Name: מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: למדו את פרוטוקול ההבדלה של תאי מקור עצבי עובריים אנושיים לאוליגודנדרוציטים בשיטת תרבית תאים ללא תאי תמיכה. השיטה מייצרת אוכלוסיות טהורות לחקר ביולוגיה של מיאלין ומחלות דמיאלינציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית, במכונים הלאומיים לבריאות, NINDS. המחברים מבקשים להודות לכל אנשי המעבדה לרפואה המולקולרית ומדעי המוח, ריק דרייפוס עזר עם מיקרוסקופיה וניפוי ג פמלה לסיוע בעריכה.

הערה: לculturing השגרתי של אב עצבי ותאי שושלת oligodendrocytic, הדגירה מתבצעת על 37 מעלות צלזיוס ב5% 2 CO humidified אווירה. כל 2 ימים, הבינוני מוחלף בעזרת 50 עד 100% ממדיום טרי אם התרבות היא confluent 40-70%. בזמן confluency הקרוב, התרבויות הם passaged ב2-2.5e6/T75 בקבוק בדרך כלל על לוח זמנים שבועי. 1. הכנת הבקבוק המצופה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלוחיות מצופות לדלל 5 מ&quot;ג של פולי-D-ליזין (PDL) ב100 מיליליטר מי deionized (DI-מים), ואז מעייל T75 צלוחיות עם 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של PDL בטמפרטורת חדר (RT) בחושך. לאחר ½ 1 שעות, לשאוב PDL ולשטוף את צלוחיות פעם אחת עם DI-מים. תן לצלוחיות היבשות לפני זריעת התאים (טבלה 1). </li></ol> 2. החל התמיינות של תאי אב עצביים לתוך oligodendrocytes derived-מולידו (PDO) הפרוטוקול הואolate בתאים CNS אדם מתואר בפרסום קודם וזה לא חלק מ1 בפרוטוקול זה. תאי אב במערכת עצבים מרכזיים אדם בודדו מtelencephalon של מוח 8-שבוע הריון של עובר, המתקבל בהתאם להנחיות NIH. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגדל אוכלוסיית multipotential של תאי אב עצביים בצלוחיות מצופות בPDL בינוני neurobasal בתוספת 25 ng / ml של bFGF ו20 ng / מיליליטר גורם צמיחת אפידרמיס (EGF) (איור 1 א). אל תשתמש בם אם גבוה יותר מקטע 11 (P11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל כדי לבדל את תאי אב העצביים כאשר התרבות היא כ 70% confluent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך בינוני oligodendrocyte בידול מלא באמצעות מדיום סרום ללא DMEM / קותלי חזיר של F12 01:01 בתוספת סרום שור אלבומין, L-גלוטמין, גנטמיצין, רכיבי N2, T3, ששש, NT-3, bFGF, וPDGF-AA (טבלה 1) . מדיום זה יוגדר כבינוני Oligo עם גורמי גדילה (Oligo הבינוני + GF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Progenתקשורת itor מהצלוחיות, לשטוף תאים פעם אחת עם פוספט נאגר מלוח (PBS), לאחר מכן להוסיף Oligo בינוני + GF (פרטים מתוארים ב2.3) כדי להתחיל בידול oligodendrocyte. רק תאים המחויבים לשושלת oligodendrocytic יגדלו (1B איור). תרבות התאים במדיום הזה במשך 3 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל שבוע, כאשר התאים נמצאים בנקודת מפגש 90-95%, מעברם באמצעות טריפסין (0.05%)-EDTA (0.1%) (4 מ&quot;ל לבקבוק T75). להעביר את כל בינונית מהתאים שpassaged לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל; בינוני מזגן זה ישמש כדי להרוות טריפסין. ודא שלא לייבש את התאים. ואז להוסיף טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים בטריפסין למשך 5 דקות בRT, הכה בעדינות על הבקבוק מספר פעמים כדי לעזור ניתוק תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את טריפסין על ידי הוספה של 4-5 מיליליטר מדיום מותנה לבקבוק עם תאים המשפחתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המדיום ואת התאים לאותו הצינור 50 מיליליטר חרוטים. צנטריפוגה הבינונית והתאים של 1,200 סל&quot;ד (~300 XG) למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, resuspend תא הגלול, בעדינות להטות את הצינור, ולאחר מכן להוסיף את המקור Oligo טרי + GF. עדינות פיפטה הבינונית ותאים למעלה ולמטה כדי להפוך את השעית תא אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים, ו2.5e6 העברה לכל T75 בקבוק חדש PDL מצופה. </li></ol> 3. שלב סופי בבידול של oligodendrocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שבועות של התרבות בOligo בינוני + GF, כאשר התאים נמצאים בנקודת מפגש 70-80%, להתחיל את התהליך הסופי של התמיינות (התרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני באותה הדרך כמו Oligo הבינוני + GF אך מבלי להוסיף 4 GF: ששישה, NT-3, bFGF וPDGF-AA. המדיום הזה ללא 4 GF יוגדר כבינוני Oligo - GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום Oligo + GF מהבקבוק, ולשטוף פעם עם PBS ולאחר מכן להוסיף בנפח כולל של 16 מ&quot;ל של מדיום, ש¾ (12 מ&quot;ל) הוא Oligo בינוני - GF ו¼ (4 מ&quot;ל) הוא מדיום מותנה PDN, עבור 6-10 ימים). השימוש במדיום מותנה מPDN אינו חיוני לתהליך ההתמיינות או להישרדות של התאים. אנחנו למעשה ציינו כי קשר היחיד ישיר של PDO עם תאי PDN בניסויי שיתוף התרבות הייתה השפעה על משך הישרדות PDO. זמן ההישרדות בOligo בינוני - GF עשוי להתמשך, לשבועות או שלושה, אם תאי PDO הם שיתוף תרבית עם תאים-PDN. הפרוטוקול להבדיל ובתאים עצביים אדם לPDN מתואר בפרסום קודם וזה לא חלק מ1 בפרוטוקול זה. נסיגה גורם גדילה מהתוצאות הבינוניות התרבות בתרבות מובחנת בהדרגת תאים עם תהליכים מרובים (1D איור). </li></ol> 4. Assay הזרימה cytometry בדיקת זרימת cytometry משווה את הרכישה של סמני oligodendrocyte במהלך תהליך ההתמיינות במערכת יחסים עם אלו של אוכלוסיית הוריהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פרו עצביgenitors כשליטה. תאי זרע PDO ב2.5x10 6 תאים בשתי T75 צלוחיות מצופות ב- D-ליזין פולי בOligo הבינוני + GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבוע לאחר מכן, החלף בינוני עם בינוני Oligo טרי + GF בצלוחיות כתרבות שליטה לכדאיויות תא, בעוד צלוחיות אחרות היו Oligo בינוני - GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את תאי PDO בשני אמצעי התקשורת להשתמש 20 U / מ&quot;ל ​​של פפאין וטריפסין לא. הסיבה לכך היא פפאין יש השפעה עדינה על התאים במהלך דיסוציאציה שימור המורפולוגיה התאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של תמיסת המלח המאוזנת של ארל (EBSS) לבקבוקון פפאין. הנח את הבקבוקון על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או עד שהוא נמס לגמרי פפאין והפתרון נראה ברור. זהו פתרון פפאין נהג לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של EBSS לDeoxyribonuclease בקבוקוני (DNase) (טבלה 1). מערבב בעדינות. הוסף 0.25 מ&quot;ל של פתרון זה לבקבוקון של פפאין המומס. התכשיר מכיל ריכוז סופי של כ 20 U / ml פפאין ו0.005% DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון המקום פפאין (כמתואר לעיל) על תאים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15-30 דקות; לפקח על הניתוק של התאים באמצעות מיקרוסקופ. עצור את התגובה עם 5 מ&quot;ל של מדיום עם או בלי GF וצנטריפוגה בסל&quot;ד 1200 עבור 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כדורים סלולריים משתי הצלוחיות לשני צינורות פוליפרופילן 5 מ&quot;ל שונים ורחץ אותם במדיום הפיזיולוגי הנורמלי (NPM: 145 המ&quot;מ NaCl, 5 המ&quot;מ KCl, 1.8 mM CaCl 2, 10 מ&quot;מ וHepes הגלוקוז mM 10) בתוספת 1 ​​מ&quot;ג / מ&quot;ל שור אלבומין (NPM + BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע משטח immunostaining ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באמצעות נוגדנים ספציפיים עיקריים וכראוי לטיטרציה A2B5, O4, GalC (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם NPM + BSA ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ודגירתם עם נוגדנים ספציפיים משניים ב4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים אנטיגנים תוך תאיים כולל nestin, גליה fibrillary חומץ חלבון (GFAP), מעמד שלישי ויהיהת&quot;א;-טובולין, וחלבון המיאלין בסיסי (MBP) (טבלה 2), לתקן את התאים בparaformaldehyde 2% (PFA) במשך 20 דקות בRT וpermeabilize עם אתנול 70% קר במשך 15 דקות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 1x PBS ו דגירה עם נוגדנים ספציפיים משניים (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבחין בין תאים שלמים ופסולת subcellular במהלך ניתוח cytometry זרימה, תאים עם כתם 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydrochloride (DAPI) (חיים טכנולוגיים, גרנד איילנד, ניו יורק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופטימיזציה של הפרוטוקול לעיל, בצעו את כל ניסויי הבקרה המתאימות על מנת לאשר את הספציפיות של כל immunoreagent. בקצרה, לנוגדנים שכותרתו ישירות, השליטה השלילית המתאימה הייתה נוגדן ישירות מצומדת של אותה כיתת אימונוגלובולינים אלוטיפ (או תת) והצמוד fluorochrome כנוגדן ראשוני (כלומר, שליטת אלוטיפ). לimmunostaining העקיף של נוגדנים עיקריים, השליטה השלילית w המתאיםכנוגדן מצומד לfluorochrome עניין שממוקד ברמת אימונוגלובולינים (או תת) של המארח שבו הנוגדן הראשוני נוצר דווקא משני. כאשר נוגדנים עיקריים ממארחים מרובים (עכבר, ארנבת, עוף) היו בשימוש יחד, השתמש בנוגדן המשני מיקוד הנוגדן הראשוני של כל מארח וכל נוגדן משני השתמש היה לחצות adsorbed-בדרך כלל נגד נוגדנים מהצבאות האחרים כדי למזער צולב תארח immunoreactivity. הפקדים החיוביים כללו immunostaining ישיר או עקיף של הכנות סלולריות הידועות לבטא את האנטיגנים של עניין או באמצעות immunoreactions ישיר או עקיף עם נוגדנים הספציפיים לאנטיגנים אלה העיקריים. שיטות אופטימיזציה הנ&quot;ל בוצעו פעם אחת עבור כל סוג של immunostaining ניסויים. immunoreactions הבקרה עולה כי אין immunoreactivity הצולב epitope משמעותי בין נוגדנים ראשוניים ומשניים. cytometry הזרימה בוצע באופן אחידתאים מושעים כותרתו fluorescently באמצעות FACVantage SE תא סדרן (BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה) מצויד בשלושת לייזרים, המספקים אורכי גל עירור מכוון ל488 ננומטר, 647 ננומטר, וUV רחב (351-364 ננומטר) (איור 2) . </li></ol> 5. Assay immunofluorescence הערה: לניסויי immunofluorescence, PDO מצופים בOligo הבינוני + GF או Oligo בינוני - GF ב2.5e5 ב 6 גם צלחות מצופות PDL. התאים הם קבועים ב2% PFA בנקודתי זמן שונים לאחר נסיגה של גורמי גדילה. נוגדן כתם מבוצע על 6 גם צלחות פלסטיק במקום זכוכית coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ולהוסיף 2% PFA. דגירה במשך 10 דקות ב RT. השלך PFA. שטוף תאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם. יש להיזהר שלא לייבש את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים לסמנים תאיים באמצעות 0.25% פתרון טריטון ב PBS עבור 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע, תאים לחסום מחייבים שאינם ספציפיים ואו 10 דקות עם HHG (1 חיץ mM HEPES, סרום סוס 2%, וסרום עיזים 10% בתמיסת המלח המאוזנת &quot;הנקס). דלל נוגדנים ספציפיים עיקריים (טבלה 2) לריכוז שנקבע מראש בHHG. הנח נוגדנים מדוללים על גבי תאים. דגירת 1 שעות בRT בייקר או ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים 3 פעמים עם PBS, למשך 5 דקות בכל פעם. דלל נוגדנים משניים מתאימים (טבלה 2) בשילוב עם fluorochrome לריכוז שנקבע מראש בHHG. הנח את התערובת של נוגדנים משניים מדוללים על גבי תאים. דגירת 1 שעות בRT על שייקר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים 3 פעמים עם PBS, למשך 5 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מphotobleaching להוסיף 10 μl של להאריך זהב עם DAPI לתאים ומקום coverslip זכוכית על ראשם. דמיינו תאים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Axiovert 200 מ&#39;(Zeiss, Thornwood, ניו יורק) (איור 3). </li></ol>

<ol><li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li>
<li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+%28neuronal%29+and+bipotent+%28neuronal%2Fastroglial%29+EGF-generated+CNS+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276, 66-71 (1997).</li>
<li>Belachew, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+NG2+proteoglycan-expressing+progenitor+cells+are+intrinsically+multipotent+and+generate+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons.</a> J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li>
<li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li>
<li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li>
<li>Goldman, S. A., Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+niche-defying+feat%3A+induced+oligoneogenesis+in+the+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus.</a> Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).</li>
<li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nat. Med. 9, 439-447 (2003).</li>
<li>Lyssiotis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+induces+developmental+plasticity+in+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).</li>
<li>Sim, F. J., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+matter+progenitor+cells+reside+in+an+oligodendrogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Ernst+Schering+Res.+Found+Workshop%22%5BJournal%5D)">White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche.</a> Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).</li>
<li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-396 (1983).</li>
<li>Windrem, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cells+derived+from+the+adult+human+subcortical+white+matter+disperse+and+differentiate+as+oligodendrocytes+within+demyelinated+lesions+of+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain.</a> J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li>
<li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells%3A+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136, 1443-1452 (2009).</li>
<li>Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroblasts+distinguished+from+O-2A+glial+progenitors+by+surface+phenotype+%28O4%2BGalC-%29+and+response+to+cytokines+using+signal+transducer+LIFR+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.</a> Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).</li>
<li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+oligodendrocytes+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).</li>
<li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li>
<li>Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oligodendrocyte+and+its+many+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The oligodendrocyte and its many cellular processes.</a> Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).</li>
<li>Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+human+oligodendroglial+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Tracing human oligodendroglial development in vitro.</a> J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).</li>
<li>Bradl, M., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).</li>
<li>Chong, S. Y., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tapping+into+the+glial+reservoir%3A+cells+committed+to+remaining+uncommitted%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted.</a> J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).</li>
<li>Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+development+and+the+onset+of+myelination+in+the+human+fetal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain.</a> Front Neuroanat. 3, 5(2009).</li>
<li>Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serum-free+derivation+of+oligodendrocyte+precursors+from+neural+stem+cell-enriched+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures.</a> Stem Cells. 27, 116-125 (2009).</li>
<li>D'Intino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+administration+ameliorates+the+demyelination%2Fremyelination+ratio+in+a+non-human+primate+model+of+multiple+sclerosis+by+correcting+tissue+hypothyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism.</a> J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).</li>
<li>Cui, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li>
<li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להפיק oligodendrocytes העוברי מתאי אב עצביים עיקריים אדם ולאפיין פנוטיפ שלהם הוא באמצעות cytometry זרימה ומכתימה immunofluorescence. הגידול וההתרחבות של אבות עצביים ממערכת עצבים מרכזיים בעובר תוארה 1-4 טובים מאוד. עם זאת, קבלת oligodendrocytes אדם מספיק לניסויים במבחנה עדיין קשה, למרות שזה אפשרי לזהות ולבודד מבשרי גליה מחומר לבן אדם בוגר 5-13. היו ניסיונות שונים בהתפתחות של תנאי תרבות שונות לבידול ישיר של אבות עצביים עובריים ליי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> DME / קותלי חזיר של F12 01:01 </td><td> אומגת מדען </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> שור אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> איכות ביולוגית </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> איכות ביולוגית </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> T3 </td><td> סיגמא </td><td> T2877 </td><td> 3 ננומטר </td></tr><tr><td> רכיבי N2 </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> ששישה </td><td> מערכת מו&quot;פ </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> סיגמא </td><td> P6407 </td><td> 50 ק&quot;ג / מ &#39; </td></tr><tr><td> PFA </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> איכות ביולוגית </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> פפאין </td><td> וורטינגטון </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> בקבוקוני DNase </td><td> וורטינגטון </td><td> LK003172 </td><td> 0.005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> וורטינגטון </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך זהב עםDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. ריאגנטים. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> עיקריים שרירי בטן (כולם במיקרוגרם 1 / מ&quot;ל) </td><td></td><td> אלוטיפ מינים </td><td> מקור </td><td> Abs המשני </td></tr><tr><td colspan="5"> זרימת cytometry </td></tr><tr><td> A2B5-ביוטין </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> מתנת ג&#39;נילסון </td><td> Streptavidin פטר, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> מתנה מג&#39; נילסון </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> עכבר </td><td> 3 IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, הדרום יוטק, אל על </td></tr><tr><td> MBP </td><td> עוף </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, ג&#39;קסון Immu., הרשות הפלסטינית </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> עכבר </td><td> 1 IgG </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> ארנב </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, ג&#39;קסון Immu, הרשות הפלסטינית </td></tr><tr><td> טובולין βIII </td><td> עכבר </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, קליפורניה </td><td> gαm IgG 2-הפטר, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunocytochemistry </td></tr><tr><td> טובולין βIII (1:1,500) </td><td> עכבר </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, קליפורניה </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> ארנב </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, ג&#39;קסון Immu, הרשות הפלסטינית (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> עוף </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, ג&#39;קסון Immu, הרשות הפלסטינית (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> ארנב </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . טבלה 2 נוגדנים (ABS) המשמשים לזרימה cytometry ומבחני immunocytochemistry conjugates נוגדנים: PE, phycoerythrin; פטר, phycoerythrin טקסס אדומה; AMCA,-methyl-coumarin-יצטט אמין; סי, cyanine; FITC, isothiocyanate fluorescein IG:. אימונוגלובולינים. . AF: Alexa פלואוריד; gαm: עיזים אנטי עכבר; gαrb: עיזים נגד ארנב; dαck: חמור אנטי עוף. </td></tr></tbody></table>

מערכת מוליד-נגזר oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

בידול של אבות עצביים אדם לסוגי תאים עצביים וגליה מציע מודל ללמוד והשווה תקנה מולקולרית של התפתחות משפחה של תאים עצבית. בהרחבה במבחנה של אבות עצביים מרקמת מערכת עצבים המרכזיים של עובר כבר מאופיין היטב. למרות זיהוי והבידוד של אבות גליה מחומר אנושי בוגרים תת קורטיקלי לבן ופיתוח של תנאי תרבות שונות לבידול ישיר של אבות העובריים עצביים לתוך oligodendrocytes ייצור המיאלין, רכישת oligodendrocytes אדם מספיק לניסויים במבחנה נותר קשה. בידול של galactocerebroside + (GalC) וO4 + מבשר oligodendrocyte או תאי אב (OPC) מתאים מבשרים עצביים כבר דיווח על שימוש במוח עוברי שליש שני. עם זאת, התאים האלה אינם מתרבים בהיעדר תאי תמיכה כולל האסטרוציטים ונוירונים, והולכים לאיבוד במהירות לאורך הזמן בתרבות. הצורך נותר למערכת כדי לייצר תרבות תאים של השושלת המתאימה לניסויים במבחנת oligodendrocyte. תרבות של oligodendrocytes האנושי הראשוני יכולה, למשל, להיות מודל שימושי ללמוד פתוגנזה של חומרים מזהמים כמו neurotropic polyomavirus האנושי, JCV, שin vivo מדביק תאים אלה. תאים בתרבית אלה גם יכולים לספק מודלים של מחל demyelinating אחרות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). ראשוני, עוברי של אדם שמופק ממוח, ותאים עצביים multipotential להתרבות במבחנה, תוך שמירה על היכולת להתמיין לתאי עצב (נוירונים מוליד-derived, PDN) והאסטרוציטים (האסטרוציטים מוליד-derived, מחשבי כף יד) מחקר זה מראה כי אבות עצביים יכולים להיגרם להבדיל דרך כל שלבי התפתחות השושלת oligodendrocytic (oligodendrocytes מוליד-derived, PDO). אנחנו בתאים עצביים התרבות בתקשורת DMEM-F12 סרום נטול supplemented עם גורם טסיות נגזר גידול (PDGF-AA) גורם בסיסי גדילה (bFGF), סוניק קיפוד (שש), גורם neurotrophic 3 (NT-3), N-2 וtriiodothyronine (T3). את התאים בתרבית הם passaged בתאים 2.5e6 לצלוחיות 75cm בערך כל שבעה ימים. שימוש בתנאים אלה, רוב התאים בתרבית לשמור מורפולוגיה המאופיינת במספר תהליכים וסמנים מפורשים של תאים טרום oligodendrocyte, כגון A2B5 ו-O-4. כאשר אנו מסירים את גורמי הגדילה 4 (GF) (bFGF, PDGF-AA, ששש, NT-3) ולהוסיף תקשורת ממוזגת מPDN, התאים להתחיל לרכוש יותר תהליכים וסמנים ספציפיים מפורשים של בידול oligodendrocyte, כגון GalC ומיאלין חלבון בסיסי (MBP). בצענו אפיון הפנוטיפי באמצעות cytometry זרימה הססגונית לזהות סמנים ייחודיים של oligodendrocyte.

חשוב מאוד להתחיל את תהליך הבידול מתרבות 70% -80% confluent העצבית מוליד תא (איור 1 א). תאים רבים יגוועו לאחר שינוי התרבות הבינונית ממוליד עד בינוני Oligo שכן הוא כולל גורמי גדילה ספציפיות. זה מצביע על כך שהצמיחה של תאי אב עצביים אינה מחויבים לפנוטיפ oligodendrocytic לא להיות נתמכת על ידי המדיום החדש (1B איור). הדגירה בOligo בינוני + GF במשך שבוע אחד הביאה תרבות ביניים מציגה, מורפולוגיה דו קוטבית צרה (האיור 1B). התאים נשמרים בOligo...

ראשוני, תאים אנושיים עובריים מופקים ממוח, multipotential progenitor להתרבות<em&gt; במבחנה</em&gt; תוך שמירה על היכולת להתמיין לתאי עצב והאסטרוציטים. עבודה זו מראה כי אבות עצביים יכולים להיגרם להבחין דרך שלבים שונים של שושלת oligodendrocytic ידי מיזוג עם גורמי גדילה נבחרים.

מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

דיפרנציאציה של תאי אב עצביים אנושיים לסוגי תאי עצבים ותאי גליה מספקת מודל לחקר והשוואה של הבקרה המולקולרית על התפתחות שורות תאים עצביים. הרחבה במעבדה (in vitro) של תאי אב עצביים מרקמת מערכת העצבים המרכזית (CNS) עוברית אופיינה היטב. למרות הזיהוי והבידוד של תאי אב גליאליים מחומר לב תת-קורטיקלי של בני אדם בוגרים, ופיתוח תנאי תרבית שונים להכוונת דיפרנציאציה של תאי אב עצביים עובריים לאוליגודנדרוציטים מייצרי מיאלין, השגתן של כמות מספקת של אוליגודנדרוציטים אנושיים לניסויי in vitro נותרה קשה. דיפרנציאציה של תאי אב או תאי מקדימים לאוליגודנדרוציטים (OPC) חיוביים ל-galactocerebroside (GalC+) ו-O4+ מתאי אב עצביים דווחה תוך שימוש במוח עוברי מהטרמינוס השני. עם זאת, תאים אלו אינם מתרבים בהיעדר תאי תמיכה, כולל אסטרוציטים ונוירונים, ואובדנם בתרבית מהיר עם הזמן. נותר צורך במערכת תרבית לייצור תאים משורת האוליגודנדרוציטים המתאימים לניסויי in vitro. תרבית של אוליגודנדרוציטים אנושיים ראשוניים עשויה להיות, למשל, מודל שימושי לחקר הפתוגנזה של גורמים זיהומיים נוירוטרופיים כמו ה-polyomavirus האנושי, JCV, המדביק תאים אלו in vivo. תאים מתורבתים אלו עשויים לספק גם מודלים למחלות דמיאליניזציה אחרות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). תאי אב עצביים מולטיפוטנציאליים ראשוניים, המופקים ממוח עוברי אנושי, מתרבים in vitro תוך שמירה על היכולת להבדיל עצמם לנוירונים (נוירונים מושגים מתאי אב, PDN) ולאסטרוציטים (אסטרוציטים מושגים מתאי אב, PDA). מחקר זה מראה כי ניתן להשרות דיפרנציאציה של תאי אב עצביים דרך שלבים רבים של התפתחות שורת האוליגודנדרוציטים (אוליגודנדרוציטים מושגים מתאי אב, PDO). אנו מתרבים תאי אב עצביים במצע DMEM-F12 נטול סרום, המועשר בגורם גדילה בסיסי של פיברובלסטים (bFGF), גורם גדילה מושג מטבקיות (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), גורם נוירוטרופי 3 (NT-3), N-2 וטרי-יודו-תירונין (T3). התאים המתורבדים מועברים (passaged) בריכוז של 2.5e6 תאים לבקבוקי 75 סמ"ק בערך בכל שבעה ימים. תחת תנאים אלו, מרבית התאים בתרבית שומרים על מורפולוגיה המאופיינת במעט שלוחות ומבטאים סממנים של תאי קדם-אוליגודנדרוציטים, כגון A2B5 ו-O-4. כאשר אנו מסירים את ארבעת גורמי הגדילה (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) ומוסיפים מצע מותנה (conditioned media) מ-PDN, התאים מתחילים לרכוש שלוחות רבות יותר ומבטאים סממנים ספציפיים לדיפרנציאציה של אוליגודנדרוציטים, כגון GalC וחלבון מיאלין בסיסי (MBP). ביצענו אפיון פנוטיפי באמצעות ציטומטריית זרימה רב-צבעונית לזיהוי סממנים ייחודיים של אוליגודנדרוציטים.

סרטון זה מדגים שיטה לגדילה מבדלה של תאי אב עצביים ראשוניים מעוברים אנושיים לאוליגודנדרוציטים. ראשית, תאי האב העצביים גודלים במצע גידול לתאי אב עד להגעה לכמעט התמלאות (confluency). לאחר מכן, מצע הגידול לתאי האב מוחלף במצע לגדילה של אוליגודנדרוציטים, המועשר בגורמי גדילה המעודדים את תהליך הגדילה המבדלה. התאים גודלים ומורחבים לאחר מכן למשך שלושה שבועות.לאחר מכן, מחליפים את מצע גידול האוליגו-דנדרוציטים המועשר בגורמי גדילה במצע אוליגו-דנדרוציטים ללא גורמי גדילה, ומגדלים את התאים למשך שישה עד 10 ימים נוספים, עד שניתן להבחין בשינויים פנוטיפיים באמצעות מיקרוסקופיה. לאחר מכן, מאשרים את הדיפרנציאציה באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה וציטומטריה זרימתית, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים לשושלת האוליגו-דנדרוציטים. לבסוף, ניתן להשתמש באוליגו-דנדרוציטים שעברו דיפרנציאציה בהצלחה למחקרים in vitro של ביולוגיית אוליגו-דנדרוציטים ואינטראקציות עם גורמים זיהומיים כגון הפוליאומוווירס האנושי, JCV.אחד היתרונות הממשיים של הטכניקה שביססנו במעבדה זו, בהשוואה למה שפורסם כבר בספרות המקצועית, הוא שבמערכת שלנו ניתן לתרבת ולהבדיל אוליגודנדרוציטים ללא צורך בתאי תמיכה כגון אסטרוציטים ונוירונים. יתרון נוסף של הפרוטוקול שלנו, לדעתנו, הוא שהוא מאפשר לתרבת מספר רב של תאי אב אוליגודנדרוציטים המבטאים סמנים כגון ol4, שניתן לגדל בתרבית נטולת פתוגנים במשך שבועות רבים לאוכלוסיות תאים גדולות תוך שמירה על הפנוטיפ שלהם. תוצאת הסיום של תהליך הבידול מעניקה לנו אוכלוסייה כמעט טהורה של אוליגודנדרוציטים.ראשית, הגיתי את הרעיון לשיטה זו כאשר קראתי את הספרות הנרחבת על בידול in vitro של אוליגודנדרוციטים בתאי חולדה ותאי עכבר. כמו כן, חוקרים שונים הסירו גורמי גדילה מתרביות צפופות כדי להשלים את בידול התאים. מי שתדגים הליך זה באמצעות הפרוטוקול שלנו היא אלקסה בנדון, סטודנטית לתואר ראשון במעבדה שלנו כאן ב-N-I-N-D-S.כהכנה להבדלה, גדלו אוכלוסייה רב-פוטנציאלית של תאי אב עצביים בבקרים מצופים בפוליליזין בתוך מצע בסיסי עצבי, בתוספת BFGF ו-EGF, והשליכו תאים שאינם בשימוש. לאחר 11, כאשר התרבית מגיעה לכ-70 עד 80% התמזגות (confluency), התחילו את תהליך ההבדלה. לשם כך, שאבו את מצע תאי האב מהבקרים.שטפו את התאים פעם אחת עם PBS ולאחר מכן הוסיפו 12 milliliters של מצע אוליגו עם גורמי גדילה. הדגירו את התאים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide. לאחר שבוע, התאים שנותרו יפגינו מורפולוגיה ביפולרית צרה.לאחר שהתאים המובחנים הגיעו לרמה של לפחות 70% confluence, הסירו את המצע והעבירו אותו למיכל קוני נקי בנפח של 50 milliliter. השאירו את המצע המותנה השמור לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, הוסיפו במהירות ארבעה milliliters של 0.05% trypsin, 0.1% EDTA לתאים, והדגירו אותם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.הקשה עדינה על הבקרה מספר פעמים כדי לסייע לניתוק התאים. לאחר האינקובציה, יש לעצור את פעולת ה-trypsin על ידי הוספה של ארבעה עד חמישה מיליליטר של המצע המותנה שנשמר אל תוך הבקרה. לאחר מכן, העבירו את המצע ואת התאים בחזרה אל תוך הַמבּוֹבְנָה (conical tube) בנפח 50 מיליליטר.לאחר מכן, סבבו במרכזפוגה את המצע ואת התאים ב-310 RCF למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. עם סיום הסבב, שאבו את הנוזל העליון. השביחו את משקע התאים על ידי תיפוף עדין של המבחנה, ולאחר מכן הוסיפו מצע oligo רענן עם גורמי גדילה.שאיף בעדינות את המדיום והתאים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה כדי ליצור סספנזיית תאים אחידה. ספור את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, העבר 2.5 מיליון תאים לבקבוקי T 75 חדשים מצופים ב-poly de lysine, והצב את התרבית באינקובטור. לאחר שלושה שבועות, כאשר התאים מגיעים ל-80 עד 85% התלכדות (confluence), שאף את מדיום ה-oligo עם גורמי הגדילה מהבקבוק.שטפו פעם אחת עם PBS ולאחר מכן הוסיפו 12 milliliters של מצע אוליגו (oligo medium) ללא גורמי גדילה וארבעה milliliters של מצע לא מותנה לתאי עצב נגזרים מתאי אב (progenitor derived neuron unconditioned medium). השאירו את התאים במצע זה למשך שישה עד 10 ימים בימים חלופים. בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast microscopy) כדי להעריך את הדיפרנציאציה וההצפיפות (confluency), והחליפו לפחות 50% מהמצע לאחר הסרת גורמי הגדילה; התאים יפתחו בהדרגה שלוחות מרובות, דבר המעיד על דיפרנציאציה מוצלחת של התאים לאוליגודנדרוציטים נגזרים מתאי אב (progenitor derived oligodendrocytes).בשלב זה, ניתן להשתמש באוליגודנדרוציטים שהופקו מתאי מקור עבור ניסויי ציטומטריה זרימה או אימונופלואורסצנציה, כפי שמתואר בסעיפים הבאים של סרטון זה. בדיקת הציטומטריה זרימה משווה את רכישתם של סמני אוליגודנדרוציטים במהלך תהליך ההבשלה ביחס לאלו של אוכלוסיית ההורים שלהם. תאי מקור עצביים אנושיים משמשים כביקרות C. 2.5 מיליון תאי אוליגודנדרוציטים שהופקו מתאי מקור בכל אחד משני בקבוקי T 75 המצופים ב-poly lysine, במצע אוליגו עם גורמי גדילה, באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. שבוע לאחר מכן, החליפו את המצע באחד הבקבוקים במצע אוליגו טרי המכיל גורמי גדילה, כביקורת לחיוניות התאים.החליפו את המצע בבקרוח השני במצע אוליגו טרי ללא גורמי גדילה. תרבלו תאים אלו למשך עד 10 ימים; שלושה עד תשעה ימים לאחר הסרת גורמי הגדילה, התאים יתחילו לפתח שלוחות רבות יותר, האופייניות לפנוטיפ של אוליגודנדרוציט. כדי להפריד את תאי האוליגודנדרוציטים שנגזרו מתאי progenitor, שאבו את המצע והוסיפו 5.25 milliliters של תמיסת perian לכל בקרוח.משתמשים ב-Perian במקום ב-trypsin מכיוון שיש לו השפעה עדינה יותר על התאים במהלך הדיסוציאציה. כדי לשמור על המורפולוגיה התאית, דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 עד 30 דקות. בדקו מעת לעת את ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופ.לאחר ניתוק התאים, הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע עם או ללא גורמי גדילה כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, העבירו את תכולת כל בקבוק למבחנה קונית של 15 מיליליטר. סובבו את המבחנות ב-310 RCF למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר; לאחר הצנטריפוגציה, שאבו את העלייה ותלו את משקעי התאים בארבעה מיליליטר של מצע פיזיולוגי רגיל, בתוספת מיליגרם אחד למיליליטר של bovine serum albumin או NPM פלוס BSA.לאחר מכן ספרו את התאים כפי שנעשה קודם לכן, ועבור כל תנאי צביעה אימונו-היסטוכימית, העבירו 1 million cells לשפופרת פוליפרופילן של five milliliter. הקפידו לכלול את כל הביקרות המתאימות כדי לאשש את הספציפיות של כל ריאגנט אימונולוגי. לאחר מכן, לביצוע הצביעה האימונו-היסטוכימית, דגרו תחילה את התאים עם נוגדנים כנגד חלבוני פני השטח, A two B 5, 0 4, ו-gal C. לאחר מכן שטפו את התאים כדי להסיר נוגדנים ראשוניים שאינם קשורים, ודגרו אותם עם הנוגדנים המשניים המתאימים המסומנים בפלואורוכרום.לאחר מכן שוטפים שוב את התאים כדי להסיר את הנוגדנים המשניים. התאים מקובעים ב-2%paraldehyde ומועברים (permeated) באמצעות 70%ethanol קר; לאחר מכן, לצורך צביעה של חלבונים תוך-תאיים, שוטפים את התאים ומדגירים אותם עם נוגדנים נגד nesting, glial fibrillary, acidic protein, class three beta tubulin ו-myelin basic protein. לאחר מכן שוטפים את הנוגדנים הראשוניים שלא נקשרו.מדגרירים את התאים עם הנוגדנים המשניים המתאימים המסומנים בפלואורוchrome. לבסוף, כדי להבדיל בין תאים שלמים לבין שברים תת-תאיים במהלך ניתוח בציטומטריה של זרימה, מדגרירים את התאים עם four six DIA medino. Two phenol Lind dihydrochloride או dappy; מבצעים ציטומטריה של זרימה במכשיר המצויד בשלושה לייזרים, המספקים אורכי גל עירור המכוונים ל-4 88 nanometers, 6 47 nanometers ו-UV רחב. להכנה למסכימיה פלואורסצנטית, מכינים six poly D lysine coated.פלטות בעלות שישה בארות עם 250,000 תאים של אוליגודנדרוציטים המופקים מתאי פרוגניטור לכל באר. שתי פלטות דרושות עבור כל נקודת זמן. אחת תגודל עם גורמי גדילה ואחת ללא גורמי גדילה כאשר התאים מגיעים ל-70 עד 80% התלכדות (confluent).שאבו מהפלטה את המצע עם גורמי הגדילה. שטפו פעם אחת עם PBS ולאחר מכן הוסיפו 12 milliliters של מצע ללא גורמי גדילה. בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית חמישה ותשעה ימים לאחר הסרת גורמי הגדילה באופן הבא: ראשית, קבעו את התאים עם 2%PFA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, השליכו את ה-PFA ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, טרטטו את התאים עם 0.25% triton, ולאחר מכן, כדי למנוע קישור לא ספציפי, חסמו את התאים עם 2% horse serum ו-10% goat serum. לאחר החסימה, דגרו את התאים עם נוגדנים נגד beta three tubulin, G-F-A-P-M-V-P oh four ו-gal C. לאחר מכן, שטפו את הנוגדנים שלא נקשרו מהתאים ודגרו את התאים עם הנוגדנים המשניים המתאימים המסומנים בفلואורוכרום.שטפו מהתאים את הנוגדנים המשניים שלא נקשרו, ולאחר מכן, כדי למנוע דהייה פוטו-כימית (photobleaching) ודהייה של הצבע, קבעו את הגרעין. הניחו את זכוכית הכיסוי באמצעות 10 µL של prolonged gold עם dpi.הדמיئو תאים מסומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם סט המסננים המתאים, כדי לקבוע האם תאי אב עצביים ראשוניים של בני אדם יכולים להבדיל עצמם לאוליגודנדרוციטים. תאי אב עצביים רב-פוטנציאליים תורבדו כפי שמתואר בסרטון זה. לאחר מכן, שינויים פנוטיפיים נוטרו באמצעות ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.כפי שניתן לראות כאן. מרבית התאי הפרוגניטורים העצביים מביעים את Nestin, סמן של תאי גזע נוירו-אפיתליאליים, בעוד שרק תתי-אוכלוסיות קטנות מביעות סמנים מגבילי שושלת, כגון GFAP, סמן האסטרוציטים, class three beta tubulin, סמן נוירונלי, או oh four, סמן האוליגודנדרוציטים. כאשר תהליך ההחלפה של מצע התרבית למצע אוליגו בתוספת גורמי גדילה בוצע והתאים תורבדו למשך שבוע אחד, נצפתה ירידה בביטוי של Nestin ועלייה בביטוי של A2B5 לאחר שבועיים.הביטוי של Nestin פחת עוד יותר, והביטוי של סמן התאיים הקדמוניים הנוירוגליאליים, A2B5, עלה. הביטוי של סמן אוליגודנדרוציטים נוסף, O4, עלה אף הוא יומיים לאחר הפסקת מתן גורמי גדילה. הביטוי של O4 והביטוי של GAL C, סמן אוליגודנדרוציטים מאוחר, עלו שישה ימים לאחר הפסקת מתן גורמי הגדילה. הביטוי המשותף של O4 ו-GAL C עלה והיה דומה לביטוי המשותף של GAL C ו-MBP.צביעה אימונוהיסטוכימית של מספר אפיתופים מעלה כי 72% מהתאים בתרבית ביטאו MBP. ראיות נוספות להבחנה של אוליגודנדרוציטים שמקורם בתאי פרוגניטור אפיינו באמצעות תבחנה אימונופלורסצנטית. יומיים לאחר הפסקת מתן גורמי גדילה, זוהתה ביטוי של MVP שמוצג בירוק.מדד זה עלה ביום החמישי ועלה עוד יותר ביום התשיעי. הלוקליזציה של MVP באוליגודנדרוציטים מובחנים היא ניכרת. יחד, נתונים אלו מצביעים על כך שתרביות של תאי פרוגניטור עצביים עובריים אנושיים, המטופחות בשיטה המתוארת, מסוגלות להתרבות in vitro תוך שמירה על היכולת להבדיל דרך שלבי השושלות של האוליגודנדרוציטים.בעקבות הפיתוח של פרוטוקול זה, הטכניקה מאפשרת כעת לחוקרים בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית, מדעי המוח והוירולוגיה לחקור את הביולוגיה של המוח האנושי ומחלות המשפיעות עליו, ובמיוחד כאלה שמובילות למחלות של החומר הלבן.

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר שיטות להפיק אוכלוסיות מועשר Murine של תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) בתרבות העיקרי, אשר להבדיל לייצר oligodendrocytes בוגרת (OLS). בנוסף, דו"ח זה מתאר את טכניקות כדי לייצר Murine myelinating שיתוף תרבויות על ידי זריעת OPCs העכבר על המיטה neurite של הגב עכבר שורש עצב הגנגליון (DRGNs).

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

פרוטוקול זה מתאר את הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ מיתרי השדרה העובר ומתוחזק במבחנה או להשתלה או למחקר של שושלת oligodendrocytic.

הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים

סרטון זה מדגים פרוטוקול מפורט לבידוד דפנות החדר הצידי ממוחו של עכבר בוגר וביצוע דיסוציאציה אנזימטית של רקמות להשגת תאים בודדים. תאים אלה נתונים לאחר מכן לתנאי תרבית ספציפיים המשפרים באופן סלקטיבי את התפשטות תאי גזע עצביים ומקדמים את התמיינותם לתרביות משותפות של אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים.

השגת תרבית אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים מעורבת מתאי גזע עצביים של עכברים בוגרים

סרטון זה מדגים את הקמתה של תרבית משותפת של תאי עצב המושרים על ידי בני אדם (iNs) ותאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים מושרים (iOPCs). iNs מעורבבים עם iOPCs בתרבית משותפת ולאחר מכן מודגרים כדי לתמוך בהבשלה של iNs לנוירונים ו- iOPCs לאוליגודנדרוציטים. תאי עצב יוצרים קשרים סינפטיים עם תאי עצב ואוליגודנדרוציטים אחרים, בעוד שאוליגודנדרוציטים מפתחים מעטה מיאלין סביב אקסוני הנוירונים.

שיטת תרבית משותפת למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) מקליפת המוח של גור העכבר.

בידוד וטיפוח תאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים מקליפת המוח של גור עכבר

אוליגודנדרוציטים הם תאי המיאלין של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ותרבית של קודמיהם, תאי אב אוליגודנדרוציטים, מקליפת חולדות, כמו גם שיטה כמותית מהירה ואמינה להערכת אוליגודנדרוגנזה במבחנה בתגובה לגורמים ניסיוניים.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

להלן, אנו מציגים שיטה יעילה לטיהור של oligodendrocytes הפוך וייצור של מדיום אוליגודנדרוציטים ממוזג שניתן להשתמש בהם לניסויים בשיתוף התרבות.

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה לneurite מוצלח הערכה ורעילות המוח של תרכובות מולקולה קטנה.

Neurite Outgrowth שיטת והערכה רעילות נוירועם האדם העצבי תא מחולל נוירונים

האינטראקציות הנוירוניות-גליאליות בניוון עצבי אינן מובנות היטב בשל כלים ושיטות לא מספקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים להשגת תאי עצב מושרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומספקים דוגמאות לערכים של שיטות אלה בהבנת תרומות ספציפיות לסוג התא במחלת אלצהיימר.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

אנו מתארים את הייצור של תרבויות מעורבות של אסטרוציטים ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים הנגזרים מתאי גזע עצביים עובריים או בוגרים המתבדלים לאוליגודנדרוציטים בוגרים, ומודלים במבחנה של גירויים מזיקים. הצימוד עם טכניקת סינון תוכן גבוהה מבוססת תא בונה מערכת סינון סמים אמינה וחזקה.

בידול וניתוח התבגרות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים שמקורם בתאי גזע עצביים

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואיד מוח אנושי עם מיקרוגליה תושבת על ידי שילוב תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) בהתפתחות אורגנואידים.

גזירה של אורגנואיד מוח אנושי עם התפתחות מיקרוגליה

למדו את פרוטוקול ההבדלה של תאי מקור עצבי עובריים אנושיים לאוליגודנדרוציטים בשיטת תרבית תאים ללא תאי תמיכה. השיטה מייצרת אוכלוסיות טהורות לחקר ביולוגיה של מיאלין ומחלות דמיאלינציה.

מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

גלה סרטונים נוספים