BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית ​​Unilamellar גדולה

מערכת מודל זו, המוגדרת ביוכימית וכוללת וסיקולות גדולות (LUVs), מדמה את ממברנת המיטוכונדריה החיצונית כדי לבחון את תפקודם של חלבוני BCL2 in vitro. ראשית, ערבבו את הליפידים וצרו שכבת ליפידים בתוך מבחנה אטומה. לאחר מכן, הכינו תמיסת LUV טרייה והמיסו את שכבת הליפידים.

בשלב הבא, השריצו את תמיסת הליפידים וטהרו את ה-Ella Les הגדולים באמצעות סינון ג'ל. השלב האחרון הוא ניתוח של ה-L UUVs כדי לבדוק עלייה בפלואורסצנציה המושרה על ידי דטרגנט. לבסוף, מערכת מודל ה-LUV משמשת להערכת התפקוד והבקרה של חלבונים חדירי ממברנה, כגון חלבון BCL two רקומביננטי.

לגישה זו, המשתמשת בוויזקולות ענקיות (large unilamellar vesicles), יש מספר יתרונות על פני מערכות קיימות כגון מיטוכונדריה. מכיוון שהן נוצרות עם ליפידים מטוהרים ללא נוכחות של חלבונים, הן מוגדרות מבחינה ביוכימית הן בהרכבן והן בגודלן.

דבר זה מאפשר פרשנויות ברורות של התוצאות, מכיוון שהחלבונים היחידים הנבדקים הם אלו שאתם מוסיפים. שיטה זו יכולה לספק תובנות מכניסטיות לגבי יכולתה של משפחת ה-BCL two לווסת את שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית. ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות הבוחנות עיצוב מחדש של ממברנות ופעילות חדירות.

זה יכלול את מנגנוני הדינמיקה המיטוכונדריאלית או רעלנים המיוצרים על ידי חיידקים. עבודה במכססה (fume hood) בתאורה מינימלית. שטפו מזרק זכוכית מסוג Hamilton Gast עם כלורופורם.

לאחר מכן, בבקבלת זכוכית GL בנפח 1.5 מיליליטר, שילבו את ארבעת המיליגרמים של הליפידים שהומסו בכלורופורם. כדי להסיר את הכלורופורם, החילו זרימה עדינה של גז אינרטי כמו חנקן או ארגון. לאחר שעתיים עד שלוש שעות, ודאו היווצרות שכבה דקה ויבשה של ליפידים בתחתית ובדפנות הבקבקבון בבופר LUV.

הכינו תמיסות של 500 µL של צבע הפוליאניון ושל המכבה היוני CAS וערבבו אותן באמצעות וורטקס. לאחר מכן, שלבו את תמיסות ה-A NTS וה-DPX, ערבבו בוורטקס למשך דקה אחת ובצעו סוניקציה באמבט מים אולטרסוני כדי להבטיח שהתמיסות מומסות לחלוטין והומוגניות.

כעת הוסיפו את תמיסת ה-A-N-T-S-D-P-X לשכבת השומן (lipid film) ואטמו את המבחנה באמצעות para film. בצעו סוניקציה לשכבת השומן למשך חמש דקות. התמיסה תיראה חלבית לאחר הסוניקציה. ודאו שהתמיסה מומסה לחלוטין, שכן מקבצים קטנים של שומנים ישפיעו לרעה על השלבים הבאים. כמו כן, בדקו את התחתית ואת דפנות המבחנה כדי לוודא שלא נותרה שכבת שומן.

יש להרכיב את האקסטרודר (extruder) בהתאם להנחיות היצרן, תוך שימוש בבופר LUV להרטבת תמיכות המסנן וממברנת הפוליקרבונט. יש להדק את מארז היחידה כך שלא יתרחש אובדן נפח במהלך האקסטרוזיה, אך לא בחוזקה רבה מדי כדי לא לקרוע את הממברנה. יש לבחון את האקסטרודר עם בופר LUV כדי לוודא שאין דליפות או בעיות. כעת, יש למלא את המזרק הימני בתמיסת ליפידים ולבצע אקסטרוזיה 31 פעמים, כדי ששלפוחי ה-ELLA הגדולות יעברו דרך הממברנה לפחות פעם אחת וייאספו במזרק השמאלי. מספר פעולות האקסטרוזיה הראשונות עשויות לדרוש לחץ מעט גבוה יותר, אם התמיסה עוברת פתאום במהירות דרך הממברנה.

בדוק אם הממברנה נקרעה והחלף אותה במידת הצורך. הוסף לעמודה בשלב אחד. הימנע מהפרעה לממשק החרוצים.

יש להמתין עד שכל הבופר ינקז מהעמודה. כאשר הזרימה תיעצר, יש לסגור את העמודה ולמלא אותה בעדינות בבופר LUV, תוך הקפדה לא להפריע לחרוזים. לאחר מכן, יש להסיר את הפקק ולאסוף שש פרקציות של 1 mL כל אחת.

ה-AUVs נשטפים בדרך כלל בשברים שלוש וארבע וניתן לזהותם לפי מראה עכור; יש למחזר את שטיפת העמודה ולאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. ה-UUVs בשבר העמודה מזוהים על ידי עלייה בפלואורסצנציה עקב נוכחות של chaps. יש לזכור להשתמש בלוחיות 96 בארות שחורות ואטומות לכל מחקרי ה-LUV.

טפטפו 100 µL של בופר LUV או LUV פלוס 0.5% chaps לשש בארות. לכל אחת הוסיפו 5 µL מהפרק המתאים וערבבו עבור ה-biotech H one synergy. פתחו את תוכנת ה-gen five 2.0, הגדירו אורך גל של עירור (excitation) של 355 nm ואורך גל של פליטה (emission) של 520 nm.

כוון את מתח ההגברה (Gain voltage) לעמדה 125 באופטיקה בחלק העליון ואת גובה הקריאה (read height) ל-5.5 millimeters. כעת קרא את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וזהה את הפראקציות המכילות LUV. הוצא את הפראקציות של LUV המזוהות כמטוהרות.

בדיקות אלו נועדו למדוד את היכולת של חלבוני BCL two להשרות באופן ישיר חדירות של LUV, וכן לבחון את הבקרה על פעילות החדירות. יש לשלב את רכיבי הבדיקה לפי סדר ההוספה. פרטים נוספים על טיטרציות של חלבוני BS ו-bid זמינים במאמר המלווה.

דגרו את התגובות ב-37 °C עבור נקודות הזמן של הבדיקה. הכניסו את הפלטה לקורא המיקרופלטה, אשר ינער את הפלטה וימדוד פלואורסצנציה כפי שהודגם קודם לכן. ניסוי זה משתמש בבקיעים (backs) המופעלים על ידי דטרגנט OG כדי ליצור ביקורת חיובית לחדירות LUV.

ראוי לציין כי ריכוזי OG הנמוכים מ-0.025% אינם משפיעים ישירות על חדירות ה-LUV במקרה זה. טיפול ב-0.5% chaps משמש גם לקביעת הכמות המקסימלית של פלואורסצנציית LUV לכל בדיקה. נקודת התחלה הכרחית לחקר חדירות LUV באמצעות חלבוני משפחת BCL-2 היא קביעת הריכוזים של backs ו-bid לקידום שחרור אופטימלי.

עקומות טיטראציה אלו של backs ו-bid מראות שחרור רקע מינימלי וסינרגיה אופטימלית. לחלופין, ניתן למדוד את חדירות ה-LUV באופן קינטי. קריאות אלו בוצעו מדי שתי דקות במשך 30 דקות, עם ניעור עדין של הפלטה למשך שתי שניות לפני כל קריאה.

ניסוי זה קובע את השפעתה של חלבון אנטי-אפופטוטי על חדירות LUV התלויה ב-Bax וב-Bid. BCL-XL מעכב את פעילותם של Bax ו-Bid באופן תלוי מינון. בבדיקת דכייה (D repression assay), ניתן להפוך את אפקט העיכוב על ידי הוספה של חלבוני BH3 בלבד.

לדוגמה, puma beta נקשר ל-BCL xl, ובכך מאפשר ל-backs ו-bid לפעול בסינרגיה ולגרום לחדירות. בניצול השליטה בטכניקה זו ליצירת וסיקולות גדולות, ניתן לבצע ניתוח יעיל ומהיר של חלבונים ממשפחת BCL two, פפטידים ומולקולות קטנות בסביבה מוגדרת ביוכימית הדומה לממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית. חשוב לציין כי בדיקה זו מאפשרת ניתוח מהיר של מאות תנאים תוך שימוש הן בנקודות קצה והן בפרמטרים קינטיים.

זכרו ששני החלבונים, UUVs ו-BCL 2, רגישים מאוד לארטיפקטים המושרים על ידי דטרגנטים. השתמשו בציוד נקי ונקי מדטרגנטים כדי להבטיח תוצאות הדירות.