ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בחלוקת הגנום הנגיפי בתאים מתחלקים. זה מושג על ידי יצירת פלסמיד שניתן לדמיין על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כאן מהונדס פלסמיד כך שיכלול חזרות טנדם של רצף אופרטור הלקטוז או LAC O.השלב השני הוא הכנסת הפלסמיד לתאים מתחלקים, ואחריו זיהום של התאים ברטרו-וירוס המקודד את מדכא הלקטוז או עין הלקטוז המאוחה לחלבון פלואורסצנטי.

חלבוני ההיתוך של מדכאי הלקטוז יקשרו באופן ספציפי את רצפי אופרטור הלקטוז בתת-הפלסמיד. התאים מנוטרים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר פלסמידים בודדים דרך מחזורי תאים מרובים. בסופו של דבר, התמונות המתקבלות מעובדות כדי לקבוע כיצד הגנום הנגיפי נשמר בתאים מתחלקים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון PCR כמותי Southern Blotting או fluorescence in situ you hybridization, הוא שטכניקה זו מאפשרת לצפות בפלסמידים בודדים במספר נקודות זמן. כדי לאפשר הדמיה של הפלסמיד על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, נעשה שימוש בטכניקות שיבוט מולקולרי סטנדרטיות כדי להכניס שבר DNA המכיל כ -250 עותקים של רצף אופרטור הלקטוז או LAC O לתוך הפלסמיד. בדוגמה זו, הפלסמיד הוא אמצע אחורי של כ-170 זוגות קילו-בסיס המכיל את כל הגנום של נגיף ההרפס הקשור לסרקומה של הכובע או KSHV ומקודד עמידות להיגרומיצין.

הכניסו את ה- LAC O המכיל DNA פלסמיד לתאי יונקים hela ו- SLK על ידי טרנספקציה בכלים של 60 מילימטר, דגרו תאים עם 10 מיקרוגרם פלסמיד מטוהר, DNA 25 מיקרוליטר, כריתת שומן, 2000 0.5 מיליליטר, Optum ו -3.5 מיליליטר. DMEM במשך ארבע שעות. שנה את המדיום ל-DMEM עם סרום בקר עוברי של 10% ואפשר לתאים להתאושש במשך 48 שעות.

לאחר מכן צלחת את התאים המועברים בצפיפות נמוכה בכלים גדולים ותרביות במשך שלושה שבועות ב-DMEM עם סרום בקר עוברי של 10% ו-300 מיקרוגרם למיליליטר היגרומיצין כדי לבחור את הפלסמיד שהוכנס, השתמש בחתיכות של טיולים סטריליים ונייר סינון ספוג כדי להעביר מושבות עמידות להיגרומיצין לכלי תרבית חדשים. מניחים את הכלים בחממה לאחר שבוע עד שבועיים כאשר שיבוטים שעברו טרנספטציה גדלו כדי למלא את ה-DNA המבודד של המנה לעיכול הגבלה וכתמים דרומיים כדי להבטיח שהפולימר של פלסמיד LAC O הוא הומוגני ובגודל הצפוי. כתם לדוגמה זה מראה שפולימר LAC O בשיבוט אחד הוא הומוגני וזהה לזה של הבקרה החיובית.

בנתיב השביעי, אם הפלסמיד לא הונדס לבטא היתוך של מדכא הלקטוז לאק עין לאק להדביק שיבוטים מתאימים עם רטרו-וירוס המקודד עין לאק מאוחה לחלבון פלואורסצנטי אדום כגון עין לק, עגבניות TD, עגבניות TD נבחרות במקום חלבונים שזוהרים קרוב יותר לירוק כדי למזער פוטוטוקסיות שתתרחש מחשיפות מרובות לאורך זמנים ארוכים. לאחר הכנסת חלבון היתוך העיניים LAC, תרבית, התאים בנוכחות 200 מיקרוגרם למיליליטר IPTG כדי לחסום את חלבוני ההיתוך מלקשור DNA. אחד ההיבטים הקריטיים ביותר בהליך זה הוא השגת שיבוטים עם עוצמת הקרינה המתאימה.

יש לסנן מספר רב של שיבוטים כדי לזהות את אלה עם תרבית פלואורסצנטית אופטימלית. התאים במשך שלושה ימים לפחות כדי לאפשר ביטוי של שיבוטי חלבון העגבניות LAC eye TD לאלה עם רמות אופטימליות של עין לק, עגבנייה TD החושפים אותות מובהקים עם רמות רקע מינימליות של חלבון היתוך לא קשור, 24 עד 48 שעות לפני הדמיית התאים המבטאים עגבניות LAC I TD צופים אותם בצלחת תחתית זכוכית של 35 מילימטר בצפיפות של פחות מ-10%. זה יאפשר לזוגות תאים להתחלק למושבות של שמונה עד 16 תאים מבלי לחפוף שעה עד שלוש שעות לפני תחילת ההדמיה.

שוטפים את הצלחת שלוש פעמים במדיום תרבית שחסר גם תרופות סלקטיביות וגם IPTG. זה שוטף תאים שאינם ברי קיימא ומאפשר לחלבוני איחוי עין לאק לקשור ציטי LAC בפלסמידים. החלף את מדיום התרבית בשני מיליליטר, DMEM עם סרום בקר עוברי של 10% ו-25 מילי-מולר היפי דוגרים למשך שעה עד שלוש שעות רגע לפני ההדמיה החלף את החלק העליון של צלחת התרבית בנייר כסף שנמתח בטבעת הרכבה לצלחת של 35 מילימטר.

כיסוי זה יעכב את אידוי מדיום התרבית, מה שיגדיל את ריכוז המלח לאורך זמן ויהרוג את התאים. מערכת ההדמיה המשמשת בניסוי זה מורכבת ממיקרוסקופ הפוך Zeiss Axio 200 M, המצויד בבמה ממונעת ומצלמת EM CCD לזיהוי רגיש של אותות. אור עירור פלורסנט מסופק על ידי ה-LED הלבן הנייטרלי של מערכת Collibra.

מערכת ההדמיה נשלטת על ידי תוכנה לרכישה אוטומטית של תמונות במרווחי זמן ארוכים עם ערימות Z מרובות. אינקובטור עליון משמש לשמירה על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה עד 10% פחמן דו חמצני בתא לח. השתמש בצווארון מחומם למטרת השמן כדי למנוע מהמטרה לשאוב.

חום מהדגימה מאפשר מספיק זמן למערכת להגיע לטמפרטורה יציבה. כדי למזער את חפצי התנועה במהלך הניסוי, מערכת ההדמיה צריכה לשבת על שולחן אוויר כדי להיות מבודדת מרעידות. כדי להתחיל בהליך להדמיית DNA מסומן השתמש בהדמיית DIC כדי להציג את התאים ולקבוע את מישור המוקד של החלק העליון והתחתון של התאים במספר שדות ראייה בכל שדה, לעבור למישור מוקד כשליש מהדרך למטה מהחלק העליון של התא, להציל את ה-x, y, Z קואורדינטות ברשימת מיקומי השלב השמורים.

כל אחד מהמיקומים השמורים הללו יהיה מרכז זאק של תמונות כדי ללכוד את התא בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, להגדיר זאק של תמונות שיבוצעו בכל מיקום שלב שמור, להגדיר מספיק פרוסות כך שהתא כולו יילכד יחד עם פרוסות נוספות מעל ומתחת למישורים שבהם נמצאים התאים. בחר גודל צעד Z של 0.35 עד 0.50 מיקרון כדי לאפשר דגימה משוערת של nyquist בממד Z. פרוסות אלו מאפשרות זיהוי מעקב אחר תנועות תאים במהלך מחזור התא ומשמשות גם בעיבוד לאחר רכישה של ערימות התמונות.

זה יביא לערימה של 40 עד 60 תמונות בהתאם לעובי התאים. הגדר ניסוי בסדרת זמן לאיסוף תמונת שדה בהיר של הזקס במרווחים של 30 דקות ותמונות פלואורסצנטיות במרווחים של 10 עד 60 דקות. אל תשתמש בהדמיית DIC במהלך הניסוי מכיוון שהיא דורשת יותר אור מאשר הדמיית שדה בהיר רגילה, שעלולה לחשוף את התאים שלא לצורך לפוטוטוקסיות במהלך ניסויים ארוכים.

התחל את הניסוי הנשלט על ידי תוכנה. ודא שהמערכת לא מופרעת בצורה במהלך הניסוי. לאחר שכל התמונות לניסוי נרכשו, סקור את התמונות עבור כל זאק ונקודת הזמן חתוך את כל האזורים המיותרים של התמונות כדי להפחית את זמן העיבוד הממוחשב.

בשלב הבא להקצות מחדש את עוצמת האות לפיקסל המקור בכל ערימת Z. השתמש באלגוריתם דה-קונבולוציה בתוכנת Axio vision המבוסס על פונקציית התפשטות הנקודה הנמדדת של מערכת ההדמיה. תוצאת הדה-קונבולוציה מוצגת כאן.

בחן את התמונות כדי לעקוב אחר שינויי העוצמה והתנועות של פלסמידים במהלך מחזור התא וחלוקת הפלסמידים לתאי בת. תמונות אלה, שנעשות באופן חישובי כדי לכלול מישורי Z מרובים שבהם שוכנים האותות השונים, מראות כי הגרעינים של תאי HELOC המבטאים עגבנייה TD של עין LAC הם פלואורסצנטיים עקב אות הלוקליזציה הגרעיני על חלבון ההיתוך, וממקמים אותו לגרעין. בהיעדר גנומים I-P-T-G-K-S-H-V, רצפי LAC O מגייסים עותקים רבים של החלבון הפלואורסצנטי ובולטים כאותות בהירים על עוצמת הרקע של הגרעין.

לעומת זאת, בנוכחות IPTG, החלבונים הפלואורסצנטיים של העין LAC נמנעים מלהיקשר לרצף ה-O החסר את הזיהוי שלו, הקרנות בעוצמה מקסימלית של זאק נרכשות של מחזור תא בחמש פעמים. נקודות בניסוי מייצג מוצגות באיור זה. הגנומים הוויראליים המתויגים פלואורסצנטית בתא הנראים בפאנל A מסונתזים במוצג בפאנל B.הגנום הנגיפי מחולק לאחר מכן לתאי בת במהלך חלוקת התא כפי שנצפה בפאנל C, D ו-E.מחזור התאים לתאי HELOC בריאים אורך כ-24 שעות, ותאי בת בדרך כלל נצמדים זה לזה וממשיכים להתחלק באותו זמן במחזור התא הבא.

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לעקוב אחר הגנום הנגיפי בתא במשך מספר דורות תוך כדי ניסיון הליך זה. חשוב לזכור לצפות במורפולוגיה של התאים בזמן הדור כדי להבטיח שהתאים בריאים לאורך כל הניסוי.