גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות ולזהות חיידקים באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים. זה מושג על ידי שחרור ראשון של ה-RNA הריבוזומלי מהחיידקים כדי לאפשר הכלאה עם בדיקת הגלאי המופלרת כשלב שני, ה-RNA הריבוזומלי הקשור לבדיקת הגלאי מתווסף לאלקטרודה העובדת, המאפשרת הכלאה עם בדיקת הלכידה על משטח החיישן. לאחר מכן, מצומד פרוקסידאז צנון סוס אנטי פלואורסצאין מותר להיקשר לבדיקת הגלאי הפלואור.

לבסוף, בזרם אינטרפרומטרי, שעוצמתו מתואמת למספר בדיקות הלכידה הריבוזומליות, ניתן להשיג מתחמי בדיקה של גלאי RNA על פני החיישן. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות מבוססות תרבית הוא שניתן לזהות ולזהות חיידקים תוך כ-45 דקות, תוך הימנעות ממשקל הלילה. כדי שחיידקים ייצרו מושבה גלויה על צלחת EDGAR יישום טכניקה זו ישפר את הניהול של מחלות זיהומיות.

מכיוון שגילוי מוקדם של פתוגנים חיידקיים חיוני לטיפול אנטיביוטי ממוקד ולשיפור התוצאות הקליניות. אם כי שיטה זו שימושית לאבחון מחלות זיהומיות שניתן ליישם גם על בעיות אבחון אחרות כגון אבחון חיסוני. התחל בדגירה של בדיקת הלכידה המורחבת עם הקסאן די תיול למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להבטיח שקבוצת התיול בבדיקת הלכידה מופחתת, וכתוצאה מכך תוצאות עקביות יותר.

לאחר הדגירה, יש למרוח זרם חנקן כדי לשאת זהב. 16 שבבי מערך חיישנים למשך חמש שניות כדי להסיר לחות או חלקיקים, יש למרוח בזהירות כמויות קטנות של נוזל על האלקטרודה העובדת במערך החיישנים. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית.

מכיוון שביצוע נכון של טכניקות הפיפטינג והכביסה והייבוש מפחית מאוד את השונות של השבב לשבב. לאחר מכן, יש למרוח שישה מיקרוליטרים של תערובת בדיקת הלכידה המורחבת HDT על האלקטרודה העובדת של כל 16 החיישנים של מערך החיישנים ולאחסן את שבבי החיישן בצלחת פטרי מכוסה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת, לשטוף את שבבי החיישן במים נטולי יונים למשך שתיים עד שלוש שניות, ולאחר מכן לייבש את השבבים מתחת לזרם חנקן למשך חמש שניות. כעת יש למרוח שישה מיקרוליטרים של נתרן כלוריד אטרי הידרוכלוריד, תמיסת EDTA MERCAPTOETHANOL על האלקטרודה העובדת של כל 16 החיישנים, ולדגור את החיישנים למשך 50 דקות בצלחת פטרי בטמפרטורת החדר.

להכנת הדגימות לבדיקת החיישן האלקטרוכימי. העבירו מיליליטר אחד של תרבית חיידקים בשלב היומן של הגידול לצינור מיקרו צנטריפוגה, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים למשך חמש דקות ב-16,000 גרם. שימו לב שיש לטפל בחיידקים פתוגניים במכסה מנוע לבטיחות ביולוגית.

לאחר הסרת הסנאט, מרחו קצה פיפטה המכיל 10 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד על תחתית צינור המיקרו צנטריפוגה ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להשעות מחדש את הגלולה. לאחר דגירה של התרחיף בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, הוסף 50 מיקרוליטר של PBS המכיל אלבומין בסרום בקר או BSA ובדיקת גלאי שונה פלואורסצאין כדי לנטרל את הליזאט החיידקי. לאחר מכן דגרו את הליזט המנוטרל למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

התחל שלב זה על ידי שטיפת תמיסת המרקפטואתנול מאחד משבבי החיישן המוכנים במים נטולי יונים למשך שתיים-שלוש שניות. לאחר ייבוש השבב כפי שהודגם זה עתה, יש למרוח ארבעה מיקרוליטרים של ליזאט החיידקים המנוטרלים על האלקטרודות העובדות. 14 מהחיישנים.

לאחר מכן החל ארבעה מיקרוליטרים של האוליגונוקלאוטיד המגשר בבדיקת הגלאי PBS בתוספת BSA בתוספת פלואורסצאין על שני חיישני הבקרה החיוביים. לאחר מכן לאחר דגירה של חיישני הליזאט והבקרה החיובית למשך 15 דקות, יש לשטוף ולאחר מכן לייבש את כל שבב החיישן כמו קודם. כעת יש למרוח ארבעה מיקרוליטרים של פרוקסידאז צנון סוסים אנטי פלואורסצאין או HRP ב-PBS המכיל קזאין על האלקטרודות העובדות של כל 16 החיישנים.

לאחר דגירה של 15 דקות יש לשטוף ולייבש את שבב החיישן. לאחר מכן, החל מדבקת באר סרט על פני שבב החיישן וטען את השבב לתוך שבב החיישן תושבת פיפטה 50 מיקרוליטר של מצע TMB על כל 16 החיישנים וסגור את תושבת שבב החיישן. לבסוף, השתמש בקורא שבבים של הליוס כדי לקבל מדידות פירומטריה וטלמטריה מחזוריות עבור כל 16 החיישנים.

הבדיקה האלקטרוכימית שתוארה זה עתה בנויה בדומה לכריך, אלייזה, כפי שמוצג באיור זה ריבוזומלי מטרה, הכלאת RNA עם בדיקות לכידה וגלאי מפותחת על ידי תגובת חמצון חיזור מזורזת על ידי HRP מצומד לשברי נוגדנים אנטי פלואורסצאין הקושרים את שלושת הקישור פלואורסצאין על גשושית הגלאי. מרכיב חשוב ברגישות הבדיקה הוא כימיית פני השטח של אלקטרודת הזהב. אלקטרודת הזהב מצופה במרקפטואתנול והין אול והיא מתפקדת על ידי תוספת של בדיקות לכידה מורחבות.

הכלאת הסנדוויץ' של ה-RNA הריבוזומלי המטרה עם בדיקת הלכידה ובדיקת הגלאי המסומנת בפלואורסצאין מביאה לקומפלקס המתגלה על ידי תוספת של מצומד פרוקסידאז צנון סוסים אנטי פלואורסצאין, ומצע TMB. הזרם הפרמטרי M נוצר על ידי מחזור החיזור הנובע מחמצון ה-TMB על ידי חזרת פרוקסידאז והפחתת ה-TMB על ידי האלקטרונים מהאלקטרודה. הבדיקות שהודגמו כאן משתמשות בשבב מערך חיישנים נוזלי של גנים 16

כל אחד מהחיישנים במערך מכיל שלוש אלקטרודות, ייחוס עבודה ועזר, שיש להן נקודות מגע בקצה השבב. לקורא השבבים יש סיכות פוגו המתחברות לכל אחת מנקודות המגע. קורא השבבים משמש כממשק למערך החיישנים עם פוטנציומטר הנשלט על ידי אלגוריתם ממוחשב.

כאן מוצגות דוגמאות לזרימת זרם חיישן אלקטרוכימי. זרימת הזרם בחיישנים גבוהה באופן מלאכותי בחיישנים במהלך השניות הראשונות לאחר תחילת המדידות הפרמטריות. בגלל הצטברות המצע המחומצן במהלך הזמן מיישום TMB על משטח החיישן, ועד להפעלת אלגוריתם הקורא, זרימת הזרם מגיעה במהירות למצב יציב וניתן להשיג קריאות חיישנים מדויקות באופן אמין תוך 60 שניות.

השונות מחיישן לחיישן קבועה יחסית, כך שניתן לבצע 16 בדיקות חיישנים שונות במקביל על שבב מערך החיישנים הנוזלי של הגנים 16 בקרות חיוביות ושליליות חיוניות כבקרה חיובית. בדרך זו נעשה שימוש באוליגונוקלאוטיד DNA מגשר סינתטי המשתלב הן לבדיקות הלכידה והן לגלאי ומשמש כמטרה סינתטית בריכוז ידוע. התוצאות התקבלו תוך שימוש בפונקציית האוליגונוקלאוטיד המגשר כבקרת כיול פנימית כדי למזער את השונות משבב לשבב.

ככל שהזרם השלילי של האלקטרודה גדול יותר, כך האות גבוה יותר. בעת בדיקת בדיקות לכידה וגלאי. יש לקבוע את גבול הזיהוי על ידי דילול סדרתי של דגימה בריכוז ידוע כפי שמוצג באיור זה, יש מתאם לוג לוג ליניארי בין ריכוז הדגימה לפלט האות על פני הטווח הדינמי של הבדיקה.

בתרשימי עמודות אלה, התוצאות המייצגות עבור דגימות המכילות esia coli ו-kleb seal ואמוניה, הנמצאות לעתים קרובות בשתן של חולים עם דלקת בדרכי השתן, מוצגות שהאותות עבור רוב החיישנים יהיו נמוכים ודומים, וניתן לאגד את התוצאות השליליות הללו כאשר תגובתיות אות הרקע עם צמד בדיקות KE מבדילה בין קאנון ל-e coli. האוליגונוקלאוטיד המגשר משמש כתקן בקרה חיובי וכיול פנימי. ניתן ליישם טכניקה זו לאיתור חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה בדגימות קליניות על ידי מדידת התגובה הפנוטיפית של החיידקים לאנטיביוטיקה.

ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע את הטיפול האופטימלי עבור מטופל בודד. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לזהות ולזהות חיידקים על ידי השוואת הזרמים האטריקיים בחיישנים הספציפיים של המינים השונים בשבב.