיתל (יפסיד) ופיברובלסטים נורמלים סטרומה (INOF) תאים, שהונצחו על ידי תמרת retrovrial של המקטע הקטליטית של holoenzyme telomerase האנושי (hTERT) כדי להאריך את תוחלת החיים של תאים אלה בתרבות. למודל בשלבים הראשונים של שינוי שחלות האפיתל תא, ביטוי יתר של אונקוגן CMYC בתאים יפסידו, שוב בשיתוף עם תאים בתרבית-INOF. מודלי heterotypic אלה שמשו כדי לחקור את ההשפעות של הזדקנות והזדקנות על השינוי והפלישה של תאי אפיתל. כאן אנו מתארים את הצעדים מתודולוגיים בפיתוח של אלה מודל תלת ממדי; מתודולוגיות אלה אינן ספציפיות להתפתחות של שחלה נורמלית ורקמות סרטן שחלות, ויכולות לשמש כדי לחקור סוגי רקמות אחרים שבו אינטראקציות תא סטרומה ואפיתל הן בסיסיות היבט של תחזוקת רקמות ודיפיתוח sease.

אנו מתארים שיטות לקביעה<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים תלת מימדיים heterotypic מרכיבים fibroblasts בשחלות והשחלות משטח רגיל או תאי אפיתל סרטן שחלות. אנו דנים בשימוש במודלים אלה ללמוד אינטראקציות stromal-האפיתל המתרחשים במהלך התפתחות סרטן שחלות.

Heterotypic תלת ממדי<em&gt; במבחנה</em&gt; מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

סרטני שחלה אפיתליאליים (EOCs) הם גורם התמותה המוביל מגידולים גינקולוגיים ממאירים בחברות מערביות. למרות התקדמויות בניתוחים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ליצור מודלים טיפוסיים תלת-ממדיים של שלבים מוקדמים בהתפתחות סרטן השחלה. ראשית, יש להפיק שורות תאים מומינרליים H turt הנגזרים מרקמות אפיתליאליות ופיברובלסטיות נורמליות ראשוניות של השחלה. לאחר מכן, כדי לשחזר את הארכיטקטורה in vivo ואת האינטראקציות התאיות המורכבות הקיימות בשחלה, יש לבצע תרבית משותפת של שורות תאים אפיתליאליות וסטרומליות במודלים תלת-ממדיים של ספרואידים (S spheroid). לבסוף, יש לקבע ולצבוע את תרביות האורגנואידים ולנתח את הביטוי של סממנים ספציפיים במטרה לחקור מאפיינים מולקולריים של אינטראקציות בין הסטרומה לאפיתל.התוצאות שהתקבלו מראות כיצד שינויים במרכיב תאי הסטרומה של מודלים טיפוסיים בתלת-ממד יכולים להשפיע על הפנוטיפ של תאי אפיתל המגודלים בקו-קלטורה. מודלים טיפוסיים בתלת-ממד יכולים לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום המחקר של סרטן השחלה, כגון חקירת מקורי המחלה והבהרת תפקידו של המיקרו-סביבה הסטרומלית בהיווצרות ובפיתוח הגידול. יישומי טכניקות אלו פה רחבים יותר לעבר אבחון המחלה וטיפולה בהשוואה לשיטות גידול אחרות בתלת-ממד.ניתן להחיל טכניקה זו על מגוון רחב יותר של נפחי תרביות תאים ועל יישומים המשכיים. לדוגמה, ניתן להשתמש בתרביות תלת-ממדיות הומוגניות וטיפיות לבדיקת תרופות in vitro. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות מודל אחרות, כגון במחקר של סוגים אחרים של גידולי ממס או במחלות שפירות.העבירו את רקמת השחלה הטריה למעבדה לתרבית תאים בתוך מצע גידול לפיברובלסטים נורמליים מו अमरליזים של השחלה, בתוספת אנטיביוטיקה ואנטימיקוטים נוספים. שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם 5 mL של PBS כדי להסיר תאים אפיתליאליים שנותרו מחוברים באופן רפוי לרקמה. לאחר מכן, העבירו את הדגימה יחד עם ה-PBS לכלי תרבית P 100 נקי. באמצעות מכשירים סטריליים, העבירו את הרקמה לכלי תרבית P 100 נקי ויבש שני.חתוך את הרקמה לחתיכות של 0.5 סמ"ר והעבר כל חתיכה לצלוחית P 100 נפרדת. המשך לחתוך את הרקמה לחתיכות שגודלן פחות ממילימטר רבוע אחד. לאחר מכן, הוסף 20 milliliters של מצע INOF GM והעבר לתרבית. עקוב אחר צמיחת התאים באמצעות מיקרוסקופיית פאזה.יש לוודא שהתאים נצמדים לצלחת תוך 24 שעות. יש לעקוב אחר צמיחת התאים באמצעות מיקרוסקופיית פאזה. התאים בדרך כלל נצמדים לצלחת תוך 24 שעות. לאחר שבוע, יש להסיר רקמות שאינן צמודות באמצעות שאיבה, להשלים את המצע ולאחר מכן להזין מחדש את התרביות פעמיים בשבוע במשך שבוע עד שלושה שבועות, כאשר מושבות התאים הן בגודל של כ-500 microns.בודדו את השיבוטים באמצעות טריפסין ודיסקי שיבוט מצופים. כדי לאשר כי התאים הם 100% פיברובלסטיים, זרעו דגימה של שלב התאים על כיסויי זכוכית ובצעו צביעה אימונופלואורסצנטית עבור סמן פיברובלסטי, סמן אפיתליאלי וסמן לתאי אנדותל.יום אחד לפני טרנסדוקציה רטרוביראלית של מעבר H Turt, העבירו את בידודי תאי הפיברובלסטים השחלאיים הנורמליים מצלחת P 100 אחת לשלוש צלחות P 100. ניתן לרכוש על-נוזל ויראלי מוכן מראש או להפיקו במעבדה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לטרנספקציה משולבת של תאי HEC 2 9 3 T. להכנת תמיסת poly Hema, שקלו 1.5 גרם poly hema והניחו בבקבוק סטרילי.הוסיפו 95 milliliters של אתנול מוחלט בדרגת ביולוגיה מולקולרית, וחמישה milliliters של מים מזוקקים בדרגת תרבית תאים. הניחו את תמיסת ה-poly Hema במקלח מים בטמפרטורה של 65 °C עד להמסה מלאה. צפו את צלחות תרבית הרקמות בתמיסת poly Hema שהוכנה טרייה.ייבשו את צלחות תרבית התאים באוויר בתוך תא זרימה למינרית. ניתן להשתמש בטלטול עדין על גבי פלטפורמת טלטול כדי להבטיח ציפוי אחיד של בקבוקונים או צלחות בגודל גדול יותר. אם תמיסת ה-polyus תתייבש מהר מדי, פני השטח לא יהיו חלקים.במידת הצורך, ניתן לבצע טיפול מקדים בפיברובלסטים לפני הגידול בתרבית תלת-ממדית; לדוגמה, להשראת סנצנסיות (הזדקנות תאית), טפלו בתאים במינונים תת-קטלניים של מי חמצן. השקימו והרחיבו את תרביות תאי ה-INOF והתאים האפיתליאליים in vitro כדי להכין מספיק תאים להקמת סטרואידים הטרוטופיים תלת-ממדיים. לאחר שטיפה של חמש דקות ב-PBS, הוסיפו 15 milliliters של מצע לצלחת ה-poly hema.בינתיים, הוסיפו trypsin לתאי פיברובלסטים שחלתיים נורמליים של השחלה כדי להפרידם מהצלחת התרבית. לאחר שלוש עד חמש דקות, נטרלו את ה-trypsin עם נפח שווה של מצע גידול ואספו את התאים באמצעות סנטריפוגה. השאיבו מחדש את משקע התאים ב-5 mL מצע וערבבו היטב באמצעות פיפוט מעלה ומטה או ערבוב עדין ב-vortex.לאחר מכן, השתמשו בדגימה של 10 µL כדי לספור תאים חיוניים באמצעות trypan blue. כעת, הוסיפו 4 מיליון תאי INOF למדיום שכבר הועבר לצלחת המצופה ב-poly hema. השלימו את נפח מצע התרבית ל-20 mL והדגרירו בטמפרטורה של 37 °C, 5% carbon dioxide.עקבו אחר האגרגציה התאית לספרואיד רב-תאי באמצעות מיקרוסקופיית פאזה כדי להזין מחדש את תרביות הספרואידים כל יומיים עד שלושה ימים. הניחו את הפלטות בזווית על גבי פיפטה. המתינו עד שהספרואידים ישקעו והסִירו בזהירות כ-16 milliliters של המצע המרוקן באמצעות פיפטה של 5 milliliters.הוסיפו 16 מיליליטר של מצע רענן לתרבית והחזירו למדגרה ביום השביעי. צרו תרביות הטרוטיפיות על ידי הוספת תאי אפיתל לפיברובלסטים. ראשית, הכינו סספנסיות של תאי אפיתל שחלאות באמצעות טריפסין כפי שמתואר קודם לכן, לאחר ספירת התאים.שטפו פעם אחת במדיום INOF GM כדי למנוע מעבר של גורמי גדילה ממדיום הגדילה של התאים האפיתליאליים. לאחר חידוש המדיום של תרביות ה-OID של הפיברובלסטים, הוסיפו את התאים האפיתליאליים ביחס של ארבעה פיברובלסטים לכל תא אפיתליאלי. את ה-OIDs ההטרוטופיים במדיום INOF GM מאכילים באופן טיפוסי כל יומיים עד שלושה ימים למשך 14 ימים נוספים.עבור אימונוהיסטוכימיה, קבעו את ה-PHE באמצעות פורמלין בניטרול באפר, השקיעו את ה-PHE והחליפו את הפורמלין ב-70% ethanol. המשיכו בעיבוד לפאראפין תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים המשמשים לרקמות אנוש. ניתן לחתוך סטרואידים המוטמעים בפאראפין ולצבוע אותם ב-h and e או בסממנים מולקולריים ספציפיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה.לחילופין, יש לשטוף את הסטרואידים ב-PBS ולקבע ב-4% para formaldehyde. לאחר מכן, יש להטמיע את הדגימות במדיום OCT ולהקפיא במהירות (snap freeze) לצורך חיתוך בקריוסטט וצביעה אימונופלואורסצנטית להערכה באמצעות זרימה ציטומטרית (flow cytometry). שטפו את הסטרואידים ב-PBS ובצעו דיסוציאציה באמצעות עיכול בטריפסין או ב-Accutane בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.ניתן לקדם דיסוציאציה מלאה של סטרואידים לסספנסיה של תאים בודדים על ידי פיפטינג של התמיסה מעלה ומטה באמצעות טיפ פיפטה של מיליליטר אחד. יש להיזהר לא לפגוע בתאים. נטרלו את התגובה עם נפח שווה של מצע תרבית והסירו גושים של תאים על ידי העברת הסספנסיה דרך מסננת תאים של 40 עד 70 מיקרון. לאחר מכן, השקיעו את התאים, שטפו עם PBS וספרו אותם; השביעו מחדש את מספר התאים הרצוי בבופר FACS וצבעו בהתאם להוראות היצרן. במעבדה שלנו, השגנו תאי אפיתל שחלה שעברו טרנספורמציה חלקית, וביצענו אותם בתרבית משותפת (co-culture) עם פיברובלאסטים של שחלה נורמליים ובעלי גיל תאי (senescent) כדי לדמות התפתחות של סרטן שחלה בשלב מוקדם.בשחלה של אישה לפני גיל menopause, צביעה אימונופלואורסצנטית של פיברובלסטים שחלאיים נורמליים מהונחים (immortalized) מראה כי הן פיברובלסטים שחלאיים נורמליים ראשוניים והן פיברובלסטים שחלאיים נורמליים מהונחים מבטאים חלבון ספציפי לפיברובלסטים, אך אינם מבטאים cytokeratin seven ומבטאים vimentin. תאי פיברובלסט שחלאיים נורמליים שגודלו לבדם במבנה תלת-ממדי (3D) מראים מורפולוגיה של צורת כישOMe (spindled) ומטריצה חוץ-תאית שופעת. במחקר זה, פיברובלסטים שחלאיים נורמליים נחשפו למימן פéroקסיד כדי להשרות סנסקנס (הזדקנות תאית) לאורך שבעה ימים, ולאחר מכן גודלו יחד עם תאי אפיתל שחלאיים שעברו טרנספורמציה חלקית למשך 14 ימים.כדי להבחין בין שני סוגי התאים, הסטרואידים שהתקבלו נצבעו אימונו-היסטוכימית עבור mim one כסמן לשגשוג ועבור pan cytokeratin כסמן אפיתליאלי. כימות הנתונים מעלה כי הסביבה המיקרוסקופית המזדקנת מקדמת מאפיינים נאופלסטיים של תאים אפיתליאליים שעברו טרנספורמציה חלקית, בעוד שסביבה מיקרוסקופית נורמלית מעכבת התקדמות נאופלסטית; מאפיינים היסטולוגיים של תאים נורמליים וממאירים, שאינם ניתנים לזיהוי כאשר התאים גדלים כשכבה אחת (monolayers), שוחזרים. כאשר התאים מועברים לתרבית ספרואידית, למשל, ניתן לזהות מאפיינים היסטולוגיים של סרטני שחלה מסוג תאים בהירים בתרביות תלת-ממדיות של שורות תאים של סרטן שחלה מסוג תאים בהירים, אך לא בתרביות שכבה אחת של אותם תאים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מקריאים תרביות תלת-ממדיות טיפוסיות למחקר של האינטראקציות בין תאי אפיתל לתאי סטרומה במהלך השלבים המוקדמים של התפתחות הגידול. בעת הקמת תרבית תלת-ממדית, חשוב להתאים את מספר התאים בהתאם ליישום הבא בתהליך, תוך התחשבויות באובדן מסוים של חומר במהלך העיבוד.ברגע שהשיטה תשלט, ניתן להקים תרביות תלת-ממד (3D) תוך שעה אחת בהתאם לנוהל זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ציטומטריה של זרימה בשילוב עם פרופיל מיקרו-מערך של ביטוי גנים, כדי לנתח את השינויים הגלובליים בביטוי הגנים המתרחשים בתרביות טיפוסיות תלת-ממדיות אך אינם מזוהים בתנאי תרבית של שכבה אחת (monolayer). דבר זה יאפשר ניתוח של מסלולי האיתות הדו-כיווניים המתרחשים באופן ספציפי תחת מיקרו-סביבה של תרבית ליבה תלת-ממדית.

heterotypic-three-dimensional-vitro-modeling-stromal-epithelial

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Assay אישור mesothelial המתוארת כאן מנצלת את התאים שכותרתו fluorescently ואת זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו להמחיש כמותית למדוד את יחסי הגומלין של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial. Assay מתווך זה מדגים את השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

בסרטון זה אנו מדגימים פיתוח מודל תלת מימדי במבחנה של רירית חלל הצפק. תרבית אורגנוטיפית זו יכולה לסייע בחקירת הידבקות תאי סרטן השחלות, פלישה והתפשטות.

מידול גרורות סרטן השחלות ברירית חלל הצפק: שיטה להקמת מודל תלת ממדי במבחנה של רירית הצפק

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתרבית משותפת בתלת מימד, שימושי לחקירת אינטראקציות רב-תאיות ואפנון תלוי מטריצה חוץ-תאית של התנהגות תאי סרטן. במודל ניסיוני זה, תאים סרטניים מתורבתים על ג'ל קולגן המשובץ בפיברובלסטים הקשורים לסרטן אנושי.

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבניית מודל תלת מימדי במבחנה של רירית חלל הצפק, המורכב מתאי מזותל אנושיים ראשוניים ופיברובלסטים בשכבות עם מטריצה חוץ-תאית, ככלי לחקירת הדבקה, פלישה והתפשטות של תאי סרטן השחלות.

דוגמנות השלבים המוקדמים של סרטן השחלות הפצה בתרבות Organotypic של אדם חלל הבטן

אנו מדגימים שיטה ליצירת פונדקאיות תלת מימדיות לסרטן השד, שניתן לתרבית באמצעות מערכת ביו-ריאקטור זלוף כדי לספק חמצן וחומרים מזינים. לאחר הגדילה, הפונדקאיות מקובעות ומעובדות לפרפין להערכת פרמטרים מעניינים. מוסברת ההערכה של פרמטר אחד כזה, צפיפות התאים.

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

כדי ללמוד התקדמות גידול שחלות במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, spheroids רב-תאיים היו בתרבית microdevice תחת זרימת נוזל מדומה. מודל 3D דינמיקה זו מחק את סביבת intraperitoneal עם המרכיבים התאיים מכאניים שבו גרורות סרטן השחלות מתרחשות.

דוגמנות התנהגות אליפטית סרטן השחלות תאיים בתוך Microdevice הצפק 3D דינמי

תאי גזע של סרטן השחלות (OCSC) אחראים על התחלת סרטן, הישנות, עמידות טיפולית וגרורות. נישת כלי הדם OCSC נחשבת לקידום התחדשות עצמית של OCSCs, מה שמוביל לכימורסטיות. פרוטוקול זה מספק את הבסיס להקמת מודל נישה כלי דם OCSC הניתן לשחזור במבחנה.

הערכת התכונות האנגיוגנטיות של תאים דמויי גזע של סרטן השחלות באמצעות מערכת תרבית קו-תרבית תלת-ממדית, NICO-1

פרוטוקול זה מתאר את הקמתו של מודל אקס ויו תלת-ממדי (3D) של אינטראקציה בין תאים סרטניים ל-omentum. המודל מספק פלטפורמה להבהרת מנגנונים מעודדי גידול בתוך נישת השומן ולבדיקת טיפולים חדשניים.

מודל Ex Vivo של סרטן השחלות גרורות פריטוניאליות באמצעות Omentum אנושי

יש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן הלוכדים הצלבה הטרו-תאית כדי לחקור גרורות סרטניות. המחקר שלנו מציג את הדור של הטרו-אפיתל סטרומלטי-תאי בסביבה נטולת פיגומים ופיגומים שניתן להשתמש בהם לחקר פלישה והתפלגות מרחבית תאית.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

פרוטוקול זה מפרט את הפיתוח של מודלים של עכברים בדרגה גבוהה של קרצינומה שחלות סרוזית (HGSOC) במבחנה וב-vivo. מגזירת אורגנואידים של חצוצרות עכברים, השינוי הגנטי שלהם לסיכום גנטיקה של HGSOC אנושי, והחדרתם לבורסה השחלתית של עכברים סינגניים להתפתחות גידולים in vivo .

פיתוח קווי אורגנואידים שמקורם בעכבר מתאי אפיתל חצוצרות למידול קרצינומה של שחלות סרוזיות בדרגה גבוהה

למד ליצור מודלים תלת-ממדיים הטרוטיפיים של סרטן השחלות בשלב מוקדם באמצעות שיתוף תרביות של תאי אפיתל וסטרומה. שיטה זו מאפשרת לחקור את האינטראקציות בין התאים ואת השפעת המיקרו-סביבה הסטרומלית על התפתחות הגידול.

Heterotypic תלת ממדי

גלה סרטונים נוספים