Name: השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב ג elegans עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למדו טכניקת מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיון דינמיקה תת-תאית בזיגוטות C. elegans תחת תנאי אנוקסיה. שיטה זו מאפשרת תיעוד שינויים תת-תאיים בזמן אמת במודל חי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להביע את הערכתנו לקלט והערות מחברי מעבדת הפדייה. זנים נמטודות בעבודה זו נמסרו על ידי גנטיקת Caenorhabditis המרכז, אשר ממומן על ידי NIH המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR). אנו מכירים בכך ומודים לד&quot;ר לון טרנבול לסיוע טכני במיקרוסקופיה confocal. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע (NSF-IOS, קריירה) לPAP

1. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר או להשיג המהונדס ג המתאים elegans להתאמץ עניין שימוש במתודולוגיות מהונדסות או מCaenorhabditis גנטיקת מלאי מרכז (CGC) או קולגה. במקרה זה אנו משתמשים במתח TH32 (עוגה-1 :: TBG-1 :: GFP; עוגה-1 :: GFP :: H2B) 5 לדמיין הכרומוזומים וcentrosomes כסמנים לחלוקת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור אוכלוסייה מסונכרנת באמצעות אחת מהשלוש שיטות: 1) תתפורר מבוגרים הרה בתמיסת היפוכלוריט ולהשתמש עוברים שנותרו 6, 2) לאסוף מבוגרים הרה לצלחת seeded ונותן שיגעו לעוברים 1-2 שעות, או 3) לאסוף L4 זחלים מאוכלוסייה ומהלך מעורב לצלחת seeded חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול נמטודות ב 20 ° C לבגרות הרה צעירה, שתיקח כ 96 שעות מבקיעה, 72 שעות מזחלי L1 או נשירת 24 שעתי הודעת L4. עוברים (2-20 תא) ברחם מכילים לסטומרים וגרעינים גדולים שהם אופטימליים למתארים לעצמיing שינויים תת סלולריים ותת גרעיניים, בהתאמה. מתודולוגיה זו מספקת אמצעי ליצירת אוכלוסייה של צעירים המכילים מספר שופע של עוברים מוקדמים. </li></ol> 2. הכנת מצגת וanoxia קאמרי הגדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תא לח להחזיק שקופיות שהוכנו על ידי הצבת מגבת נייר לחה בתוך צלחת פטרי גדולה או פח מכוסה במכסה בהיקף מספיק גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מותך 2% agarose בdeionized H 2 O על ידי חימום תערובת זכוכית באמבטיה באמצעות מיקרוגל או מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 1-3 טיפין של agarose החם בשקופית מיקרוסקופ זכוכית נקיה. מייד למקם את השקופית שנייה ההפוכה ניצב בראש טיפת agarose (הים), לחץ מעט כדי שהמשטח שיתקבל יהיה דק וללא בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זמן להתקרר ולפרק לאט את שתי שקופיות מיקרוסקופ עוזבים את כרית agarose שלם על אחת המגלשות. זה חשוב כדי להבטיח את כרית agarose הוא דק מספיק כדי לא interfeמחדש עם היכולת להתמקד מיקרוסקופ מאוחר יותר. יכולת לחזות מדגם תלוי גם במרחק המסוים האופטי של המטרה בשימוש, אשר יכול להשתנות בין מיקרוסקופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין גילוח נקי לעצב כרית agarose בכיכר קטנה. אחסן בתא הלח המוכן עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, תוך שימוש באותה סכין הגילוח נקי, לקחת את קצה משטח agarose ולהעביר אותו מהשקופית על coverglass מ&quot;מ מייקרו 25 עגול, הימנעות מההצטברות של בועות אוויר מתחת לכרית. Coverglass הסיבוב בחר להשתמש משתלב כראוי בmicroincubator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של חומר ההרדמה (0.5% tricaine, tetramisole 0.05% בM9 חיץ) על כרית agarose לשימוש כחומר הרדמה. פיק תולעים ומקום 5-10 לירידה של חומר הרדמה. אפשר 1-3 דקות לתולעים להפסקות תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרציונל להתבוננות עוברים בתוך הרחם הבוגר, במקום עוברים מכותרים, הוא למזער את הפוטנציאל של העובר desiccation ותנועה בגלל הזרימה של גז חנקן על פני העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף טיפת שמן halocarbon על גבי את התולעים כדי למנוע את התולעים מהתייבשות כזרם גז דרך החדר. מאז שמן halocarbon צמיג אחד יכול להשתמש בטיפ pipet או קצה תולעת לאסוף לאסוף נפט וירידה על התולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע coverglass המעגלי המכיל את התולעים מוכן, שני חצי ליידן נסגרו זלוף microincubator מופרדים, ואז coverglass הוא מונח בזהירות הזקופה לטבעת התחתונה. שני הצדדים של החדר לאחר מכן, סגורים היטב יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן התא מחובר למכל גז החנקן באמצעות צינור פלסטי גמיש ולהציב לתוך המקום המתאים בשלב מיקרוסקופ (התרשים 1C). בשלב זה הצינור וmicroincubator צריכים להיבדק בזהירות לכל דליפות על ידי הבטחת התקשרות בטוחה של הצנרת ושל תקעי היציאה בצד של החדר. אפשר אלכך התפשט בקלילות כמות קטנה של מי סבון על הצינורות לחפש בועות, שתהווינה אם דליפה היא הווה. </li></ol> 3. מיקרוסקופי באנוקסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר חיות בהגדלה נמוכה, ולאחר מכן, להעביר להגדלה המתאימה הגבוהה יותר (64x עבור יישום זה) לרקמת תאי תמונה או עניין כגון לסטומרים או ביציות עובריות במבוגרים. הפעל את ליזר ננומטר 488 כדי להציג אות ה-GFP ולאתר חלבון היתוך GFP בתא (הים) של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את המעצר בשלב מסוים של מחזור תא מעצר (prophase מאוחר למשל) לזהות blastomere בשלב מוקדם של חלוקת תא (לדוגמא interphase מאוחר או prophase מוקדם). סמנים סלולריים כמו עמדת centriole, ייזום של עיבוי כרומוזום, כרומוזום מיקום ונוכחות או עדר של מעטפת הגרעין יסייעו לזהות שלב מחזור תא (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז הקאמרי הוא perfused עם גז חנקן (99.999%N 2; &lt;2 עמודים לדקת פלט 2). במקרה זה אנו משתמשים בלחץ של 6 אטמוספרות, אולם לחץ ייתכן שיצטרך להיות מותאם ומותאם בהתאם לגודלו של כל microincubator וקוטר של צינורות בשימוש. המשך לעקוב אחר blastomere (הים) כחנקן ממלא את החדר, התאמת מטוס המוקד בהתאם לצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו, הדמית זמן לשגות החלה. הדמיה מבוצעת לכל זמן שיידרש כדי ללכוד תופעה של עניין, במקרה המעצר הזה prophase והעגינה של כרומוזומים לקרום הגרעין הפנימי. תמונות נלקחות פעם אחת בכל 10 שניות לא יותר מ 30 דקות. תדרים של לכידת תמונה והגדרות כגון רווח וכוח הליזר צריכים להיות מותאמים לפי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמן שבו העוברים מגיבים לסביבת anoxic יכול להשתנות בהתאם לשלב מחזור התא בתגובה לחשיפת חמצן בדם. בדרך כלל מעצר prophase אנוקסיה מושרה מתרחש בתוך 20-30 דקות מתחילת זרימת גז חנקן. אנו צפינו occu עצירת מחזור התא אנוקסיה המושריתrring ב&lt; 20 דקים &#39;. תמונות ניתן לקבל במסגרת זמן זו, או תמונות מסוימות יכולות להיות מבודדות מאוחר יותר מסדרת הזמן לשגות. אפשרות נוספת היא להשתמש במיקרוסקופ וידאו לדמיין מבני משנה הסלולר בעוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתעד את ההתאוששות מהמדינה נעצרה אנוקסיה המושרית, מופעל הגז מול וקאמרי הוא יורשה לחזור לnormoxia ידי דיפוזיה עת הקלטת סדרת זמן לשגות. חידוש התקדמות מחזור התא וundocking של כרומוזומים מתרחש בדרך כלל בתוך 5-20 דקות של כיבוי גז החנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לציין כי בניסויים נפרדים מחוון חוסר חמצן, resazurin, הוצב בזרימה דרך microchamber; נקבע כי התא הופך anoxic בממוצע של כ 19 דקות לאחר שזרימת גז החנקן החלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות וקטעי וידאו מעובדים באמצעות Imaris, התמונה J או פוטושופ ויובאו לQuickTime לתצוגה. </li></ol>

<ol><li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li>
<li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+animation%2C+diapause+and+quiescence%3A+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li>
<li>Hu, P. J. Dauer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+PJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-19 (2007).</li>
<li>Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+and+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Longevity and stress in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).</li>
<li>Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+cytoplasmic+dynein+heavy+chain+in+Caenorhabditis+elegans+with+fast-acting+temperature-sensitive+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22The+Nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li>
<li>Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief%2C+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li>
<li>Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPadilla%2C+PA+%22Anoxia%22">Anoxia</a>. Padilla, P. A. , InTech. (2012).</li>
<li>Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPP-16%2FNup50+function+and+CDK-1+inactivation+are+associated+with+anoxia-induced+prophase+arrest+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).</li>
<li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+animation+in+C.+elegans+requires+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li>
<li>Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+and+making+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Breaking and making of the nuclear envelope.</a> J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).</li>
<li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מחסור בחמצן ואנימצית מושעה למרות חשיפה למחסור בחמצן חמור יכולה להיות קטלנית לאורגניזמים מסוימים, כמה אורגניזמים מסוגלים לשרוד חשיפה לחמצן בדם. במקרה של ג elegans, הישרדות חשיפת אנוקסיה תלויה על במה ותגובה לאנוקסיה התפתחותית היא כניסה למצב של חיות מושהות הפיך שבו מספר התהליכים ביולוגיים נצפים הם נעצרו. חלוקת תאים, התפתחות, תנועה, אכילה ורביית תהליכים ייפסקו עד חמצן מחדש לסביבת 7,9. התקדמות במחזור ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים / ציוד </td><td></td><td></td><td> הרכב </td></tr><tr><td> פתרון hypochlorite </td><td></td><td></td><td> 0.7 גרם KOH, המ&quot;ל NaOCl 12 5%, מביא ל50 מ&quot;ל עם DDH 2 0 </td></tr><tr><td> M9 חיץ </td><td></td><td></td><td> 3 גרם KH 2 PO 4, 11 גרם Na 2 4 HPO, 5 גרם NaCl, 1 המ&quot;ל (1 M) 4 MgSO לL DDH 2 O 1 </td></tr><tr><td> שקופיות מיקרוסקופ זכוכית </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 מ&quot;מ &quot;x1&quot; x1.0 </td></tr><tr><td> סיבוב המייקר coverglass </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 72223-01 </td><td> קוטר 25 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> שמן Halocarbon 700 </td><td> סיגמא </td><td> H8898-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> חומר מרדים </td><td></td><td></td><td> 0.5% tricAine, tetramisole 0.05% </td></tr><tr><td> ליידן הסגורה זלוף Microincubator </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td> חנקן UHP </td><td> Calgaz (Liquide אוויר) </td><td></td><td> &gt; 99.9990% N 2 &lt;2 O 2 עמודים לדקה </td></tr><tr><td> צינורות פלסטיק </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> .062 &quot;מזהה x 0.125&quot; OD </td></tr><tr><td> ספינינג confocal מיקרוסקופ דיסק </td><td> מערכות McBain </td><td></td><td> Zeiss התהפך מיקרוסקופ מערכת אופטית, epifluorescence תאורה, סורק CSU-10 Yokogawa confocal, מצלמת CCD מכפיל אלקטרוני Hamamatsu. </td></tr></tbody></table>

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

elegans Caenorhabdits כבר נעשה שימוש נרחב בחקר עמידות למצבי עקה, שהקלה על ידי השקיפות של השלבים הבוגרים ועובר, כמו גם על ידי הזמינות של מוטציות גנטיות וזנים מהונדסים המבטאים את מספר עצום של חלבוני היתוך 1-4. בנוסף, תהליכים דינמיים כגון חלוקת תא ניתן לצפות באמצעות חלבונים שכותרתו fluorescently כתב. המחקר של מיטוזה ניתן מתאפשר באמצעות השימוש בניסויי זמן לשגות במערכות שונות, כוללים אורגניזמים שלמים, ולכן מוקדם ג עובר elegans גם מתאים למחקר זה. מוצג כאן היא טכניקה שבאמצעותה בתחום הדמית vivo של מבנים תת סלולריים בתגובה לanoxic (99.999% N 2; &lt;2 עמודים לדקת פלט 2) לחץ אפשרי באמצעות זרימת גז פשוט ועד התקנה במיקרוסקופ רב עצמה. קאמרי microincubation משמש יחד עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובבכדי ליצור סביבה מבוקרת שבה ניתן הדמית בעלי חיים בחי. שימוש GFP מתויג-טובולין גמא והיסטון, הדינמיקה ומעצרו של חלוקת תא ניתן לנטר לפני, במהלך ולאחר החשיפה לסביבת חמצן מקופח-. התוצאות של טכניקה זו הן ברזולוציה גבוה, קטעי וידאו ותמונות מפורטים של מבנים תאיים בתוך לסטומרים של עוברים שנחשפו למחסור בחמצן.

עוברי ג elegans החשופים למחסור בחמצן קשה (אנוקסיה) מסוגלים לשרוד במעצר תהליכים ביולוגיים הכולל פיתוח וחלוקת תא 7. מעצר אנוקסיה המושרית של חלוקת תא יכול להיות במעקב, ברמת משנה הסלולר, באמצעות תא microincubation בשיתוף עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב כדי ליצור סביבה מבוקרת שבה ניתן הדמית חיות בחי (איור 1). מבנים תאיים של עניין ניתן לפקח בעובר נחשף לגז סביבות שונות, במקרה זה השתמשנו GFP-tagged טובולין גמא וH2B היס...

תאר כאן<em&gt; In vivo</em&gt; טכניקה למבני תמונת משנה הסלולר בבעלי חיים שנחשפו לחוסר חמצן באמצעות זרימת גז דרך חדר microincubation בשיתוף עם מיקרוסקופ confocal דיסקה מסתובב. שיטה זו היא פשוטה וגמישה מספיק כדי להתאים למגוון רחב של פרמטרים ניסיוניים ומערכות מודל.

C. elegans שימש באופן נרחב במחקר של עמידות לעקה, דבר המואפשר הודות לשקיפות של שלבי הבוגר והעובר...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתאר טכניקת in vivo להדמיית דינמיקה תת-תאית בעוברי sea elegance שנחשפו לאנוקסיה, באמצעות מערך זרימת גז תחת מיקרוסקופ בעל עוצמה גבוהה. זאת מושג על ידי הכנת דגימה של בעלי חיים טרנסגניים בוגרים וצעירים כדי לייצר אוכלוסייה מתאימה של עוברים צעירים להדמיה. לאחר מכן, יש להכין שקופיות עם רפידות agros דקות לשימוש בתא מיקרו-אינקובציה.לאחר מכן, את ה-sea elegance הרדימו כראוי וכיסו בשמן הלוקרבון כדי למנוע התייבשות בעת החשיפה לזרימת הגז. לבסוף, הניחו את כיסוי הזכוכית העגול עם בעלי החיים המורדמים בתוך תא האינקובציה המיקרוסקופי. לאחר מכן, הניחו את התא עלבמת המיקרוסקופ ומילאו אותו בגז חנקן כדי ליצור סביבה אנוקסית במהלך הדמיה, תוך שימוש בסופו של דבר בזרימת גז דרך תא האינקובציה המיקרוסקופי.בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית in vivo, טכניקה זו מאפשרת קבלת סרטונים ותמונות מפורטים ברזולוציה גבוהה של עצירה במחזור התא כמענה לאנוקסיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימונופלואורסצנציה עקיפה, הוא שניתן לתעד שינויים סוב-סלולריים in vivo בזמן שבעלי החיים חשופים לתנאים ספציפיים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אנימציה מושעת (suspended animation) המושרית על ידי אנוקסיה בעוברים של elegans.ניתן ליישם זאת גם במערכות אחרות, כגון שמרים, תרביות תאים, או עוברים של חסרי חולר או בעלי חולר קטנים אחרים. ניתן להחיל גם תנאים נוספים כגון טמפרטורת היפרוקסיה, סטרס או טיפול במולקולות קטנות. את הפרוצדורה מדגימות אנסטסיה גרסיה ומרי לט, שתי סטודנטיות לתואר שני מהמעבדה שלי. התחילו עם זן טרנסגני מתאים של C. elegans; במחקר זה, ייעשה שימוש בזן הטרנסגני TH 32 כדי להציג כרומוזומים וסנטרוזומים כסמנים לחלוקת תאים.צור אוכלוסייה מסונכרנת על ידי פירוק של בוגרים בפתרון היפוכ לוריט ושימוש בעוברים שנותרו, על ידי העברת בוגרים לפיתח זריעה והמתנה לשעה עד שעתיים להטלת ביצים, או על ידי העברת לצות בשלב L4 מאוכלוסייה מעורבת לפיתח זריעה חדש. גדל את הנמטודות בטמפרטורה של 20 degrees Celsius עד לשלב הבגרות הצעירה, דבר שייקח כ-96 שעות מהבקיעה, 72 שעות משלב לצות L1, או 24 שעות לאחר התחלכלות L4. מתודולוגיה זו מספקת אמצעי ליצירת אוכלוסייה של בוגרים צעירים המכילים מספר רב של עוברים צעירים, אשר כוללים בלסטומרים וגרעינים גדולים האופטימליים לדימוג של שינויים תת-תאיים ותת-גרעיניים.להקמת תא לחות להחזקת סרטיות מוכנות, הניחו נייר סופג לח בתוך צלחת פטרי גדולה או מיכל המכוסה במכסה בגודל מתאים. הכינו תמיסת aros 2% מומסת במים דה-יוניזים על ידי חימום התערובת בכלי זכוכית באמצעות מיקרוגל או מקלח מים. לאחר מכן, טפטפו טיפה אחת עד שלוש של aros חם על סרטית מיקרוסקופ מזכוכית נקייה, והניחו מיד סרטית שנייה באופן הפוך ובניצב מעל טיפות ה-aros, ולחצו קלות כך שהשכבה שתיווצר תהיה דקה וללא בועות אוויר.לאחר שה-aros התקרר באיטיות, הפר את שתי זכוכיתות המיקרוסקופ, כך שפד ה-aros יישאר שלם על אחת הזכוכיתות. חשוב לוודא שפד ה-aros דק מספיק כדי לא להפריע ליכולת המיקוד של המיקרוסקופ. לאחר מכן, השתמש בלהב תער נקי כדי לעצב את פד ה-Aros למרובע קטן.שמרו את השקופיות בתא הלחות שהוכן עד למועד השימוש. באמצעות אותו להב תער נקי, הרימו בזהירות את קצה פד ה-aros והעבירו אותו מהשקופית אל זכוכית כיסוי מיקרוסקופית עגולה בקוטר 25 מילימטר. תוך הימנעות מהצטברות בועות אוויר מתחת לזכוכית הכיסוי העגולה, יש להכניס את הדגימה באופן מתאים לתוך המיקרו-אינקובטור.הוסיפו טיפה של חומר הרדמה על פד aros. בחרו חמישה עד 10 תולעים והניחו אותן בתוך טיפת חומר ההרדמה. המתינו מדקה אחת עד שלוש דקות עד שהתולעים יפסיקו לנוע.בעזרת טיפ פפטה, הוסיפו טיפה של שמן פחמני הלו (hallow carbon oil) מעל התולעים כדי למנוע את התייבשותן בעת זרימת הגז דרך התא. לאחר מכן, חברו קצה אחד של צינור הפלסטיק הגמיש לתא. הפרידו בין שני חלקי מיקרו-אינקובטור הפרפוזיה הסגור והניחו בזהירות את זכוכית הכיסוי במצב זקוף על הטבעת התחתוית.סגרו את שני צדי התא בצורה הדוקה. לאחר מכן, חברו את התא באמצעות צינור פלסטי גמיש למיכל גז החנקן והניחו אותו על במת המיקרוסקופ. בדקו אם קיימות דליפות על ידי וידוא שהצינור ופקקי הפתחים לאורך דופן התא מחוברים היטב לצורך דימות העוברים.ראשית, איתרו את בעלי החיים בהגדלה נמוכה. לאחר מכן, עברו להגדלה הגבוהה המתאימה. כדי לצלם blasphemers עובריים בבוגרים, השתמשו בלייזר של 488 nanometer כדי לאתר את חלבון היתוך GFP בתאים הרלוונטיים.כדי להדגים שלב ספציפי של עיכוב במחזור התא, למשל, פרופאזה מאוחרת, זהו תא בשלב קודם של חלוקת התא, כגון אינטרפאזה מאוחרת או פרופאזה מוקדמת. בצעו פרפוזיה של התא עם גז חנקן והמשיכו לעקוב אחר התאים בעוד החנקן ממלא את התא, תוך התאמת מישור המיקוד לפי הצורך. בצעו דימות במרווחי זמן (time lapse) כדי לתעד את התופעה הרצויה במקרה זה.עצירה בשלב הפרופאזה ועגינת כרומוזומים לממברנה הגרעינית הפנימית. צלם תמונות אחת ל-10 שניות למשך עד 30 דקות. בדרך כלל, עצירה בפרופאזה המושרית על ידי אנוקסיה מתרחשת בתוך 20 עד 30 דקות מתחילת זרימת גז החנקן.כדי לתעד את ההתאוששות מהמצב המעוכב שנוצר עקב האנוקסיה, סגור את הגז ואפשר לתא לחזור לנורמוקסיה תוך כדי הקלטת סדרת צילומי time-lapse. חידוש מחזור התא ופירוק הכרומוזומים מתרחשים בדרך כלל בתוך חמש עד 20 דקות. השתמש ב-erris image J או ב-Photoshop לעיבוד התמונות והסרטונים, וייבא אותם ל-QuickTime לצורך התצוגה.בעובר שנחשף לאנוקסיה, כרומוזומי הפרופאזה יתרכזו ויידבקו להיקף הגרעין הפנימי. תופעה זו מכונה קיבוע כרומוזומים (chromosome docking). עם חיזרחסנול (reoxygenation), התקדמות מחזור התא תתחדש וכרומוזומי הפרופאזה יחזרו למצבם הרגיל.Blasphemy יעבור מהפריפריה הגרעינית לפלטה הקוטורית, דבר המעיד על התקדמות לשלב המטאפאזה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות תוך שימוש בבעלי חיים בשלבים מתאימים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש רק בבעלי חיים צעירים ובריאים כדי להקדיש מספיק זמן להשלמת הניסוי, ולהיות סבלניים בלמידה של בחירת blasphemers בשלבים מתאימים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לתעד אירועים תת-תאיים המושרים על ידי אנוקסיה in vivo באמצעות עוברים של GaN ותא זרימת גז במיקרוסקופ בעל רזולוציה גבוהה.

use-time-lapse-microscopy-to-visualize-anoxia-induced-suspended

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

מאמר זה מתאר טכניקה להדמיה של האירועים הראשונים של העובר בתוך...

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

מכשיר microfluidic פשוט פותח כדי לבצע הרדמה...

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

פרוטוקול מתואר המשתמש אנוקסיה / רעב בג elegans למודל איסכמיה / reperfusion. תוצאות תפקודיות כוללות תמותה מוגברת, ליקויים גלויים בתהליכים עצביים-GFP שכותרתו, ותגובות התנהגותיות לקויים הדורשות תפקוד עצבי.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

כאן אנו מפרטים פרוטוקולים שתוכננו במיוחד לניטור פגמים מורפוגניים המתרחשים בשלבים מוקדמים ומאוחרים של התארכות עוברית של הנמטודה Caenorhabditis elegans. בסופו של דבר, פרוטוקולים אלה נועדו לזהות גנים המווסתים את השלבים הללו ולאפיין את הדרישות הדיפרנציאליות שלהם לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים וכלים להמחשת סידן במהלך הפריה ועובריות מוקדמות באמצעות מדווח סידן מקודד גנטית המתבטא בקו הנבט של נמטודת המודל C. elegans.

הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans

למדו טכניקת מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיון דינמיקה תת-תאית בזיגוטות C. elegans תחת תנאי אנוקסיה. שיטה זו מאפשרת תיעוד שינויים תת-תאיים בזמן אמת במודל חי.

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב

גלה סרטונים נוספים