Name: BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית Unilamellar גדולה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: חקור אינטראקציות של חלבוני משפחת BCL-2 באמצעות מודל של שלפוחיות חד-שכבתיות גדולות (LUVs) המחקות את מיטוכונדריה. שיטה זו מאפשרת ניתוח פלואורסצנטי של חדירות ממברנה ומספקת תובנות מכניות לגבי ויסות אפופטוזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לכל חברי מעבדת Chipuk על עבודתם המשותפת ותמיכתם. בנוסף, ברצוננו להביע הערכה ל-Tomomi Kuwana ול-Donald Newmeyer על פיתוח התשתית הניסויית לעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי: NIH CA157740 (עבור J.E.C.), ופרויקט פיילוט מ-NIH P20AA017067 (עבור J.E.C.). עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי מענק מחקר 5-FY11-74 מקרן March of Dimes Foundation (עבור J.E.C.).

<ol><li>Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BCL-2+family+reunion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The BCL-2 family reunion.</a> Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+ten+minutes+to+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: ten minutes to dead.</a> Cell. 121, 671-674 (2005).</li>
<li>Gavathiotis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAX+activation+is+initiated+at+a+novel+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAX activation is initiated at a novel interaction site.</a> Nature. 455, 1076-1081 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+trigger+apoptosis%2C+Bak+exposes+its+BH3+domain+and+homodimerizes+via+BH3%3Agroove+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions.</a> Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bak+activation+for+apoptosis+involves+oligomerization+of+dimers+via+their+alpha6+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices.</a> Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).</li>
<li>Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-triggered+structural+reorganization+drives+the+activation+of+proapoptotic+BAX%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX.</a> Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+apoptosis+induction+by+inhibition+of+the+anti-apoptotic+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).</li>
<li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+BH3+domains+either+sensitize+or+activate+mitochondrial+apoptosis%2C+serving+as+prototype+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lipids+cooperate+to+form+supramolecular+openings+in+the+outer+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane.</a> Cell. 111, 331-342 (2002).</li>
<li>Lovell, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+by+tBid+initiates+an+ordered+series+of+events+culminating+in+membrane+permeabilization+by+Bax%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax.</a> Cell. 135, 1074-1084 (2008).</li>
<li>Hsu, Y. T., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonionic+detergents+induce+dimerization+among+members+of+the+Bcl-2+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family.</a> J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Bax%3A+coregulation+of+dimer+formation+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization.</a> Cell. 103, 645-654 (2000).</li>
<li>Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+other+than+Bim+and+Bid+can+directly+activate+Bax%2FBak%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak.</a> J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).</li>
</ol>

לא הוצהרו ניגודי אינטרסים.

השיטה המתוארת ליצירת LUVs מאפשרת דרך מהירה ויעילה לבדיקת התפקוד של חלבוני משפחת BCL-2 שונים, פפטידים וריאגנטים קשורים בסביבת ממברנה מוגדרת ביוכימית הדומה ל-OMM. אם משתמשים בערכי נקודת סיום (end point) כדי לקבוע את חדירות ה-LUVs, ניתן להכין מספר פלטות כדי לנתח מאות תנאים ביום אחד. מצאנו כי הריאגנטים המגבילים במבחנים אלו נוטים להיות האיכות והכמות של החלבונים הרקומיננטיים, לכן הקדשת זמן ומשאבים מספיקים לניקוי חלבונים תאפשר תוצאות הדירות במבחני LUV.
מניסיוננו, כאשר LUVs מאוחסנים ב-4 °C בחושך, הם ...

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph&amp;#8211;thanolamine &quot;PE&quot;</td><td>Avanti</td><td>850725C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine (ביצה, תרנגולת) &quot;PC&quot;</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylinositol (כבד, בקר) &quot;PI&quot;</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylserine (מוח, חזיר) &quot;PS&quot;</td><td>Avanti</td><td>8400320</td><td></td></tr><tr><td>Cardiolipin (לב, בקר - מלח נתרן) &quot;CL&quot;</td><td>Avanti</td><td>840012C</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני-אקסטרודר (Mini-extruder set)</td><td>Avanti</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת PC 0.2 mM</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>פלטת 96 בארות שחורה של Costar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td></td></tr><tr><td>BID אנושי שעבר שסוע על ידי Caspase-8</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>882-B8-050</td><td></td></tr><tr><td>BCL-xL אנושי (ללא הקצה הקרבוקסילי)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>894-BX-050</td><td></td></tr><tr><td>פפטידים של דומיין BH3 מ-BID/PUMA</td><td>Anaspec</td><td>61711/62404</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות רב-מצב היברידי Synergy H1</td><td>BioTek</td><td>None</td><td></td></tr></tbody></table>

bcl-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית ​​unilamellar גדולה

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

משפחת ה-BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) מורכבת מכ-עשרים חלבונים הפועלים יחד כדי לשמר את הישרדות התא או להוביל לאפופטוזיס1. בעקבות עקה תאית (למשל, נזק ל-DNA), האפקטורים הפרו-אפופטוטיים ממשפחת BCL-2, BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) ו/או BAX (BCL-2 associated X protein), הופכים לפעילים ופוגעים בשלמות ממברנת המיטוכונדריה החיצונית (OMM), בתהליך המכונה חדירות ממברנת המיטוכונדריה החיצונית (MOMP)1. לאחר התרחשות MOMP, חלבונים פרו-אפופטוטיים (למשל, cytochrome c) חודרים לציטופלזמה, מעודדים הפעלה של קספזים, ואפופטוזיס מתרחשת במהירות2.
כדי ש-BAK/BAX יגרמו ל-MOMP, הם זקוקים לאינטראקציות חולפות עם חברים בתת-קבוצה פרו-אפופטוטית אחרת של משפחת BCL-2, חלבוני BH3-only (חלבונים בעלי דומיין הומולוגי 3 של BCL-2 בלבד), כגון BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. חלבונים אנטי-אפופטוטים ממשפחת BCL-2 (למשל, BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) מווסתים את הישרדות התא על ידי בקרה הדוקה של האינטראקציות בין BAK/BAX לבין חלבוני ה-BH3-only המסוגלים להשראות ישירה של הש activates BAK/BAX7,8. בנוסף, הזמינות של חלבוני BCL-2 אנטי-אפופטוטים נקבעת גם על ידי חלבוני BH3-only מסוג sensitizer/de-repressor, כגון BAD (BCL-2 antagonist of cell death) או PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), אשר נקשרים למסלולים אנטי-אפופטוטים ומעכבים אותם7,9. מכיוון שמרבית הרפרטואר האנטי-אפופטוטי של BCL-2 ממוקם ב-OMM, ההחלטה התאית לשמר את ההישרדות או להשריע MOMP נקבעת על ידי אינטראקציות מרובות של משפחת BCL-2 בממברנה זו.
שלפושיות אונילמלולריות גדולות (LUVs) מהוות מודל ביוכימי לבחינת הקשרים בין אינטראקציות של משפחת BCL-2 לבין חדירות ממברנה10. LUVs מורכבות מליפידים מוגדרים המורכבים ביחסים שזוהו במחקרי הרכב ליפידי של מיטוכונדריה של Xenopus שהופקו באמצעות ממס (46.5% פוספטידילכולין, 28.5% פוספטידילאתנולאמין, 9% פוספטידילינוזיטול, 9% פוספטידילסרין, ו-7% קרדיוליפין)10. זוהי מערכת מודל נוחה לבחינה ישירה של תפקוד משפחת BCL-2 מכיוון שמרכיבי החלבון והליפידים מוגדרים לחלוטין וניתנים לניהול, מה שלא תמיד קורה במיטוכונדריה ראשונית. למרות שריכוז הקרדיוליפין בדרך כלל אינו גבוה כך לכל אורך ה-OMM, מודל זה מדמה נאמנה את ה-OMM כדי לקדם את תפקוד משפחת BCL-2. יתרה מכך, התאמה עדכנית יותר של הפרוטוקול לעיל מאפשרת ניתוחים קינטיים של אינטראקציות בין חלבונים ומדידות בזמן אמת של חדירות ממברנה, המבוססות על LUVs המכילות צבע פוליאניוני (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) ומכבה קטיוני (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. ככל שה-LUVs הופכות לחדירות, ANTS ו-DPX מפיצים זה מזה, ונמדדת עלייה בפלואורסצנציה. כאן מתוארים שילובי חלבונים רקומביננטיים נפוצים של משפחת BCL-2 ובקרות באמצעות LUVs המכילות ANTS/DPX.

שלפוכות חד-שכבתיות גדולות (LUVs) המוגדרות ביוכימית הן מערכת מודל נוחה לניתוח אינטראקציות של משפחת BCL-2, עם השלכות מיידיות להבנה טובה יותר של נתיב האפופטוזיס המיטוכונדריאלי. מוצגת כאן שיטה להכנת LUVs, יחד עם שילובי חלבונים סטנדרטיים ממשפחת BCL-2 ובקרות לבחינת חדירותן של ה-LUVs.

BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית ​​Unilamellar גדולה

משפחת ה-BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) מורכבת מכ-עשרים חלבונים הפועלים בשיתוף פעולה כדי לשמר את הישרדות התא או להוביל ל...

מערכת מודל זו, המוגדרת ביוכימית וכוללת וסיקולות גדולות (LUVs), מדמה את ממברנת המיטוכונדריה החיצונית כדי לבחון את תפקודם של חלבוני BCL2 in vitro. ראשית, ערבבו את הליפידים וצרו שכבת ליפידים בתוך מבחנה אטומה. לאחר מכן, הכינו תמיסת LUV טרייה והמיסו את שכבת הליפידים.בשלב הבא, השריצו את תמיסת הליפידים וטהרו את ה-Ella Les הגדולים באמצעות סינון ג'ל. השלב האחרון הוא ניתוח של ה-L UUVs כדי לבדוק עלייה בפלואורסצנציה המושרה על ידי דטרגנט. לבסוף, מערכת מודל ה-LUV משמשת להערכת התפקוד והבקרה של חלבונים חדירי ממברנה, כגון חלבון BCL two רקומביננטי.לגישה זו, המשתמשת בוויזקולות ענקיות (large unilamellar vesicles), יש מספר יתרונות על פני מערכות קיימות כגון מיטוכונדריה. מכיוון שהן נוצרות עם ליפידים מטוהרים ללא נוכחות של חלבונים, הן מוגדרות מבחינה ביוכימית הן בהרכבן והן בגודלן.דבר זה מאפשר פרשנויות ברורות של התוצאות, מכיוון שהחלבונים היחידים הנבדקים הם אלו שאתם מוסיפים. שיטה זו יכולה לספק תובנות מכניסטיות לגבי יכולתה של משפחת ה-BCL two לווסת את שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית. ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות הבוחנות עיצוב מחדש של ממברנות ופעילות חדירות.זה יכלול את מנגנוני הדינמיקה המיטוכונדריאלית או רעלנים המיוצרים על ידי חיידקים. עבודה במכססה (fume hood) בתאורה מינימלית. שטפו מזרק זכוכית מסוג Hamilton Gast עם כלורופורם.לאחר מכן, בבקבלת זכוכית GL בנפח 1.5 מיליליטר, שילבו את ארבעת המיליגרמים של הליפידים שהומסו בכלורופורם. כדי להסיר את הכלורופורם, החילו זרימה עדינה של גז אינרטי כמו חנקן או ארגון. לאחר שעתיים עד שלוש שעות, ודאו היווצרות שכבה דקה ויבשה של ליפידים בתחתית ובדפנות הבקבקבון בבופר LUV.הכינו תמיסות של 500 µL של צבע הפוליאניון ושל המכבה היוני CAS וערבבו אותן באמצעות וורטקס. לאחר מכן, שלבו את תמיסות ה-A NTS וה-DPX, ערבבו בוורטקס למשך דקה אחת ובצעו סוניקציה באמבט מים אולטרסוני כדי להבטיח שהתמיסות מומסות לחלוטין והומוגניות.כעת הוסיפו את תמיסת ה-A-N-T-S-D-P-X לשכבת השומן (lipid film) ואטמו את המבחנה באמצעות para film. בצעו סוניקציה לשכבת השומן למשך חמש דקות. התמיסה תיראה חלבית לאחר הסוניקציה. ודאו שהתמיסה מומסה לחלוטין, שכן מקבצים קטנים של שומנים ישפיעו לרעה על השלבים הבאים. כמו כן, בדקו את התחתית ואת דפנות המבחנה כדי לוודא שלא נותרה שכבת שומן.יש להרכיב את האקסטרודר (extruder) בהתאם להנחיות היצרן, תוך שימוש בבופר LUV להרטבת תמיכות המסנן וממברנת הפוליקרבונט. יש להדק את מארז היחידה כך שלא יתרחש אובדן נפח במהלך האקסטרוזיה, אך לא בחוזקה רבה מדי כדי לא לקרוע את הממברנה. יש לבחון את האקסטרודר עם בופר LUV כדי לוודא שאין דליפות או בעיות. כעת, יש למלא את המזרק הימני בתמיסת ליפידים ולבצע אקסטרוזיה 31 פעמים, כדי ששלפוחי ה-ELLA הגדולות יעברו דרך הממברנה לפחות פעם אחת וייאספו במזרק השמאלי. מספר פעולות האקסטרוזיה הראשונות עשויות לדרוש לחץ מעט גבוה יותר, אם התמיסה עוברת פתאום במהירות דרך הממברנה.בדוק אם הממברנה נקרעה והחלף אותה במידת הצורך. הוסף לעמודה בשלב אחד. הימנע מהפרעה לממשק החרוצים.יש להמתין עד שכל הבופר ינקז מהעמודה. כאשר הזרימה תיעצר, יש לסגור את העמודה ולמלא אותה בעדינות בבופר LUV, תוך הקפדה לא להפריע לחרוזים. לאחר מכן, יש להסיר את הפקק ולאסוף שש פרקציות של 1 mL כל אחת.ה-AUVs נשטפים בדרך כלל בשברים שלוש וארבע וניתן לזהותם לפי מראה עכור; יש למחזר את שטיפת העמודה ולאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. ה-UUVs בשבר העמודה מזוהים על ידי עלייה בפלואורסצנציה עקב נוכחות של chaps. יש לזכור להשתמש בלוחיות 96 בארות שחורות ואטומות לכל מחקרי ה-LUV.טפטפו 100 µL של בופר LUV או LUV פלוס 0.5% chaps לשש בארות. לכל אחת הוסיפו 5 µL מהפרק המתאים וערבבו עבור ה-biotech H one synergy. פתחו את תוכנת ה-gen five 2.0, הגדירו אורך גל של עירור (excitation) של 355 nm ואורך גל של פליטה (emission) של 520 nm.כוון את מתח ההגברה (Gain voltage) לעמדה 125 באופטיקה בחלק העליון ואת גובה הקריאה (read height) ל-5.5 millimeters. כעת קרא את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וזהה את הפראקציות המכילות LUV. הוצא את הפראקציות של LUV המזוהות כמטוהרות.בדיקות אלו נועדו למדוד את היכולת של חלבוני BCL two להשרות באופן ישיר חדירות של LUV, וכן לבחון את הבקרה על פעילות החדירות. יש לשלב את רכיבי הבדיקה לפי סדר ההוספה. פרטים נוספים על טיטרציות של חלבוני BS ו-bid זמינים במאמר המלווה.דגרו את התגובות ב-37 °C עבור נקודות הזמן של הבדיקה. הכניסו את הפלטה לקורא המיקרופלטה, אשר ינער את הפלטה וימדוד פלואורסצנציה כפי שהודגם קודם לכן. ניסוי זה משתמש בבקיעים (backs) המופעלים על ידי דטרגנט OG כדי ליצור ביקורת חיובית לחדירות LUV.ראוי לציין כי ריכוזי OG הנמוכים מ-0.025% אינם משפיעים ישירות על חדירות ה-LUV במקרה זה. טיפול ב-0.5% chaps משמש גם לקביעת הכמות המקסימלית של פלואורסצנציית LUV לכל בדיקה. נקודת התחלה הכרחית לחקר חדירות LUV באמצעות חלבוני משפחת BCL-2 היא קביעת הריכוזים של backs ו-bid לקידום שחרור אופטימלי.עקומות טיטראציה אלו של backs ו-bid מראות שחרור רקע מינימלי וסינרגיה אופטימלית. לחלופין, ניתן למדוד את חדירות ה-LUV באופן קינטי. קריאות אלו בוצעו מדי שתי דקות במשך 30 דקות, עם ניעור עדין של הפלטה למשך שתי שניות לפני כל קריאה.ניסוי זה קובע את השפעתה של חלבון אנטי-אפופטוטי על חדירות LUV התלויה ב-Bax וב-Bid. BCL-XL מעכב את פעילותם של Bax ו-Bid באופן תלוי מינון. בבדיקת דכייה (D repression assay), ניתן להפוך את אפקט העיכוב על ידי הוספה של חלבוני BH3 בלבד.לדוגמה, puma beta נקשר ל-BCL xl, ובכך מאפשר ל-backs ו-bid לפעול בסינרגיה ולגרום לחדירות. בניצול השליטה בטכניקה זו ליצירת וסיקולות גדולות, ניתן לבצע ניתוח יעיל ומהיר של חלבונים ממשפחת BCL two, פפטידים ומולקולות קטנות בסביבה מוגדרת ביוכימית הדומה לממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית. חשוב לציין כי בדיקה זו מאפשרת ניתוח מהיר של מאות תנאים תוך שימוש הן בנקודות קצה והן בפרמטרים קינטיים.זכרו ששני החלבונים, UUVs ו-BCL 2, רגישים מאוד לארטיפקטים המושרים על ידי דטרגנטים. השתמשו בציוד נקי ונקי מדטרגנטים כדי להבטיח תוצאות הדירות.

examining-bcl-2-family-function-with-large-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית ​​השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

נתמכת solid, נטול חלבון, כפול פוספוליפיד bilayer ממברנות (DLBM) יכולה להיהפך מורכב ודינמי, השומנים nanotube רשתות, יכול לשמש מלמטה למעלה 2D, דגמי רשתית תוך-פלזמית.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

מטרת הפרוטוקול היא למדוד באופן אמין תכונות מכניות של ממברנה של שלפוחיות ענק על ידי שאיפה מיקרופיפטה.

Obtention של ענק Unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מהדם ההיקפי ומרקמות מוצקות עם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים.

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה להערכה תמציתית של רמות סמן אוטופגוזום LC3-II בשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) על ידי immunoblotting. ניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, היווצרות אוטוליזוזום והיווצרות אומגה מצביע על התפקיד החדש של STX6 בשחרור רכבים חשמליים חיוביים ל-LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

הופעתו של מערכות MEG בגודל לילדים צעירים פותח הזדמנויות חדשות ללמוד חשוב בהתפתחות המוח. המערכת החדשה, יחד עם פרוטוקול אשר מיישרת דרישות ניסיוני עם קיבולות של ילדים, יכול לשמש כדי לחקור תהליכים קוגניטיביים והשפה, ילדים בריאים ער בגילאי 3-6.

מדידה של תפקוד המוח Neuromagnetic ב טרום בית ספר לילדים עם מג בגודל מותאם אישית

חקור אינטראקציות של חלבוני משפחת BCL-2 באמצעות מודל של שלפוחיות חד-שכבתיות גדולות (LUVs) המחקות את מיטוכונדריה. שיטה זו מאפשרת ניתוח פלואורסצנטי של חדירות ממברנה ומספקת תובנות מכניות לגבי ויסות אפופטוזה.

BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית ​​Unilamellar גדולה

גלה סרטונים נוספים

BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית Unilamellar גדולה