Name: שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: למד לזהות מות תאים מתוכנים בעוברי עכברים ובתרביות תאי גזע עובריים באמצעות צביעת LysoTracker. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברורה של דפוסי מוות תאי בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מריאני המעבדה לעזרת עריכת הפרוטוקול. עבודה זו מומנה על ידי מענק הדרכה CIRM דוקטורים (JLF), התמחות גשרי CIRM (TZTT), רוברט ומאי ר רייט קרן (FVM), ובאוניברסיטת הדרום קליפורניה (FVM).

<ol><li>Baehrecke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+death+shapes+life+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">How death shapes life during development.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).</li>
<li>Meier, P., Finch, A., Evan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in development.</a> Nature. 407, 796-801 (2000).</li>
<li>Ikonomidou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+apoptotic+neurodegeneration+and+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome.</a> Science. 287, 1056-1060 (2000).</li>
<li>Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+embryonic+cell+populations+to+ethanol-induced+apoptosis%3A+implications+for+alcohol-related+birth+defects+and+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).</li>
<li>Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+of+5-FU-treated+fetal+rat+limbs+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+Lysotracker%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker.</a> Cytometry A. 53, 9-21 (2003).</li>
<li>Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in animal development.</a> Cell. 88, 347-354 (1997).</li>
<li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147, 742-758 (2011).</li>
<li>Qu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+gene-dependent+clearance+of+apoptotic+cells+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development.</a> Cell. 128, 931-946 (2007).</li>
<li>Grimsley, C., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cues+for+apoptotic+cell+engulfment%3A+eat-me%2C+don%27t+eat-me+and+come-get-me+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals.</a> Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells%3A+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li>
<li>Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+of+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Cytometry. 33, 348-354 (1998).</li>
<li>Zucker, R. M., Hunter, E. S. 3rd, Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+morphology+in+mouse+embryos+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy.</a> Methods. 18, 473-480 (1999).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).</li>
<li>Chiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manifestation+of+the+limb+prepattern%3A+limb+development+in+the+absence+of+sonic+hedgehog+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function.</a> Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).</li>
<li>Ishibashi, M., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sonic+hedgehog-dependent+signaling+relay+regulates+growth+of+diencephalic+and+mesencephalic+primordia+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo.</a> Development. 129, 4807-4819 (2002).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain Res. 913, 201-205 (2001).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Dumont, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+is+CD95-independent%2C+requires+the+release+of+mitochondria-derived+reactive+oxygen+species+and+the+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB.</a> Oncogene. 18, 747-757 (1999).</li>
<li>Hampton, M. B., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+caspase+activity+by+hydrogen+peroxide%3A+implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis.</a> FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).</li>
<li>Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+engulf+and+clear+apoptotic+footplate+cells+in+macrophageless+PU.1+null+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos.</a> Development. 127, 5245-5252 (2000).</li>
<li>Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+autophagy+by+Atg1+inhibits+cell+growth+and+induces+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death.</a> Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracker+dyes+to+probe+mitochondrial+autophagy+%28mitophagy%29+in+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes.</a> Autophagy. 2, 39-46 (2006).</li>
<li>Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+autophagy+visualized+in+live+cells%3A+from+autophagosome+formation+to+fusion+with+endo%2Flysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes.</a> Autophagy. 1, 23-36 (2005).</li>
<li>Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+autophagy+is+related+to+programmed+cell+death+during+the+development+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).</li>
<li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).</li>
<li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes.</a> Autophagy. 4, 151-175 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

סימני היכר חשובים של אפופטוזיס כוללים זיהוי של ניזק לדנ&quot;א עם assay Tunel, יחד עם זיהוי של פעילות caspase (מזוהה עם בז או מולקולה מחייבת כגון ZVAD-fmk), תצפית של שינויים תאיים, ומצגת של phosphatidylserine (PS ) על פני הקרום (זוהה על ידי Annexin V מחייב). יש כמה חסרונות בכל אחד מהמבחנים האלה. לדוגמה, בשימוש במסוף transferase assay Tunel לא לחדור מעבר לכמה שכבות תאים. גם Annexin V יכול לסמן תאים שאינם עוברים אפופטוזיס כמו אלה שיש להם ניזק קרום (Annexin V מקבל בתוך התא ומסמן נ.ב....

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td></td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> LysoTracker האדום DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> הנקס BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> וקטור </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות </td><td> Cellgro </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> Cellgro </td><td> 25-000-CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> עט דלקת </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> ב-Mercaptoethanol, 50 מ&quot;מ </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות LabTek-II הקאמריים (8-גם) </td><td> Nalge Nunc הבינלאומי </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> 0.1% ג&#39;לטין </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> PBS של Dulbecco (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מתכוני פתרונות 4% Paraformaldehyde עבור 100 מ&quot;ל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבי 4 paraformaldehyde גרם, 90 המ&quot;ל H 2 O, וNaOH (ירידה של 2N NaOH). Paraformaldehyde לא ייכנס לפתרון עד שהוספת כמה NaOH כדי להגדיל את רמת החומציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים וחום ב 60 ° C עד שכל האבקה היא בפתרון (~ 10-20 דקות). לא לחמם יותר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ~ 10 המ&quot;ל PBS 10x להשיג נפח סופי של 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -20 ° C בנוח (~ 10 מ&quot;ל או ~ 40 מ&quot;ל) aliquots. </li></ol> אזהרה: Paraformaldehyde בצורה &quot;ציצית&quot; (דחוס כדורים קטנים) היא פחות האבקה ולכן ניתן למדוד מחוץ למכסת מנוע. עם זאת אתה עדיין צריך ללבוש מסיכת אבק מגן (N95לפחות) במהלך טיפול. EB תרבות מדיה עבור 500 מ&quot;ל EB מדיה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> DMEM: </td><td> 404.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> FBS: </td><td> 75.0 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> L-גלוטמין: </td><td> 5.0 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין: </td><td> 5.0 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות: </td><td> 5.0 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פירובט נתרן: </td><td> 5.0 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol: </td><td> 500μl </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

שימוש בlysotracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

מות תאים מתוכן (PCD) מתרחש אצל מבוגרים כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמה נורמלית ובמהלך ההתפתחות עוברית לעצב רקמות ואיברים 1,2,6,7. במהלך פיתוח, כימיקלים רעילים או שינויים גנטיים יכולים לגרום לעלייה בPCD או לשנות דפוסי PCD כתוצאה מפרעות התפתחותיות ומומים מולדים 3-5. כדי להבין את האטיולוגיה של ליקויים אלה, המחקר של עוברים ניתן כהשלמה עם במבחני חוץ גופייה המשתמשים במיון תאי גזע עובריים (ES). אפופטוזיס הוא צורה נחקרה היטב של PCD שכרוך הוא פנימי וחיצוני כדי להפעיל איתות מפל האנזים caspase. שינויים בתא אופייני כוללים blebbing קרום, התכווצות גרעינית, ופיצול ה-DNA. צורות אחרות של PCD אינן כרוכות בהפעלת caspase ועלולה להיות סוף התוצאה של autophagy הממושך. ללא קשר למסלול PCD, תאים מתים שיהיה צורך להסירו. אצל מבוגרים, התאים החיסוניים ביצועיםORM פונקציה זו, ואילו בעוברים, שבו המערכת החיסונית אינה מפותחת עדיין, ההסרה מתרחשת על ידי מנגנון חלופי. מנגנון זה כרוך תאים שכנים (נקרא &quot;phagocytes לא מקצועי&quot;) לוקחים על phagocytic תפקידים שהם מכירים &quot;לאכול אותי&quot; אות על פני השטח של התא ולבלוע אותו 8-10 הגוססים. לאחר בליעה, הפסולת מובאת לlysosome לשפלה. לכן, ללא קשר למנגנון PCD, גידול בפעילות lysosomal יכול להיות מתואם עם מות תא מוגבר. ללמוד PCD, assay פשוט לדמיין lysosomes ברקמות עבות ותרבויות מבדילות multilayer יכול להיות שימושי. צבע LysoTracker הוא מולקולה קטנה מסיסה מאוד שנשמרה בתאי subcellular חומציים כגון 11-13 lysosome. הצבע הוא נלקח על ידי דיפוזיה ודרך מחזור הדם. מאז חדירה היא לא מכשול, ויזואליזציה של ללמוד במכללת פרינסטון ברקמות עבות ותרבויות רבות שכבתיות הוא אפשרי 12,13 </sup&gt;. לעומת זאת, ניתוח 14 Tunel (תיוג סוף transferase dUTP כינוי המסוף deoxynucleotidyl), מוגבל לדגימות קטנות, חתכים ההיסטולוגיים ותרבויות monolayer כי ההליך דורש כניסה / החדירות של מסוף transferase. בניגוד לאנילין כחול, שמפזר ונמס בממסים, LysoTracker האדום DND-99 ניתן לתקן, בהיר ויציב. כתמים יכולים להיות דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal הסטנדרטי בכל הר-או סעיף באמצעות תקשורת מימית או ממס המבוסס על הרכבת 12,13. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות צבע זה להסתכל על ללמוד במכללת פרינסטון בעוברי עכברי null קיפוד קולי הרגיל ו. בנוסף, אנו מדגימים ניתוח של PCD במבדל תרבויות תאי גזע עוברי, ולהציג שיטת כימות פשוט. לסיכום, כתמי LysoTracker יכולים להיות רב כדי להשלים שיטות אחרות לאיתור PCD.

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לדמיין אזורים של מות תאים מתוכן (PCD) בעוברי עכברים ומבדילים (ES) תרבויות תאי גזע עובריות באמצעות צבע מסיס מאוד בשם LysoTracker.

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

מוות תאי מתוכנן (PCD) מתרחש במבוגרים כדי לשמר הומיאוסטזיס תקין של רקמות ובמהלך ההתפתחות העוברית כדי לעצב רקמות ו...

מטרתו של ההליך הבא היא להדגים כיצד לסמן את הליזוזומים של שני סוגי דגימות, עוברים של עכברים ותאי גזע מובחנים, באמצעות צבע lyo tracker כדי לזהות תבניות של מוות תאי. להכנת דגימות עוברים, העוברים מבודלים תחילה בניתוח ומונחים בצלחת כדי להכין תאים מובחנים. תאי גזע עובריים משמשים ליצירת גופי עובר.גופי עוברים אלו גודלים בתרבית סספנסיות ולאחר מכן גודלים כשכבה אחת (monolayer) על גבי למסלית תא (chamber slide). את העוברים בשכבה אחת ניתן לדגור עם LysoTracker Red, ולאחר מכן לשטוף ולקבע; ניתן לצלם את הדגימות כדי לבחון ולכמת את תוצאות הצביעה המראות את ה-LysoTracker. הצביעה היא הליך פשוט שניתן להשתמש בו כדי לבחון מוות תאי תכנוני (programmed cell death) בעוברים ובתאי תרבית.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון tunnel analysis, הוא שבעקבות היותו של צבע ה-OT tracker מולקולה קטנה, ניתן לבצע בדיקה של רקמה עבה במהירות ובקלות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי דפוסי מוות תאי מתוכנן בעוברי עכבר ובתרביות מובחנות, ניתן להחיל אותה גם על סוגי רקמות אחרים, כגון עוברי תרנגולת ותאי גזע בוגרים בתהליך בידול. הצמידו נקבות עכבר צעירות לזכר פריון, ובבקרים העוקבים בדקו אם קיים פקק נבכי, המעיד על כך שהזיווג התרחש.שעת צהריים ביום שבו מופיע הפקק הנרתיקי נחשבת למעשה ל-0.5 ימים. לאחר הזיווג, ביום העוברי הרלוונטי, יש להקריב את הנקבה בהתאם לפרוטוקולים המאושרים ולהעביר את הרחם לצלוחית פטרי של 10 סנטימטרים המכילה Hank's BSS, ולשטוף שאריות דם. הפרד את העוברים והוצא אותם מהרחם.הסיר את קרומי העובריים העודפים ובצע שטיפה אחת לפחות עם Hank's BSS כדי להסיר רקמות זרות ודם. שמור את העובריים המנותחים על קרח בזמן הניקוי. את השאר.הכינו חמישה מיליליטר של תמיסת צביעה לעוברי Liso tracker. נפח זה מספיק לאיסוף של עובריים אחד או שניים. ערבבו בעדינות את התמיסה כדי לפזר את הצבע באופן אחיד, לאחר מכן העבירו את העוברים לתמיסה והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות.לאחר הדגירה, שטפו בעדינות את העוברים ב-Hank's BSS ארבע פעמים, למשך חמש דקות בכל שטיפה. חשוב לבצע את השטיפות בעדינות כדי לא לפגוע ברקמה. הסירו את הנוזל באיטיות, תוך תשומת לב רבה למיקומם של העוברים העדינים, והקפידו תמיד להשאיר חלק מהנוזל המכסה אותם.לאחר מכן, קבעו את העוברים ב-4%para formaldehyde למשך לילה שלם ביום למחרת. שטפו את העוברים פעם אחת ב-Hank's BSS למשך 10 דקות כדי להסיר את חומר הקיבוע. כעת, בצעו דהידרטציה לרקמות באמצעות סדרת מנתנול כדי למנוע צביעת רקע.שלב זה משפר את יחס האות לרעש במהלך הדמיה לפני האחסון. במידת הצורך, אסוף דגימת רקמה מכל עובר לצורך אנליזה גנטית. מאוחר יותר, בצע רהידרציה לדגימת הרקמה לפני הטיפוס הגנטי (genotyping).הפרידו את העוברים למבחנות בודדות עם תוויות התואמות לדגימת הרקמה. כעת ניתן לאחסן את העוברים המבודדים ללא הגבלה במתנול בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. הגנו מאור.התחילו בהכנת גופי עוברים בשיטת טיפה תלויה. בצפיפות התחלתית של 500 תאים לטיפה של 20 microliter לאחר שלושה ימים, העבירו את גופי העוברים לתרביות השעיה בצלחות פטרי לא-דבקות של 10 centimeter. תרבתו אותם למשך חמישה ימים, והחליפו את המצע כל יומיים לאחר חמישה ימים.העבירו את גופי העוברים למטריצות של שמונה תאים שעברו ג'לטיניזציה, והניחו גוף של עובר אחד או שניים בכל תא. תרבתו את גופי העוברים למשך 10 ימים נוספים. לאחר 10 ימים, החליפו את המצע מדי יומיים על ידי שאיבה עדינה של המצע הקיים והוספה של 300 microliters של תמיסת צביעת תאים Lyo tracker לכל תא.הקפידו לשאוב את המצע באופן ידני על ידי הנחת קצה הפפטה בפינת התא. בדרך זו, לא תסירו בטעות את גופי ה-C. elegans שעדיין נצמדים למשטח הזכוכית. בעת הוספת המצע מחדש, הנח את קצה הפפטה בפינת התא והוסיפו את המצע באיטיות רבה.דגרו את התאים בתאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו אותם פעמיים עם DPBS למשך חמש דקות לכל שטיפה. כעת, קבעו את התאים ב-4% paraldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הסר את מקבע הרקמות באמצעות DPBS בשתי שטיפות של חמש דקות כל אחת. כדי להכין את העוברים להרכבה (mounting), הנח אותם על זכוכית עם שקע עמוק או בתוך מגן של פטריה קטנה. הכן את דגימות התאים למיקרוסקופיה על ידי שאיבת ה-DPBS.הסר את התא מהזכוכית והנח לו להתייבש באוויר במשך כחמש דקות. כסה בנייר אלומיניום כדי להגן על הפלואורסצנציה. לאחר מכן, הוסף מדיום הרכבה מימי כגון vector shield עם dappy והנח זכוכית כיסוי מעל.כעת הזריקה הוכנה והיא מוכנה לדימות. הדמיאו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי או מיקרוסקופ אור פשוט המצויד במסנן Rod, Domine או Texas red. הצביעה היא בדרך כלל בהירה מאוד, ולכן חשיפות ארוכות אינן נדרשות בדרך כלל במצב ידני.צלמו תמונות דיגיטליות של כל הדגימות תחת אותם תנאי חשיפה. כדי לכמת את התמונות, פתחו אותן בתוכנת Adobe Photoshop או בתוכנה דומה לעיבוד תמונות. כדי לקבוע את כמות הצביעה של lyo tracker, בחרו בערוץ האדום.שימו לב למספר הפיקסלים של התמונה כולה כפי שמוצג על ידי פונקציית ההיסטוגרמה. לאחר מכן, בצעו סף (threshold) לתמונה כך שהצביעה האדומה תיוצג כעת על ידי פיקסלים לבנים. פעולה זו ממירה את התמונה לשחור ולבן.בחרו רמת סף והשתמשו ברמה זו עבור כל התמונות בסט. בחרו את הפיקסלים הלבנים באמצעות כלי טווח הצבעים (color range) והשתמשו בפונקציית ההיסטוגרמה כדי לקבל את סך מספר הפיקסלים הלבנים. השתמשו בערוץ הכחול כדי לספור את מספר הגרעינים בשדה.ייתכן שיהיה שימושי לשמור תיעוד של הספירה על ידי הוספת הערות לתמונה, רישום הערכים ושימוש בהם לחישוב רמת הצביעה הממוצעת לתא. חזור על ניתוח זה עם אותה הגדרת סף עבור כל שאר התמונות. לצורך דגימה, נעשה שימוש ב-LysoTracker כדי לצבוע עוברים עם מוטציה ב-sonic hedgehog.מכיוון ש-ly O tracker הוא מולקולה קטנה בעלת יכולת דיפוזיה גבוהה, אזורים עמוקים בתוך העובריים של עובר שלם שנצבעו ביום ה-10.5 לאחר ההפריה, הראו עלייה משמעותית במוות תאי מתוכנן (PCD) בעוברים עם מוטציה של מחסור ב-sonic hedgehog, במיוחד באזורי הגפיים והסומייטים. ניצני גפיים צולמו כדגימות שלמות בהגדלה גבוהה יותר כדי להעריך את התבנית הכללית. חלקים שבוצעה להם דיסקציה נחתכו גם באמצעות מיקרוטום רוטט.ראש החץ מצביע על עלייה בצביעה ב-TUNEL בקצה הדיסטלי של עוברים חסרי sonic hedgehog בחתכים שהתקבלו באמצעות קריוסטט. צביעת TUNEL בוצעה בשילוב עם OT Tracker בחתכים אלו; אף שאין מתאם חד-ערכי קשיח בין צביעת lyo tracker לצביעת TUNEL, האזורים הכלליים של PCD חופפים במידה ניכרת תחת הגדלה גבוהה יותר. ניתן לראות תאים שנצבעו חיובית בבדיקת TUNEL אך לא ב-otra die, תאים שנצבעו רק ב-lyra die, ותאים שבהם הצביעות חופפות. לאחר 10 ימים של תרבית גוף עוברית, התבדילו התאים למגוון סוגי תאים, כולל נוירונים, תאי שריר וקרדיומיוציטים.בתרבית רגילה של תאי ES מובחנים, קיימים מספר תאים שעברו PCD, כפי שזוהו באמצעות בדיקות lyo tracker ו-tunnel. לאחר מכן, התאים טופלו במימן פראוקסיד כדי להשרות מוות תאי כתוצאה מעקה חמצוני. מינון נמוך של מימן פראוקסיד הגביר הן את צביעת ה-lyo tracker והן את צביעת ה-tunnel בהשוואה לקבוצה שלא טופלה.בדומה לתוצאות בעובר, שני הצביעות סימנו תאים משותפים ותאים ייחודיים. מינון גבוה של מימן פחמונית (hydrogen peroxide) הוביל להתכווצות תאים ולשכיחות רחבה יותר של חיוביות ל-OT tracker ו-tunnel. לצורך השוואה, נעשה שימוש בהרעבת סרום כדי להשרות אוטופגיה לאחר שעה אחת של הרעבת סרום.צביעת ה-OT tracker עלתה. עם זאת, החיוביות בבדיקת tunnel נותרה ברמות נורמליות. לכן, בעוד ש-reer היא פשוטה ומועילה, חשוב לבצע מעקב באמצעות בדיקות נוספות כדי לקבוע אם הצביעה מייצגת אפופטוזיס או אוטופגיה לאחר כימות הדגימות.באמצעות שיטת הפוטושופ הפשוטה שהודגמה קודם לכן, התוצאות אישרו כי ריכוזים עולים של מימן פוקסיד הובילו לרמה גבוהה יותר של צביעת lys tracker. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך צביעה זה בפחות משעתיים אם הוא מבוצע כראוי בהתאם לפרוטוקול זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון צביעה אימונוהיסטוכימית של NX-5 או LC3, כדי לאשר את סוג מוות התא. זכרו כי נכון לעכשיו Trecker green פועל רק על תאים חיים, ולכן Reca red היא האפשרות הטובה ביותר עבור דגימות הדורשות קיבוע.

use-lysotracker-to-detect-programmed-cell-death-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מציג טכניקות תיוג של אדם בתאי גזע עובריים ותאי גזע mesenchymal עם צבעי ניאון. טכניקה זו יכולה לשמש in vivo מעקב בתאי גזע המושתלים עם הדמיה אופטית עבור מתאמים histopathological עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

עם העניין הגובר טיפולים בתאי גזע, טכניקות הדמיה מולקולרית הם אידיאליים עבור התנהגות בתאי גזע ניטור לאחר ההשתלה. הגנים כתב בלוציפראז אפשרו פולשני, הערכה חוזרת של הישרדות התא, מיקום התפשטות in vivo. וידאו זה יהיה להדגים כיצד לעקוב אחר התפשטות hESC בעכבר חי.

במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג&#39;ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

כאן אנו מתארים אפיון פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסות של שושלות תאים עם גורלות רקמות ידועים בעובר בעל חוליות Xenopus laevis .

ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

מערכות התמיינות תאים פלוריפוטנטיות זמינות (PSC) לתפקוד מעוכבות כיום על ידי בעיות של שונות חמורה מקו לקו ואצווה לאצווה. כאן, תוך שימוש בהתמיינות לבבית כדוגמה העיקרית, אנו מציגים פרוטוקול לניטור חכם ומווסת את תהליך התמיינות PSC המבוסס על למידת מכונה מבוססת תמונה.

אסטרטגיית למידת מכונה מבוססת תמונה של תאים חיים לניטור התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה של תאים חיים לניטור חדירות הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס, תוך שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות המזהות שינויים בשלמות הממברנה הליזוזומלית והחמצתה.

הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס

מאמר זה מציג פרוטוקול LysoTracker של תאים חיים למדידת שיקום ליזוזומי במהלך הזדקנות בפיברובלסטים אנושיים מסוג IMR-90.

פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker להערכה כמותית של הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים

למד לזהות מות תאים מתוכנים בעוברי עכברים ובתרביות תאי גזע עובריים באמצעות צביעת LysoTracker. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברורה של דפוסי מוות תאי בביולוגיה התפתחותית.

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

גלה סרטונים נוספים