Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים
17 בדצמבר 2012
טכניקה הנקראת C Omprehensive M Icroarray P Profiling olymer (CoMPP) לאפיון של glycans דופן תא הצמח מתואר. שיטה זו משלבת את הספציפיות של נוגדנים חד שבטיים המופנים לאפיטופים glycan מוגדרות עם פלטפורמה אנליטית microarray מיניאטורי המאפשרת הקרנה של מופע glycan במגוון רחב של הקשרים ביולוגיים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשוות את הרכב הפולימרים של דופן התא במגוון רחב של צמחים או סוגי רקמות באמצעות מערכי מיקרו-גליקנים (glycan microarrays). ראשית, קצרו את רקמות הצמח הרלוונטיות. לאחר הומוגניזציה, הכינו שאריות שאינן ממיסות באלכוהול (alcohol insoluble residues).
לאחר מכן, חלץ את הגליקנים של דופן התא באופן סדרתי באמצעות CDTA ונתרס hydroxide. לאחר מכן, הדפס את תמריתי הגליקנים של דופן התא במערך זעיר (microarray) באמצעות רובוט. בחן את המערכים הזעירים באמצעות נוגדנים חד-סגוליים המופנים לגליקנים של דופן התא, וכמת את אותות הנקודות במערכים הזעירים.
בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתוצאות כדי לקבוע את השכיחות היחסית של epitope של גליקנים על פני מערך דגימות רלוונטי. פיתחנו את שיטת המיקרו-מערך זו כאשר זיהינו את הצורך לספק תמונת מצב גלובלית של נוכחות גליקנים בדופן התא על פני סוגי רקמות צמחים מרובים בו-זמנית, ולגלות הבדלים בהרכבם. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות מסורתיות, כגון אנליזה של מונוסכרידים, הוא שזוהי פלטפורמה מבוססת מיקרו-מערך שבה ניתן לסרוק מאות דגימות בו-זמנית. זוהי שיטה מהירה ומקיפה לאפיון הרכב דופן התא. עבור כל רקמה רלוונטית, התחילו עם דגימות משולשות של 100 milligrams משקל רטוב של רקמות צמחים תוך שימוש בחנקן נוזלי.
הומוגניזו את הדגימות לאבקה דקה, ולאחר מכן העבירו את ההומוגנאט למבחנות קוניות מפלסטיק בנפח 10 milliliter כדי להכין חומר מדופן התא. השביבו את ההומוגנאט ב-10 milliliters של 80%ethanol בטמפרטורת החדר וערבבו ב-vortex בעוצמה במשך שתי דקות. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 3, 500 times G והשליכו את הנוזל העליון (supernatant).
חזרו על שטיפות ה-70% ethanol לפחות שלוש פעמים או עד שהנוזל העליון (supernatant) יהיה צלול. לאחר מכן, בצעו שטיפה סופית עם 100% acetone. פלטו את השאריות שאינן ממיסות באלכוהול והניחו להן להתייבש באוויר למשך לילה כדי לקבל אבקה עדינה והומוגנית; נפו את דגימות השאריות שאינן ממיסות באלכוהול באמצעות נפה בעלת רשת של 0.4 millimeter squared.
בשלב הבא, שקלו 10 milligrams של דגימות השארית שאינה מסיס באלכוהול לתוך מיקרו-מבחנות, שבכל אחת מהן נמצא פיתול זכוכית של שלושה מילימטרים לצורך ערבוב. לצורך מיצוי פקטינים ופולימרים הקשורים לפקטינים, הוסיפו 500 microliters של CDTA בריכוז 50 millimolar לכל דגימה, ערבבו קצרות במכשיר vortex ולאחר מכן ערבבו באמצעות tissue izer במשך שלוש שעות בתדר של שמונה hertz. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 12,000 times.
G. הסירו בזהירות את העל-מיצים (supernatants) ואחסנו אותם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטפו את המשקעים פעמיים עם מיליליטר אחד של מים דה-יוניזציה. הסירו את כל הנוזל מהמבחנות שנותר ממשקע דופן התא.
המשיכו לחלץ גליקנים מקשרים באמצעות 500 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז ארבעה מול עם 0.1% נתרן הידריד. בעזרת תהליך החילוץ שתואר קודם לכן, אחסנו את העלונות המכילות גליקנים מקשרים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטפו את המשקעים פעמיים במים דה-יוניים.
לאחר מכן, השתמשו ב-500 µL של תמצית קיין. סנטריפוגו כדי להוציא פולימרים שיוריים כגון תאית, והפרידו את העל-נוזל המכיל פולימרים ממוצקים של דופן התא כדי להסיר חלקיקים.
בשלב הבא, דללו את דגימות הפולימר של דופן התא במים דה-יוניים להכנת סדרת דילול של פי 0, 5 ו-25. הגדירו פרמטרים כגון גובה הפין, איסוף וזמן שהייה (dwell time), ושלבי שטיפה עבור המערך המיקרוסקופי (microarray). שמרו על לחות של 60% בתא ההדפסה כדי למנוע התאיידות של הדגימות.
כעת התחל את ההדפסה. הרובוט משתמש בפיני ערוץ קפילרי כדי להדפיס תמיסות מפלטית הדגימות על גבי ממברנת ניטרוסלולוז המחוברת לפלטה שטוחה במכונה. כל נקודה במערך מכילה 15 nanoliters של תמיסה ומודפסת בשלוש חזרות.
הדפיסו מערכי מיקרו (microarrays) זהים זה לצד זה על גבי הממברנה וגזרו אותם למערכים בודדים. כדי להפחית קישור לא ספציפי, חסמו כל מערך מיקרו בתמיסה של 5% אבקת חלב דל שומן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
הוסיפו את הנוגדנים המונוקלונליים הספציפיים לגליקן של דופן התא, לאפיטופים, והדגרימו למשך שעתיים. כדי להסיר קישור לא ספציפי, שטפו את המיקרו-מערכים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. לאחר מכן, חשפו את המיקרו-מערכים לנוגדן שני המצומד ל-horse radish peroxidase למשך שעתיים, לאחר שלושה שטיפות ב-PBS של חמש דקות כל אחת.
פתח את המערכים הזעירים (microarrays) באמצעות סובסטראטים כרומוגניים או כימילומינסנטיים. סרוק את המערכים הזעירים הבודדים באמצעות סורק שולחני ברזולוציה גבוהה. שמור את התמונות כקבצי TIFF שליליים של 16 ביט.
חשבו את העוצמה האינטגרלית של כל נקודה באמצעות תוכנה לעיבוד תמונות מסוג explore המצוידת בכלי רשת אוטומטי. לאחר מכן, ייצאו את נתוני הרשת עבור כל מיקרומערך (microarray) כקובץ טקסט. ייבאו ידנית את קובץ הנתונים לגיליון אלקטרוני ב-Excel לצורך ניתוח.
חשבו את הממוצע של עוצמת הכתם האינטגרלית בין חזרות ההדפסה והדילול כדי לקבל ערך ממוצע של עוצמת הכתם עבור כל דגימה. הציגו את עוצמות הכתם הממוצעות היחסיות בין דגימות שונות כמפת חום (heat map) באמצעות עיצוב מותנה ב-Excel או באמצעות מיפוי חום מקוון. השתמשו בכלים להסרת אות הרקע ותוצאות חיוביות שגויות עבור כל סוג נוגדן, נרמלו את הנתונים ל-100 והטילו ערך סף (cutoff) של 5%.
ניתוח פרופיל פולימרים מקיף באמצעות מערך זעיר (microarray) שימש למדידת השפע היחסי של גליקנים בשישה סוגי רקמות: filaments של האבקנים, אבקה, שחלות, עלי כותרת וstigma של Nicotiana. במקרה של פרחים רבים כאן, המערך נבדק באמצעות הנוגדן המונוקלונלי JIM 5, הספציפי לאפיטופ בפוליסכרידים פקטיים. שימו לב, האפיטופ של JIM 5 מזוהה בתמציות CDTA של כל רקמות הפרח.
עם זאת, הוא נמצא בריכוז הגבוה ביותר באבקה ובריכוז הנמוך ביותר ברקמת הגומח. באופן מעניין, האפיטופ JIM five מזוהה גם בתמציות נתרן הידרוקסיד של אבקה, אך לא ברקמות אחרות. מידע כמותי מתקבל על ידי יצירת עקומות סטנדרט של הפוליסכרידים המטוהרים השונים, אשר שימשו כסטנדרטים פנימיים במערך המיקרו-מערכים (microarray) ברקמת השחלה.
בכל דגימה נכחו כ-157 מיקרוגרם של hoog המכיל את האפיטופ JIM five, המהווה כ-1.5% מכלל שאריות דופן התא, בעוד שברקמת פולן נכחו 625 מיקרוגרם של hoog Ronin המכיל את האפיטופ JIM five, המהווה כ-6.25% מכלל שאריות דופן התא. השפעיות היחסיות של 15 אפיטופי גליקן בכל סוגי הרקמות מסוכמות כמיפוי חום (heat map). עוצמת פסי הצבע פרופורציונלית לעוצמה הממוצעת המותאמת של כל נקודה עבור כל דגימה.
ייצוג גרפי של נתונים אלה מאפשר פרשנות מהירה של הבדלים בשכיחות של අපිטופים של גליקנים בין רקמות הפרחים השונות. תוצאות אלו מעידות כי අපිטופים של גליקנים בודדים מפוזרים באופן ייחודי בין סוגי פרחים רבים. לדוגמה, האפיטופ LM 13 הוא השכיח ביותר ב-anthrop filaments וברקמות SE L בהשוואה לרקמות אחרות.
דפוס זה עומד בניגוד בולט לזה של אפיטופים עם שרשראות קצרות יותר, המזוהים באופן מועדף על ידי MAB LM six. לגליקנים בעלי קישורי צלב (Cross-linking glycans) יש גם דפוסי הופעה מובחנים בסוגים שונים של פרחים. לדוגמה, האפיטופ LM 10 נמצא בשפע ברקמת הע stigma בהשוואה לרקמות אחרות, אך הוא אינו נמצא ברקמת השחלה.
אפיטופים של גליקנים מסוג LM 15 xog נמצאים בריכוז הגבוה ביותר בעליכסול (petal) ובחוט האבקן (anther filament) בהשוואה לרקמות אחרות, בעוד ש-hetero manin נמצאים בריכוז הגבוה ביותר בחוטי אבקנים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן להפיק ולקבוע את השפע היחסי של גליקנים של דופן התא במגוון רחב של צמחים וסוגי רקמות. לאחר שליטת הטכניקה, ניתן להשלים את התהליך באמצעות מערכי מיקרו (microarrays) תוך שלושה ימים.
חשוב לזכור להתייחס לדגימות ולחזרות באופן עקבי בכל שלב בעקביות להליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות חומצה ניטרית-אצטית, כדי לבחון שאלות נוספות. לדוגמה, מהו תכולת התאית המוחלטית שנותרה לאחר מיצוי רצופי של פקטינים וגליקנים קונגיוגטיים באמצעות CDTA ונתרן הידרוקסיד?
לטכניקה זו ישנה ישימות רחבה בתחום הביולוגיה של תאי צמחים לצורך השוואה מהירה של השכיחות של גליקנים בצמחי מודל כגון Arabidopsis ו-Fisca, Nutella, וכן בצמחים אחרים כגון כותנה, חיטה, אקליפטוס וטבק.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה הנקראת Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) לאפיון גליקנים של דפנות תאי צמחים. השיטה משלבת נוגדי מונוקלונליים המכוונים לאפיטופים ספציפיים של גליקנים עם פלטפורמת מיקרו-מערך (microarray) כדי לסרוק את נוכחות הגליקנים בהקשרים ביולוגיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של צמחים
- הרכב דופן התא
- אנליזה של גליקנים
רקע
- הבנת מבנה דופן התא של הצמח היא קריטית למגוון מחקרים ביולוגיים.
- גליקנים ממלאים תפקיד משמעותי בפיזיולוגיה ובפיתוח של צמחים.
- טכנולוגיית מיקרו-מערכים (Microarray) מאפשרת ניתוח של גליקנים בתסריף גבוה.
- נוגדנים מונוקלונליים מספקים ספציפיות בזיהוי אפיתופים של גליקנים.
מטרת המחקר
- להשוואת הרכב הפולימרים של דופן התא בין מיני צמחים וסוגי רקמות שונים.
- לפיתוח שיטה מהימנה לאפיון גליקנים.
- להעמקת ההבנה של הדינמיקה של דופן התא בצמחים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר רקמות צמחים רלוונטיות.
- הומוגניזציה של רקמות להכנת שאריות שאינן מסיסות באלכוהול.
- מיצוי רצופי של גליקנים מדופן התא באמצעות CDTA ונתרן הידרוקסיד.
- הדפסת תמציות גליקנים על מערכי מיקרו-מערכים (microarrays) ובדיקה באמצעות נוגדנים מונוקלונליים.
תוצאות עיקריות
- אפיון מוצלח של גליקנים בדופן התא במגוון דגימות.
- כימות נוכחות הגליקנים באמצעות אותות ממערך זעיר (microarray).
- הוכחת יעילותו של CoMPP בהקשרים ביולוגיים מגוונים.
- אספקת תובנות לגבי השונות בהרכב הגליקנים בצמחים.
מסקנות
- CoMPP הוא כלי בעל ערך לחקר גליקנים של דפני תאי צמחים.
- השיטה יכולה לסייע למחקר בביולוגיה של צמחים ובתחומים קשורים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקה זו כדי לבחון תפקודי גליקנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרופיל פולימרים מקיף באמצעות מערך זעיר (CoMPP) מאפשר אפיון גליקנים מהיר וחצי-כמותי ברחבי רקמות צמחים מגוונות, ובכך תומך בגילוי בסביבה של תפוקה גבוהה במסלולי פיתוח של ביו-מוצרים מבוססי צמחים. פלטפורמה זו נותנת מענה לאתגר של אפיון מבני גליקנים מורכבים, ומקלה על גנומיקה פונקציונלית וניתוחים השוואתיים הקריטיים להנדסה ביוטכנולוגית ולאופטימיזציה של חומרי גלם. יכולת ההרחבה והריבוי (multiplexing) שלה ממצבות אותה כנכס אסטרטגי לשלבי גילוי מוקדמים ומחקר תרגומי בביוטכנולוגיה של צמחים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה שיטתית של מסלולי הביוסינתזה של גליקנים במודלים של צמחים.
- תומך בגנומיקה תפקודית באמצעות מיפוי של התפלגות අපිטופים של גליקנים ברקמות מוטנטיות וברקמות מסוג בר.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי חשיפת מודיפיקציות גליקניות מפצות או עודפות.
- מספק ביטחון חיזוי לבחירת מטרות בהנדסת דפנות תאי צמחים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקות מבוססות מערך זעיר (microarray) מתוקשפות וניתנות לשחזור לזיהוי אפיטופים של גליקנים.
- מאפשר סריקה רב-ערוצית (multiplexed) בתפוקה גבוהה של מאות דגימות במקביל.
- מייצר קריאות כמותיות וחצי-כמותיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מסטנדרט את זרימות העבודה לשם שחזור בין מעבדות ובתוך פרויקטים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תוצרי אפיון הגליקנים לגילוי ביומרקרים תרגומיים במערכות צמחים.
- תומכת ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של תכונות מהונדסות.
- מאפשרת קידום מותאם סיכונים של קווי צמחים בעלי תכונות דופן תא רצויות.
- מספקת הפחתת סיכונים מנגנונית עבור פיתוח מוצרי ביו-טכנולוגיה במורד התהליך.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
CoMPP משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות למיפוי גליקנים מונחה-השערה, סטנדרטיזציה של בדיקות ואנליזה כמותית למחקר של דפנות תאי צמחים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים בביוסינתזה ובשינוי של גליקנים.
- סריקה: מספקת מוכנות של הבדיקה ויכולת שחזור עבור מחקרים השוואתיים בקנה מידה גדול.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של עוצמת הנקודות וויזואליזציות של מפות חום לצורך פרשנות נתונים חסונה.
- מחקר תרגומי: מקלה על התאמת סממנים ביולוגיים ותיקוף פרה-קליני של תכונות צמחים מהונדסים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר וניתנת להרחבה עבור פרופילינג של גליקנים באופן שוטף לאורך פרויקטים ומינים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר גליקנים בצמחים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והתפוקה בזרימות עבודה של ניתוח גליקנים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון בקווי פיתוח של ביוטכנולוגיה של צמחים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום של קווי צמחים עם תכונות דופן תא מותאמות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של דופן התא הצמחי ובזיהוי המבוסס על נוגדנים מונוקלונליים.
- דורש גישה למדפסות מיקרו-מערכים (microarray) אוטומטיות, לסורקים ברזולוציה גבוהה ולתוכנה לניתוח תמונות.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרוטוקולי הכנת דגימות וניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה למגוון רחב של מיני צמחים וסוגי רקמות באמצעות פאנלים מתאימים של נוגדנים.
- תלוי בזמינות ובספציפיות של נוגדנים מונוקלונליים לאפיטופים של גליקנים המהווים את המטרה.
