השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב
3 בדצמבר 2012
תאר כאן In vivo טכניקה למבני תמונת משנה הסלולר בבעלי חיים שנחשפו לחוסר חמצן באמצעות זרימת גז דרך חדר microincubation בשיתוף עם מיקרוסקופ confocal דיסקה מסתובב. שיטה זו היא פשוטה וגמישה מספיק כדי להתאים למגוון רחב של פרמטרים ניסיוניים ומערכות מודל.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתאר טכניקת in vivo להדמיית דינמיקה תת-תאית בעוברי sea elegance שנחשפו לאנוקסיה, באמצעות מערך זרימת גז תחת מיקרוסקופ בעל עוצמה גבוהה. זאת מושג על ידי הכנת דגימה של בעלי חיים טרנסגניים בוגרים וצעירים כדי לייצר אוכלוסייה מתאימה של עוברים צעירים להדמיה. לאחר מכן, יש להכין שקופיות עם רפידות agros דקות לשימוש בתא מיקרו-אינקובציה.
לאחר מכן, את ה-sea elegance הרדימו כראוי וכיסו בשמן הלוקרבון כדי למנוע התייבשות בעת החשיפה לזרימת הגז. לבסוף, הניחו את כיסוי הזכוכית העגול עם בעלי החיים המורדמים בתוך תא האינקובציה המיקרוסקופי. לאחר מכן, הניחו את התא עלבמת המיקרוסקופ ומילאו אותו בגז חנקן כדי ליצור סביבה אנוקסית במהלך הדמיה, תוך שימוש בסופו של דבר בזרימת גז דרך תא האינקובציה המיקרוסקופי.
בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית in vivo, טכניקה זו מאפשרת קבלת סרטונים ותמונות מפורטים ברזולוציה גבוהה של עצירה במחזור התא כמענה לאנוקסיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימונופלואורסצנציה עקיפה, הוא שניתן לתעד שינויים סוב-סלולריים in vivo בזמן שבעלי החיים חשופים לתנאים ספציפיים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אנימציה מושעת (suspended animation) המושרית על ידי אנוקסיה בעוברים של elegans.
ניתן ליישם זאת גם במערכות אחרות, כגון שמרים, תרביות תאים, או עוברים של חסרי חולר או בעלי חולר קטנים אחרים. ניתן להחיל גם תנאים נוספים כגון טמפרטורת היפרוקסיה, סטרס או טיפול במולקולות קטנות. את הפרוצדורה מדגימות אנסטסיה גרסיה ומרי לט, שתי סטודנטיות לתואר שני מהמעבדה שלי. התחילו עם זן טרנסגני מתאים של C. elegans; במחקר זה, ייעשה שימוש בזן הטרנסגני TH 32 כדי להציג כרומוזומים וסנטרוזומים כסמנים לחלוקת תאים.
צור אוכלוסייה מסונכרנת על ידי פירוק של בוגרים בפתרון היפוכ לוריט ושימוש בעוברים שנותרו, על ידי העברת בוגרים לפיתח זריעה והמתנה לשעה עד שעתיים להטלת ביצים, או על ידי העברת לצות בשלב L4 מאוכלוסייה מעורבת לפיתח זריעה חדש. גדל את הנמטודות בטמפרטורה של 20 degrees Celsius עד לשלב הבגרות הצעירה, דבר שייקח כ-96 שעות מהבקיעה, 72 שעות משלב לצות L1, או 24 שעות לאחר התחלכלות L4. מתודולוגיה זו מספקת אמצעי ליצירת אוכלוסייה של בוגרים צעירים המכילים מספר רב של עוברים צעירים, אשר כוללים בלסטומרים וגרעינים גדולים האופטימליים לדימוג של שינויים תת-תאיים ותת-גרעיניים.
להקמת תא לחות להחזקת סרטיות מוכנות, הניחו נייר סופג לח בתוך צלחת פטרי גדולה או מיכל המכוסה במכסה בגודל מתאים. הכינו תמיסת aros 2% מומסת במים דה-יוניזים על ידי חימום התערובת בכלי זכוכית באמצעות מיקרוגל או מקלח מים. לאחר מכן, טפטפו טיפה אחת עד שלוש של aros חם על סרטית מיקרוסקופ מזכוכית נקייה, והניחו מיד סרטית שנייה באופן הפוך ובניצב מעל טיפות ה-aros, ולחצו קלות כך שהשכבה שתיווצר תהיה דקה וללא בועות אוויר.
לאחר שה-aros התקרר באיטיות, הפר את שתי זכוכיתות המיקרוסקופ, כך שפד ה-aros יישאר שלם על אחת הזכוכיתות. חשוב לוודא שפד ה-aros דק מספיק כדי לא להפריע ליכולת המיקוד של המיקרוסקופ. לאחר מכן, השתמש בלהב תער נקי כדי לעצב את פד ה-Aros למרובע קטן.
שמרו את השקופיות בתא הלחות שהוכן עד למועד השימוש. באמצעות אותו להב תער נקי, הרימו בזהירות את קצה פד ה-aros והעבירו אותו מהשקופית אל זכוכית כיסוי מיקרוסקופית עגולה בקוטר 25 מילימטר. תוך הימנעות מהצטברות בועות אוויר מתחת לזכוכית הכיסוי העגולה, יש להכניס את הדגימה באופן מתאים לתוך המיקרו-אינקובטור.
הוסיפו טיפה של חומר הרדמה על פד aros. בחרו חמישה עד 10 תולעים והניחו אותן בתוך טיפת חומר ההרדמה. המתינו מדקה אחת עד שלוש דקות עד שהתולעים יפסיקו לנוע.
בעזרת טיפ פפטה, הוסיפו טיפה של שמן פחמני הלו (hallow carbon oil) מעל התולעים כדי למנוע את התייבשותן בעת זרימת הגז דרך התא. לאחר מכן, חברו קצה אחד של צינור הפלסטיק הגמיש לתא. הפרידו בין שני חלקי מיקרו-אינקובטור הפרפוזיה הסגור והניחו בזהירות את זכוכית הכיסוי במצב זקוף על הטבעת התחתוית.
סגרו את שני צדי התא בצורה הדוקה. לאחר מכן, חברו את התא באמצעות צינור פלסטי גמיש למיכל גז החנקן והניחו אותו על במת המיקרוסקופ. בדקו אם קיימות דליפות על ידי וידוא שהצינור ופקקי הפתחים לאורך דופן התא מחוברים היטב לצורך דימות העוברים.
ראשית, איתרו את בעלי החיים בהגדלה נמוכה. לאחר מכן, עברו להגדלה הגבוהה המתאימה. כדי לצלם blasphemers עובריים בבוגרים, השתמשו בלייזר של 488 nanometer כדי לאתר את חלבון היתוך GFP בתאים הרלוונטיים.
כדי להדגים שלב ספציפי של עיכוב במחזור התא, למשל, פרופאזה מאוחרת, זהו תא בשלב קודם של חלוקת התא, כגון אינטרפאזה מאוחרת או פרופאזה מוקדמת. בצעו פרפוזיה של התא עם גז חנקן והמשיכו לעקוב אחר התאים בעוד החנקן ממלא את התא, תוך התאמת מישור המיקוד לפי הצורך. בצעו דימות במרווחי זמן (time lapse) כדי לתעד את התופעה הרצויה במקרה זה.
עצירה בשלב הפרופאזה ועגינת כרומוזומים לממברנה הגרעינית הפנימית. צלם תמונות אחת ל-10 שניות למשך עד 30 דקות. בדרך כלל, עצירה בפרופאזה המושרית על ידי אנוקסיה מתרחשת בתוך 20 עד 30 דקות מתחילת זרימת גז החנקן.
כדי לתעד את ההתאוששות מהמצב המעוכב שנוצר עקב האנוקסיה, סגור את הגז ואפשר לתא לחזור לנורמוקסיה תוך כדי הקלטת סדרת צילומי time-lapse. חידוש מחזור התא ופירוק הכרומוזומים מתרחשים בדרך כלל בתוך חמש עד 20 דקות. השתמש ב-erris image J או ב-Photoshop לעיבוד התמונות והסרטונים, וייבא אותם ל-QuickTime לצורך התצוגה.
בעובר שנחשף לאנוקסיה, כרומוזומי הפרופאזה יתרכזו ויידבקו להיקף הגרעין הפנימי. תופעה זו מכונה קיבוע כרומוזומים (chromosome docking). עם חיזרחסנול (reoxygenation), התקדמות מחזור התא תתחדש וכרומוזומי הפרופאזה יחזרו למצבם הרגיל.
Blasphemy יעבור מהפריפריה הגרעינית לפלטה הקוטורית, דבר המעיד על התקדמות לשלב המטאפאזה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות תוך שימוש בבעלי חיים בשלבים מתאימים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש רק בבעלי חיים צעירים ובריאים כדי להקדיש מספיק זמן להשלמת הניסוי, ולהיות סבלניים בלמידה של בחירת blasphemers בשלבים מתאימים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לתעד אירועים תת-תאיים המושרים על ידי אנוקסיה in vivo באמצעות עוברים של GaN ותא זרימת גז במיקרוסקופ בעל רזולוציה גבוהה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה in vivo להדמיה של דינמיקה תת-תאית בעוברי sea elegans שנחשפו לאנוקסיה. השיטה עושה שימוש בזרימת גז דרך תא אינקובציה מיקרוסקופי בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקאלי בעל דיסקה מסתובבת בעוצמה גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- דימות תת-תאי הוא חיוני להבנת תגובות תאיות לעקה סביבתית.
- אנוקסיה עשויה להשפיע באופן משמעותי על הדינמיקה והחיוניות התאית.
- Sea elegans משמש כורגניזם מודל למחקרי ביולוגיה התפתחותית.
- טכניקות דימות ברזולוציה גבוהה הן חיוניות לצפייה בתהליכים דינמיים בדגימות חיות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לדימוי של מבנים תת-תאיים בעוברים חיים בתנאי אנוקסיה.
- שיפור ההבנה של תגובות תאיות למחסור בחמצן.
- אספקת טכניקת דימוי גמישה המתאימה למגוון הגדרות ניסיוניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תולעי elegans טרנסגניים בוגרים להפקת עוברים.
- שימוש בשקופיות עם שכבת אגר דקה בתא דגירה מיקרוסקופי.
- הרדמה של תולעי elegans באמצעות שמן הלוקרבון למניעת התייבשות.
- דימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי בעל דיסק מסתובב תחת זרימת גז חנקן ליצירת סביבה אנוקסית.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת דימות בזמן אמת של דינמיקה סוב-צלולית בעוברים.
- שמירה מוצלחת של תנאי אנוקסיה במהלך הדימות.
- הוכחה של גמישות עבור פרמטרים ניסיוניים שונים.
- אספקת תובנות לגבי השפעות האנוקסיה על תהליכים תאיים.
מסקנות
- שיטה זו מהווה כלי בעל ערך לחקר תגובות תאיות לאנוקסיה.
- ניתן להתאימה למערכות מודל ולתנאים ניסיוניים שונים.
- הממצאים תורמים להבנת הדינמיקה התת-תאית בתנאי עקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקה סוב-צלולית בעוברים חיים תחת תנאי אנוקסיה מבוקרים, ומספקת תובנות מכניסטיות לגבי מעצירה של מחזור התא המושרה על ידי עקה. באמצעות לכידה של עצירה הפיכה בשלב הפרופאזה וקיבוע כרומוזומים ב-C. elegans, היא תומכת בתיקוף של מטרות במסלולים השולטים בתרדמה מטאבולית ובחיי השהיה. גישה זו מציעה מערכת רלוונטית למחלות לבחינת מנגנוני חיש בחמצן עם ביטחון חיזוי להפחתת סיכונים בשלב הפרה-קלני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי ויזואליזציה של עצירה של מחזור התא המושרית על ידי אנוקסיה in vivo, ובכך מבהיר את הדינמיקה של המסלולים במצב של חסר בחמצן.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על שינויים סוב-צלולריים ללא ארטיפקטים של קיבוע.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור חשיפה לאנוקסיה למדדי התקדמות כמותיים של מחזור התא.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף באמצעות רפורטרים המסומנים ב-GFP לצורך הדמיה סטנדרטית וניתנת לשחזור של דינמיקת חלוקת תאים.
- תוצרי מדידה כמותיים: יצירת נתוני צילום במרווחי זמן (time-lapse) המאפשרים מדידה של תחילת העצירה, משכה וקינטיקת ההתאוששות תחת מדרגי חמצן מוגדרים.
- ניתנות להרחבת הפלטפורמה: התאמה לזרימות עבודה של סריקת תוכן גבוהה (high-content screening) עבור מולקולות קטנות או מודיפיקטורים גנטיים המשפיעים על מסלולי תגובה למעמדות (stress response).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה פגיעה כתוצאה מאיסכמיה-רפרפוזיה ומעקה היפוקסי בהקשרי התפתחות, בהלימה עם גילוי ביומרקרים תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: מגשר בין שלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית באמצעות ניטור תגובות תאיות שמורות לאנוקסיה במערכות מודל שונות.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקביעת קריטריונים של "המשך/עצירה" (go/no-go) בהתבסס על עצירה פנוטיפית הפיכה וספי רפרוזיה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת נתוני דימות של תאים חיים, המנחים מחקרים של מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציית מסלולים לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead identification).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מסלולי חישוש בחמצן באמצעות ויזואליזציה ישירה של עצירה והתאוששות של מחזור התא בעוברי עובר.
- סריקה: מספק מערכות מוכנות לבדיקה עם קריאות כמותיות של התקדמות המיטוזה, המאפשרות סריקת תרכובות למודולטורים של אנימציה מושעת.
- אנליטיקה: מספק מדידות בעלות רזולוציית זמן של משך עצירת הפרופאזה ודינמיקה של כרומוזומים, מה שמקל על ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר למחקרים פרה-קליניים על ידי מידול תגובות למצבי עקה היפוקסית הרלוונטיות לאיסכמיה, שבץ מוחי והפרעות מטבוליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימיג רב-פעמית הישירה לשמרים, עוברי חולייתנים ומערכות תרבית תאים תחת גורמי עקה מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות בקשרים המכניסטיים בין אניקסיה (anoxia) לבקרה על מחזור התא.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות זרימת גז מבוקרת ותכנון של תא סביבתי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי מתממשת זיהוי מוקדם של השפעות ציטוטוקסיות או ציטוסטטיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות המכוונות לנתיבי hypoxia-inducible factor (HIF) או לתגובות למעקה מיטוכונדריאלי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בזנים טרנסגניים, הכנת עוברים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים.
- תלוי במיקרוסקופיה קונפוקלית מסוג spinning disc, מערכות לבקרת זרימת גזים ותחזוקת תא סביבתי.
- מחייב סטנדרטיזציה של תזמון החשיפה לאנוקסיה, בקרת טמפרטורה ופרוטוקולי התאוששות בין הצוותים.
- כולל שיקולי התאמה למערכות מודל שונות, כולל שלבי התפתחות העובר ותאימות של רפורטרים.
- מוגבל בשל הצורך בתגים פלואורסצנטיים העמידים לחמצן ובפוטו-טוקסיות פוטנציאלית במהלך רכישת סרטוני time-lapse ממושכים.
