הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

המטרה הכוללת של הניסוי המודגם בסרטון זה היא להעריך האם הפפטיד האנטי-מיקרוביאלי ליין ממלא תפקיד בשיפור הקוליטיס הנגרמת על ידי דקסטרן סולפט בעכברים. זה מושג על ידי הזרקת מח עצם מעכברים מסוג בר לעכברים חוקיים ונוקאאוט מוקרנים ומח עצם מעכברי נוקאאוט לעכברי בר מוקרנים. מח העצם המושתל יפיק תאי דם חדשים אצל המקבל של גנוטיפ התורם.

העכברים המקבלים נחשפים לאחר מכן לדקסטרן סולפט כדי לגרום לקוליטיס לאחר ארבעה שבועות. השתלה מוצלחת מאומתת על ידי זרימה ציטומטרית ונזק לרקמת המעי הגס מוערך על ידי היסטולוגיה. מתקבלות תוצאות המראות כי קוליטיס משתפרת כאשר מח עצם מסוג בר מושתל בעכברי נוק-אאוט.

לעומת זאת, קוליטיס מחמירה כאשר מח עצם נוקאאוט מושתל בעכברים מסוג בר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בקביעת ביטויי הגנים מתאים שמקורם במח עצם או תאים שאינם שמקורם במח עצם בדלקת או זיהום. C 57, שש שחור, סוג פרא ועכברי נוקאאוט C מומלצים לניסוי זה כדי לאפשר לעקוב אחר עכברי הבר ועכברי הנוק-אאוט.

תאים תורמים לאחר השתלת מח עצם. השתמש בעכברי CD 45.1 כדי לייצג עכברים מסוג בר וב-CD 45.2 עבור עכברי הנוק-אאוט. התרשים המוצג כאן מתאר את מערך הניסוי שהוקצו חמישה עכברים תורמים ו-10 עכברים נמענים לכל קבוצה.

עבור קבוצות A ו-B יושתל מח עצם מעכברי הבר לעכברי הנוק-אאוט. קוליטיס תושרה בקבוצה A, אך לא בקבוצה B.עבור קבוצה C ו-D.מח עצם יושתל מעכברי הנוקאאוט לסוג הבר וקוליטיס תושרה בקבוצה C רק עבור E ו-F.ההשתלה תהיה מסוג בר לסוג פרא ולקבוצות G ו-H. ההשתלה תהיה מנוקאאוט לנוקאאוט. כדי להכין מח עצם תורם להעברה לעכברים מוקרנים, התחל בחילוץ מח עצם מעצמות של עכברים שהוקרבו בארון בטיחות ביולוגית.

השתמש במכשירי דיסקציה סטריליים כדי לחשוף את עצם הזרוע, עצם הירך, השוקה והפיבולה ללא חיבור שרירים ורצועות ולהעביר אותם לצלחת פטרי. חותכים את שני קצוות העצמות כדי להראות את מח העצם האדום. ואז אוחז באחת העצמות בעזרת מלקחיים.

שטפו את מח העצם האדום החוצה עם PBS קר עם מזרק של שלושה מיליליטר ומחטים של 25 מד לצלחת פטרי אחרת. לאחר מכן שטוף את העצם מהקצה השני כדי להניב יותר תאי מח עצם. חזור על תהליך זה עם כל אחת מהעצמות.

אסוף את מח העצם מסוג בר והפיל עכברים בנפרד. השתמש במזרק של שישה מיליליטר עם מחט בגודל 18 אינץ' כדי לשבור פקקי מח עצם אדומים על ידי שאיפה ופליטה חוזרות ונשנות. לאחר מכן השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להעביר את מח העצם שנאסף לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר שכל מח העצם הועבר, סובב את מח העצם כלפי מטה ב-740 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה על ידי מערבולת למשך חמש עד 10 שניות. לגלולה, הוסף שוב חמישה מיליליטר של מאגר ליזה XRBC אחד לכל מערבולת עכבר תורם למשך חמש שניות ודגר בדיוק שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שלוש דקות, הוסף 20 מיליליטר PBS קר לכל צינור וערבב בהיפוך כדי לעצור את הליזה. לאחר מכן שפכו את התוכן דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. שטפו את הצינור המקורי בחמישה מיליליטר PBS והעבירו את התמיסה למסננת התאים.

ממשיך לאסוף את הזרימה דרך הצינור החרוטי. לאחר מכן הביאו את הנפח עד 50 מיליליטר עם PBS וערבבו על ידי היפוך. לאחר מכן, קבע את ספירת התאים הקיימא על ידי אי הכללה של טריאן כחול באמצעות ציטומטר המו.

לאחר קביעת ספירת התאים, סובב את תאי מח העצם ב-913 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, הסירו את הסופרנטנט בהתבסס על ספירת התאים הכוללת. Resus משהה את הגלולה ב-PBS באחת פעמים 10 עד שמינית תאים למיליליטר.

תאי מח העצם מוכנים כעת להעברה לעכברים מושתלים מוקרנים. העכברים מסוג הבר והנוקאאוט הנמענים לניסוי זה הוקרנו ב-1000 ראד כמתואר במסמך הנלווה, העכברים מגודלים ומאוחסנים במתקן נטול פתוגנים ארבע עד 24 שעות לאחר שההקרנה חיממה את העכברים הנמענים על כרית חימום מתחת למנורת חימום כדי להזריק את מח העצם של התורם. הנח עכבר נמען במסננת, נגב את הזנב עם 70% אתנול כדי לעקר את מקום ההזרקה ולקדם הרחבת כלי דם מקומית להזרקה קלה.

באמצעות מזרק אינסולין עם מחט בקוטר 28 וחצי, יש להזריק פעם אחת 10 לתאים השביעיים באחד עד 200 מיקרוליטר לווריד הזנב של כל עכבר לאחר ההזרקה. הנח את העכבר בכלוב עם עד שלושה עכברים אחרים שהוזרקו בארבעת השבועות הראשונים לאחר ההזרקה. שמור את העכברים המוזרקים בכלובי חיטוי עם מים המכילים את עיטור הסולפה האנטיביוטי.

זה מאפשר לבעלי החיים זמן להחזיר את החסינות, להחליף כלובים, מים מטופלים באנטיביוטיקה ומזון כל ארבעה ימים כדי לשמור על היגיינה. ארבעה שבועות לאחר הקרנה והשתלת מח עצם, עברו למים רגילים ללא אנטיביוטיקה ותחזקו את העכברים במשך שבועיים נוספים כדי להחזיר את המיקרופלורה הרגילה של המעיים שלהם. שישה שבועות לאחר הזרקת מח עצם, מדוד את משקל הגוף הראשוני כדי לגרום לקוליטיס.

תנו לעכברים בקבוצת הניסוי קוליטיס 5% דקסטרן סולפט במי השתייה. חמישה ימים לאחר מכן, אספו את הדם ההיקפי מארבעה עכברים בשפופרות מצופות הפרין והניחו אותו על קרח. לאחר מכן, בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, שלבו 300 מיקרוליטר דם עם 300 מיקרוליטר של צביעת תאים, חצצו והעבירו את הדם לחמש מבחנות ציטומטריית זרימה המסומנות אחת עד חמש כל אחת עם 100 מיקרוליטר על קרח.

לאחר הקרבת העכברים, מדוד שוב את משקל הגוף וחשב את השינוי. נתח רקמות מעי גס וקצב אותו בפורמלין לצביעה h ו-d. ואז השג תאי מח עצם כמו קודם.

חלקו את מח העצם התלוי לחמישה צינורות מיקרו צנטריפוגות המסומנים באחד עד חמישה כל אחד עם 100 מיליליטר. כהכנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה, הכינו את תערובת הנוגדנים לכל צינור מתאים בחושך כמתואר במסמך הנלווה, דגימות דם ומח עצם המסומנות מספר אחת ישמשו כבקרות ולא יהיו דגימות דם ומח עצם מוכתמות. המסומן מספר שתיים יהיה מוכתם בבקרת איזוטיפ פיצי, בקרת איזוטיפ PE ותמיסת חסימת CD 16 slash 32.

בקרות איזוטיפ אלה משמשות לאישור הספציפיות של דגימות קשירת נוגדנים ראשוניות. תווית מספר שלוש תהיה מוכתמת ב-FZ CD 45.1 ו-CD 16 slash 32. דגימות תמיסת חסימה המסומנות מספר ארבע יוכתמו בתקליטור 45.2 ובתקליטור 16 32.

פתרון חוסם. תיוג בצבע יחיד יכול לחשוף את נוכחותם של תאים תורמים או נמענים בדם או במח העצם. דגימות ברורות המסומנות מספר חמש יוכתמו עבור CD 45.1, CD 45.2 ו-CD 16 slash 32.

חוסמים כאן את התיוג הצבעוני הכפול מראה יחס יחסי בין תאי התורם והמקבל בדם או במח העצם. הוסף חמישה מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים שניים וחמישה לצינורות הדגימה שלהם. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים שלוש וארבעה לצינורות הדגימה שלהם.

דגרו את כל הצינורות על קרח למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסף שני מיליליטר, מאגר ליזה XRBC אחד לכל צינור. לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך 15 דקות נוספות על קרח בחושך.

סובב את התאים ב-350 פעמים G, חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט השהה מחדש את הגלולה עם מאגר צביעת תאים של 500 מיקרוליטר בחושך. ואז מערבולת קצרה.

לאחר מכן, בצע זרימה ציטומטרית על דגימות הדם ומח העצם של הכתם החיסוני. בחר FZ לייצוג CD 45.1 מסוג פרא ו-PE לייצוג תקליטור נוקאאוט 45.2. נתח את תוצאות ציטומטריית הזרימה באמצעות התוכנה של פלו ג'ו.

חשב את היחס בין יחס התאמה E ל-PE או יחס PE להתאמה E כדי לקבוע אם הגנוטיפ התורם הוא גנוטיפ דומיננטי בדם ובמח העצם. תמונה זו מציגה תמונות h ו-e לדוגמה של מעי גס עם היסטולוגיה תקינה וקוליטיס DSS. תמונות היסטולוגיות נקבעות על סמך נזק לרקמות הריריות וחדירת נויטרופילים לרקמות הריריות והתת-ריריות.

לפיכך, ציון היסטולוגי גבוה יותר מצביע על קוליטיס חמורה יותר כדי לבדוק אם ליין ממלא תפקיד במניעת קוליטיס. מח עצם הוחלף בין עכברים מסוג בר ועכברי נוקאאוט כפי שמתואר בסרטון זה. לאחר מכן הוערכה ההיסטולוגיה וקיבלה ניקוד כפי שמוצג כאן.

ציוני ההיסטולוגיה עלו משמעותית כאשר מח עצם של עכבר נוקאאוט הוכנס לעכברים מסוג בר מוקרנים. לעומת זאת, הציונים ירדו משמעותית כאשר מח עצם מסוג בר הוכנס לעכברי נוק-אאוט. נתונים אלה מצביעים על כך של-C אנדוגני מתאים שמקורם במח עצם יש השפעות אנטי דלקתיות ומשפר קוליטיס כדי לוודא שההשתלה הצליחה בעכברים אלה.

ציטומטריית זרימה בוצעה גם על מח עצם ודם מהעכברים לאחר ההשתלה. כתמי מח עצם מסוג פרא חזקים עבור Fitz CD 45.1 אך לא pe, CD 45.2 כפי שמוצג כאן, כתמי מח עצם נוקאאוט חזקים עבור PE אך לא Fitz כפי שמוצג כאן. עם זאת, לאחר ההשתלה, גם מח עצם וגם דם מעכברים מסוג בר שקיבלו מח עצם נוקאאוט נצבעו חזק עבור PE אך לא פיץ, מה שמצביע על כך שהאוכלוסייה הדומיננטית של תאים מוכתמים הייתה מהתורם.

כמו כן, מח עצם ודם מעכברי נוקאאוט שקיבלו מח עצם מסוג בר נצבעו חזק עבור פיצי אך לא pe שוב מאשר שהאוכלוסיות המוכתמות השולטות היו ממקור תורם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבצע ניסוי השתלת מח עצם ואמור להיות מסוגל לשנות קוליטיס באמצעות תאים שמקורם במח עצם.