שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

מטרת ההליך הבא היא להדגים כיצד לקיים את הליזוזומים של שני סוגים של דגימות, עוברי עכברים ותאי גזע ממוינים עם צבע מעקב ליו כדי לזהות דפוסים של מוות תאי. כדי להכין דגימות עוברים, העוברים מבודדים תחילה בניתוח ומכניסים אותם לכלי להכנת תאים מובחנים. תאי גזע עובריים משמשים ליצירת גופי עובר.

גופי עוברים אלה מתורבתים בתרחיף ולאחר מכן גדלים כשכבה אחת על מגלשת תא. ניתן לדגור את העוברים כולם חד-שכבתיים באדום גשש ולאחר מכן לשטוף אותם ולאחר מכן ניתן לצלם דגימות קבועות כדי לבחון ולכמת את תוצאות הצביעה המתקבלות המראות את Liso Tracker. צביעה היא הליך פשוט שניתן להשתמש בו כדי לבחון מוות תאי בעוברים ובתאים מתורבתים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ניתוח מנהרות הוא שמכיוון שצבע מעקב OT הוא מולקולה קטנה, ניתן לבחון רקמה עבה במהירות ובקלות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי דפוסים של מוות תאי מתוכנת בעוברי עכברים ותרביות מובחנות, ניתן ליישם אותה גם על סוגי רקמות אחרים כגון עוברי תרנגולות ותאי גזע בוגרים מתמיינים . התאימו עכברים נקבות צעירות עם זכר חתיך ובבקרים שלמחרת, בדקו אם יש פקק בנרתיק, המעיד על כך שההזדווגות התרחשה.

הצהריים ביום בו מופיע הפקק בנרתיק הוא למעשה 0.5 ימים. לאחר קוטוס ביום העוברי, המתת חסד של הנקבה על פי פרוטוקולים מאושרים והוצאת הרחם לצלחת פטרי של 10 סנטימטר עם ה-BSS של האנק ושטוף כל דם. הפרד את העוברים והסר אותם מהרחם.

הסר את הממברנות העובריות הנוספות ובצע לפחות שטיפה אחת עם ה-BSS של האנק כדי להסיר רקמות זרות ודם. שמור את העוברים המנותחים על קרח בזמן הניקוי. האחרים.

הכן חמישה מיליליטר של תמיסת צביעת עובר גשש ליסו. זהו נפח מספיק לאוסף עוברים אחד או שניים. מערבבים בעדינות את התמיסה לפיזור הצבע, באופן שווה ואז מעבירים את העוברים לתמיסה ודוגרים אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.

לאחר הדגירה, שטפו בעדינות את העוברים ב-BSS של האנק ארבע פעמים במשך חמש דקות כל שטיפה. חשוב לבצע את השטיפות בעדינות כדי לא לפגוע ברקמה. הסירו את הנוזל, שימו לב לאט למקום בו נמצאים העוברים העדינים, והשאירו תמיד חלק מהנוזל מאחור לכסות אותם.

לאחר מכן תקן את העוברים ב-4%para פורמלדהיד למשך הלילה למחרת. שטפו את העוברים פעם אחת ב-BSS של האנק למשך 10 דקות כדי להסיר את הקיבוע. כעת ייבשו את הרקמות באמצעות סדרת מתנול כדי למנוע כתמי רקע.

שלב זה משפר את יחס האות לרעש במהלך ההדמיה לפני האחסון. במידת הצורך, אסוף דגימת רקמה מכל עובר לניתוח גנטי. מאוחר יותר, החזר את דגימת הרקמה לפני הגנוטיפ.

הפרד את העוברים לצינורות בודדים עם תוויות התואמות את דגימת הרקמה. כעת ניתן לאחסן את העוברים המבודדים ללא הגבלת זמן במתנול של מינוס 20 מעלות צלזיוס. מוגן מפני אור.

התחל בהכנת גופי עוברים בשיטת הטיפה התלויה. עם צפיפות התחלתית של 500 תאים לכל טיפה של 20 מיקרוליטר לאחר שלושה ימים, העבירו את גופי העובר לתרביות תרחיף על צלחות פטרי לא דביקות של 10 סנטימטרים. תרבו אותם במשך חמישה ימים, והחליפו את המדיה כל יומיים לאחר חמישה ימים.

העבירו את גופי העוברים לשקופיות ג'לטיניות של שמונה חדרים, והניחו גוף עובר אחד או שניים בכל חדר. תרבית את גופי העובר למשך 10 ימים נוספים. החלפת המדיה כל יומיים לאחר 10 ימים, שאפו בעדינות את המדיה הקיימת והוסיפו 300 מיקרוליטר של תמיסת צביעת תאי גשש Lyo לכל תא.

הקפד להוציא ידנית את המדיה ולהניח את קצה הפיפטה בפינת החדר. בדרך זו, לא תסיר בטעות את כל הגופים ממשטח הזכוכית. בעת הוספת מדיה חוזרת, הנח את קצה הפיפטה בפינת החדר והוסף את המדיה בחזרה לאט מאוד.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן שטפו אותם פעמיים עם DPBS למשך חמש דקות בכל שטיפה. כעת תקן את התאים ב -4% פרלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הסר את הקיבוע עם DPBS בשתי שטיפות של חמש דקות. כדי להרכיב את העוברים, הנח אותם במגלשת זכוכית שקע עמוק או במגן זיהום קטן של צלחת פטרי. הכן את דגימות התאים למיקרוסקופיה על ידי שאיבת ה-DPBS.

הסר את החדר מהמגלשה והניח לו להתייבש באוויר כחמש דקות. מכסים בנייר כסף כדי להגן על הפלור. לאחר מכן הוסף אמצעי הרכבה מימי כגון מגן וקטור עם דאפי והניח מעליה החלקת כיסוי.

כעת השקופית הותקנה ומוכנה להדמיה. דמיין את הדגימות עם מיקרוסקופ מנתח או מורכב המצויד במוט, דומין או מסנן אדום טקסס. הצביעה בדרך כלל בהירה למדי, כך שבדרך כלל אין צורך בחשיפות ארוכות במצב ידני.

צלם תמונות דיגיטליות של כל הדגימות באותם תנאי חשיפה. כדי לכמת את התמונות, פתחו אותן ב-Adobe Photoshop או בתוכנת הדמיה דומה. כדי לקבוע את מידת הצביעה של Lyo Tracker, בחר בערוץ האדום.

שימו לב לספירת הפיקסלים של התמונה כולה, כפי שהיא מתגלה בפונקציית ההיסטוגרמה. הסף הבא, התמונה כך שהכתמים האדומים מיוצגים כעת על ידי פיקסלים לבנים. פעולה זו ממירה את התמונה לשחור-לבן.

בחר רמת סף והשתמש ברמה זו לכל התמונות בסדרה. בחרו בפיקסלים הלבנים בעזרת הכלי טווח צבעים והשתמשו בפונקציית ההיסטוגרמה לקבלת ספירת הפיקסלים הלבנים הכוללת. השתמש בערוץ הכחול כדי לספור את מספר הגרעינים בשדה.

זה יכול להיות שימושי לשמור תיעוד של הספירה על ידי הערת התמונה, לרשום את הערכים ולהשתמש בהם כדי לחשב את רמת הצביעה הממוצעת לתא. חזור על ניתוח זה עם אותה הגדרת סף עבור כל התמונות הנותרות. כדי לדגום את הגשש שימש להכתמת עוברים מוטנטיים של קיפוד קולי.

מכיוון ש-ly O tracker הוא אזור מולקולה קטן ומפוזר מאוד עמוק בתוך המין של עובר שלם כפי שנצבע ב-10.5 ימים לאחר מוות תאי מתוכנת של cotus או PCG גדל מאוד בעוברים מוטנטיים אפסיים של קיפוד קולי, במיוחד בגפיים וכך גם באזורים עשויים. ניצני הגפיים צולמו בתושבות חורים בהגדלה גבוהה יותר כדי להעריך את הדפוס הכללי. חלקים שנותחו נחתכו גם הם במיקרוטון רוטט.

ראש החץ מצביע על צביעה מוגברת בקצה הדיסטלי האפס של הקיפוד הקולי בקטעים שהתקבלו עם צביעת מנהרת קריוסטט שימשה בשילוב עם OT Tracker בפרוסות אלה, למרות שאין מתאם קפדני אחד לאחד בין גשש ליו לצביעה במנהרה, האזורים הכלליים של PCD חופפים במידה ניכרת בהגדלה גבוהה יותר. אפשר לראות נקב שהוכתם חיובי עם בדיקת המנהרה, אך לא את ניקוב ה-otra Die שמכתים רק עם תבנית הליירה ונקב שיש להם כתמים חופפים. לאחר 10 ימים של תרבית גוף עוברית, תאי גוף התמיינו למגוון סוגי תאים, כולל נוירונים, תאי שריר וקרדיומיוציטים.

בתרבית הרגילה של תאי ES מובחנים, ישנם כמה תאים שעברו PCD כפי שזוהה במבחני מעקב ומנהרה. לאחר מכן, התאים טופלו במי חמצן כדי לגרום למוות של תאי עקה חמצונית. מינון נמוך של מי חמצן הגדיל הן את עוקב הליו והן את צביעת המנהרה בהשוואה לאי-טיפול.

בדומה לתוצאות בעובר, שני הכתמים סימנו תאים משותפים וייחודיים. מינון גבוה של מי חמצן הביא להתכווצות תאים ולמעקב OT נרחב יותר וחיובי מנהרה. לשם השוואה, הרעבה בסרום שימשה כדי לגרום לאוטופגיה לאחר שעה אחת של רעב בסרום.

צביעת גשש OT גדלה. עם זאת, החיוביות במנהרות נותרה ברמות נורמליות. לפיכך, בעוד ש-reer קל ושימושי, חשוב לעקוב אחר בדיקות נוספות כדי לקבוע אם הצביעה מייצגת אפופטוזיס או אוטופגיה לאחר כימות הדגימות.

באמצעות שיטת הפוטושופ הפשוטה שהודגמה קודם לכן, התוצאות אישרו כי הגדלת הריכוזים של מי חמצן הביאה לרמה גבוהה יותר של צביעת עוקב lys לאחר שליטה, ניתן לבצע הליך צביעה זה תוך פחות משעתיים אם הוא מבוצע כראוי בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו NX בחמש או שלוש צביעה חיסונית על מנת לאשר את סוג המוות התאי. אל תשכח שכרגע ירוק טרקר עובד רק על תאים חיים, כך שאדום Reca הוא האפשרות הטובה ביותר שלך לדגימות הדורשות קיבוע.