השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב ג elegans עוברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר טכניקה in vivo להדמיית דינמיקה תת-תאית בעוברים אלגנטיים בים שנחשפו לאנוקסיה באמצעות זרימת גז דרך התקנה במיקרוסקופ בעל עוצמה גבוהה. זה מושג על ידי הכנת דגימה של בעלי חיים טרנסגניים בוגרים צעירים כדי ליצור אוכלוסייה מתאימה של עוברים צעירים להדמיה. לאחר מכן, הכינו שקופיות כרית אגרוס דקות לשימוש בתא הדגירה המיקרו

לאחר מכן האלגנטיות של הים מורדמת כראוי ומכוסה בשמן פחמן הילה כדי למנוע התייבשות כאשר היא נחשפת לזרימת הגז. לבסוף, זכוכית הכיסוי העגולה עם בעלי החיים המורדמים מונחת בתא הדגירה המיקרו. לאחר מכן החדר ממוקם על במת המיקרוסקופ וממלא בגז חנקן כדי לייצר סביבה אנוקסית תוך הדמיה של השימוש בזרימת גז דרך תא מיקרו דגירה.

בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית in vivo מאפשרת סרטונים ותמונות מפורטים ברזולוציה גבוהה של עצירת מחזור התא בתגובה לאנוקסיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אימונופלואורסצנציה עקיפה, הוא שניתן לתעד שינויים תת-תאיים in vivo בזמן שבעלי חיים נחשפים לתנאים ספציפיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אנימציה מושעה הנגרמת על ידי אנוקסיה בעוברים של elegans.

ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון שמרים, תרבית תאים או עוברי חסרי חוליות או בעלי חוליות קטנים אחרים. ניתן ליישם גם תנאים נוספים כגון טמפרטורת היפראוקסיה, מתח או טיפול במולקולות קטנות. מדגימים הליך זה הם אנסטסיה גרסיה ומרי לאט, שתי סטודנטיות לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי התחל עם זן טרנסגני מתאים של C Elgan מעניין במחקר זה, הזן הטרנסגני TH 32 ישמש להמחשת כרומוזומים וצנטרוזומים כסמנים לחלוקת תאים.

צור אוכלוסייה מסונכרנת על ידי פירוק בוגרים כבידה בתמיסת היפוכלוריט והשתמש בעוברים הנותרים המלקטים בוגרים כבידה על צלחת זרעים וביצה, מטילים שעה עד שעתיים, או קוטפים L ארבעה זחלים מאוכלוסייה מעורבת על צלחת זרעים חדשה. לגדל נמטודות ב-20 מעלות צלזיוס לבגרות צעירה של GR, שייקח כ-96 שעות מרגע הבקיעה, 72 שעות מזחל L אחד, או 24 שעות לאחר ההטלה של L. מתודולוגיה זו מספקת אמצעי ליצירת אוכלוסייה של בוגרים צעירים המכילה מספר רב של עוברים צעירים, המכילים חילול הקודש וגרעינים גדולים האופטימליים להדמיית שינויים תת-תאיים ותת-גרעיניים.

כדי להקים תא לח להכיל שקופיות מוכנות, הניחו מגבת נייר לחה בתוך צלחת פטרי גדולה או פח מכוסה במכסה בגודל מספיק. הכינו 2% מותכים במים נטולי יונים על ידי חימום התערובת בכלי זכוכית באמצעות מיקרוגל או אמבט מים. המקום הבא, טיפה אחת עד שלוש טיפות של ארוס חם על מיקרוסקופ זכוכית נקי החלק מיד שקופית שנייה הפוכה בניצב על גבי טיפות הארוס, ולחץ מעט כך שהרפידה המתקבלת תהיה דקה וללא בועות אוויר.

לאחר שהארוס התקרר לאט לאט פרק את שתי שקופיות המיקרוסקופ, והשאיר את כרית הארוס שלמה באחת המגלשות. חשוב לוודא שכרית הארוס דקה מספיק כדי לא להפריע ליכולת למקד את המיקרוסקופ. מאוחר יותר. השתמש בסכין גילוח נקי כדי לעצב את כרית Aros לחנות מרובעת קטנה.

מחליק בתא הלח המוכן עד שהוא מוכן לשימוש. בעזרת אותו סכין גילוח נקי, קח בזהירות את קצה כרית הארוס והעביר אותו מהמגלשה לזכוכית כיסוי מיקרו עגולה של 25 מילימטר. הימנעות מהצטברות בועות אוויר מתחת לכיסוי העגול, זכוכית צריכה להתאים כראוי לחממת המיקרו

הוסף טיפת חומר הרדמה על כרית הארוס. בחרו חמש עד 10 תולעים והכניסו אותן לתוך טיפת ההרדמה. אפשר דקה עד שלוש דקות לתולעים להפסיק את תנועתן.

בעזרת קצה פיפטה, הוסיפו טיפה של שמן פחמן קדוש על גבי התולעים כדי למנוע מהתולעים להתייבש כאשר הגז זורם דרך החדר. לאחר מכן, חבר קצה אחד של צינור הפלסטיק הגמיש לתא. הפרד את שני חצאי חממת המיקרו הזלוף הסגורה והנח בזהירות את זכוכית הכיסוי זקופה על הטבעת התחתונה.

סגור היטב את שני צידי החדר. לאחר מכן חבר את החדר דרך צינור הפלסטיק הגמיש למיכל גז החנקן והנח אותו על במת המיקרוסקופ. בדוק אם יש נזילות על ידי הקפדה על חיבור מאובטח של הצינורות ותקעי היציאה לאורך צד החדר להדמיית עוברים.

ראשית, אתר בעלי חיים בהגדלה נמוכה יותר. לאחר מכן עבור להגדלה הגבוהה המתאימה. כדי לדמות חילול הקודש העוברי במבוגרים, השתמש בלייזר 488 ננומטר כדי לאתר את חלבון ההיתוך GFP בתאים המעניינים.

כדי לדמיין שלב ספציפי של עצירת מחזור התא, למשל, פרופזה מאוחרת, זהה חילול קודש בשלב מוקדם יותר של חלוקת התא כגון אינטרפאזה מאוחרת או פרופאזה מוקדמת. החדרו את התא בגז חנקן והמשיכו לפקח על חילול הקודש בזמן שהחנקן ממלא את החדר, והתאם את מישור המוקד לפי הצורך. בצע הדמיית זמן-lapse כדי ללכוד את התופעה הרצויה המעניינת במקרה זה.

מעצר פרופאזה ועגינה של כרומוזומים לקרום הגרעיני הפנימי. צלם תמונות אחת ל-10 שניות למשך עד 30 דקות. בדרך כלל, מעצר פרופאזה המושרה על ידי אנוקסיה מתרחש תוך 20 עד 30 דקות מתחילת זרימת גז החנקן.

כדי לתעד את ההתאוששות ממצב העצירה שנגרם על ידי אנוקסיה, כבה את הגז ואפשר לתא לחזור לנורמוקסיה תוך כדי הקלטת סדרת זמן-lapse. חידוש מחזור התא ופירוק הכרומוזומים מתרחשים בדרך כלל תוך חמש עד 20 דקות. השתמשו ב-erris image, ב-J או ב-Photoshop כדי לעבד תמונות וסרטוני וידאו ולייבא אותם ל-QuickTime לתצוגה.

בתוך העובר החשוף לאנוקסיה, כרומוזומי הפרופאזה. המגדפים יתעבו ויתייצרו עם הפריפריה הגרעינית הפנימית. תופעה המכונה עגינה של כרומוזומים עם התקדמות מחזור התא של חמצון מחדש תתחדש וכרומוזומים של פרופאזה.

חילול הקודש יעבור מהפריפריה הגרעינית ללוח המשווני המצביע על התקדמות למטאפאזה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות באמצעות בעלי חיים מבוימים כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש רק בבעלי חיים בוגרים צעירים ובריאים כדי להקדיש מספיק זמן להשלמת הניסוי ולהיות סבלניים כאשר לומדים לבחור חילול קודש מבוים כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ללכוד אירועים תת-תאיים הנגרמים על ידי אנוקסיה in vivo באמצעות עוברי GaN וזרימת גז דרך תא במיקרוסקופ בעל עוצמה גבוהה.