Name: היגיון, שלבים ניסיוניים, והפוטנציאל של יוסינתזה מוצרים הטבעי Heterologous מציע אריתרומיצין האנטיביוטי הקומפלקס הופק באמצעות א coli (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למד את שיטת הביוסינתזה ההטרולוגית של אריתרומיצין A ב-E. coli. חקור את העברת הגנים, שחזור המסלול הביוסינתטי ובדיקת הפעילות האנטיביוטית נגד Bacillus subtilis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים NIH (AI074224 וGM085323) וNSF (0712019 ו0924699) למימון לתמיכה בפרויקטים המיועדים לביוסינתזה Heterologous.

הטקסט שלהלן הוא ספציפי לאריתרומיצין אנטיביוטיקה, אך השלבים מתוכננים להיות באופן כללי החלים על מוצרים טבעיים אחרים כמועמדים לביוסינתזה Heterologous. 1. אריתרומיצין העברת צביר גנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> primers PCR עיצוב כדי להגביר את כל הגנים הקשורים באריתרומיצין מקבץ בתוך ס כרומוזום erythraea. צעד זה הוא ספציפי למועמדים האלה טבעיים המוצר שהרצפים גנטיים כבר נקבעו. לחלופין, את הגנים הנדרשים עשויים להיות מסונתזים (דרך כמה אפשרויות של ספקים מסחריות) עם היתרון שהגנים המסונתזים חדש יהיו מיועדים לשימוש אופטימלי בקודון א &#39;החדשה מארח coli. אם סינתזת דנ&quot;א הוא רדף, אתגר נוכחי הוא יצירת גני megasynthase אשר עשוי יעלו על 10 ק&quot;ג באורך. מבחינה טכנית, סינתזה יכולה להיות מושלמת, אבל זה מאתגר ויקר. זה צפוי כי improvem המתמידents בטכנולוגיית סינתזת גן יעסוק מגרעות נוכחיות ונוסף לאמת גישה זו למתן חומר Heterologous גנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע באמצעות PCR ס המוכן טרי הדנ&quot;א הגנומי erythraea כתבנית. ה-DNA הכרומוזומלי עשויה להיות מוכנה מתרבויות של ס erythraea או ממניות קפוא של החיידק (איור 3) 25. תגובות PCR עשויות להפיק תועלת מתוספת של DMSO (4 μl ב 50 תגובות μl) לחשבון לתכולה גבוהה G+ C ביעד ס גני erythraea. כל גן מוגבר צריך להיות רצף כדי לאשר שהגן המלא אוחזרה וכי לא מוטציות שהוכנסו בתהליך ה-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דרך לעכל הגבלה וקשירה, הכנס כל אחד מהגנים המבודדים לוקטורי ביטוי שנועדו עבור E. coli (איור 3). זה הוא שיזם עיצוב אתרי הגבלה בתוך primers PCR כדי לאפשר עיכול וקשירה לאקס מתאיםוקטורי דיכאון (למשל נכלל באיור 3). יש לנו להשתמש גם pET21 וpET28 וקטורים. PET28 הווקטור מאפשר הכללת רצף המנהיג 5 &#39;שסייע לביטוי גנים באריתרומיצין מקרה. אשר ביטוי גני הפרט באמצעות RT-PCR, ניתוח SDS-PAGE (באמצעות שברי חלבון מסיסים), או מבחנים פנוטיפי נוחים (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות operons המבוסס על גנים הביעו בהצלחה מפלסמידים ביטוי בודדים (איור 3). אנחנו השתמשנו באופן מסורתי בשילובים של אנזימי הגבלה תואם מלוכדים (כמו SPE אני Xba אני ו) 24 ברצף להמרה לגני operons, עם זאת, האתרים שנבחרו להגבלת בניית אופרון אסור מתגוררים בתוך (או יש להסיר מן) המבודדים רצפי גנים (נושא שיכול להימנע אם סינתזת גן משמשת). צעד זה מאחד 20 אריתרומיצין A גנים לפני E. coli transformation. נכון לעכשיו, יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי לכלול עד 20 ק&quot;ג של דנ&quot;א זר לתוך וקטור PET סטנדרטי (שני גנים של ~ 10 ק&quot;ג כל אחת). יתר על כן, יש לנו להשתמש בגישה זו כדי ליצור operons המכיל 9 גנים. לא ידוע בדיוק כמה DNA או כמה גנים יכול להיות משולב בפלסמידים חיית מחמד מסוג, עם זאת, את המדדים שהוזכרו לעיל מספקים התייחסות למערכות מורכבות כמו מסלול biosynthetic אריתרומיצין. לבסוף, סטנדרטי בשלבי קשירת מבחנה וצעדי שינוי מוצלחים שלאחר מכן הופכים לקשה יותר ויותר כאופרון ומגדילת הגודל פלסמיד. טמפרטורת קשירה (12-22 מעלות) וזמן (3-24 שעות) הן מגוונים והפיכת אלקטרו משמשת כדי לסייע בתהליך הפקת פלסמיד מבני קבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את פלסמידים biosynthetic החדש תוכננו לE. coli להתאמץ BAP1 באמצעות שינוי-אלקטרו (איור 5). ההליך עשוי להיות הניסיון עם פלסמידים הציג שני ברצף או בשיתוףmbination. כאשר הפיכת גודל מסוגל או פלסמידים רבים, יש לנו להשתמש באופן מסורתי, שינוי אלקטרו (בניגוד לשינוי כימי). ברגע ששינה, צלחת התאים במדיום LB מוצק המכיל טטרציקלין (5 מ&quot;ג / ליטר), carbenicillin (100 מ&quot;ג / ליטר), kanamycin (50 מ&quot;ג / הליטר), סטרפטומיצין (50 מ&quot;ג / ליטר), וapramycin (50 מ&quot;ג / ליטר ) כדי לבחור עבור תחזוקת פלסמיד. זה חריג מאוד להשתמש 6 אנטיביוטיקה לאחר שינוי בחירה שונה של א &#39; תא חיידק, אבל זה פשוט משקף את המספר הכולל של פלסמידים הדרושים כדי לאפשר אריתרומיצין הסופי יוסינתזה. אמנם אפשרי, הגישה תגביל את יכולות ייצור של התרכובת הפעם culturing החל (ראה להלן). </li></ol> 2. א כינון biosynthetic coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BAP1 המתח תוכנן כדי לספק את המצעים הדרושים לביוסינתזה ולפרסם-translationally לשנות megasynthase B deoxyerythronolide. גנים בודדים של erythromycin מסלול נבדק על ביטוי גנים ואוחדה operons לתוך פלסמידים ביטוי. קטע זה מוקדש לתרבות לבדיקת תנאים לפעילות מתואמת של אריתרומיצין מלא מסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3 מושבות נפרדות של BAP1 הפך טרי ולחסן 1.5 תרבויות מיליליטר LB המכילות את אנטיביוטיקת בחירת פלסמיד הדרושה (באותם ריכוזים שצוין לעיל כדי לבחור לtransformants על מדיום מוצק), איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG: 100 מיקרומטר ) וarabinose (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) כדי לגרום לביטוי גנים, ונתרן 20 מ&quot;מ פרופיונאט לתמוך היווצרות מבשר biosynthetic תאית. ברגע שייצור אושר, תרבויות גדולות יותר עשויות להתבצע בניסיון להרחיב ולהגדיל titers המוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים ב22 מעלות צלזיוס ו 250 סל&quot;ד עבור 24-48 שעות. במקרה זה, בחירת אנטיביוטיקה מבטיחה כי פלסמידים הנדרשים נשמרים בשלבים המוקדמים של התרבות התאית. עם זאת, פלסמידזה עלול ללכת לאיבוד בקלות כמו רמות הבחירה אנטיביוטיות לשנות במהלך תקופת culturing. זה עלול להוביל לחוסר יציבות פלסמיד (כלומר, הפסד של פלסמידים אחד או יותר במהלך התרבות), אשר היו אז להגביל את יכולת ייצור. הבעיה מחריפה כאשר פלסמידים שאינם תואמים משמשים להציג אשכול גני Heterologous מלא. כזה הוא המקרה לאריתרומיצין מתחם (איור 5) ויהיה צורך לתקן באמת שייצור המתחם מE. coli. עם זאת, לצורך הדגמת ייצור ראשוני, פגמי עיצוב כאלה נסבלים למען הקמת ההיתכנות של גישת Heterologous מתוכנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את התרבויות על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 10000 באפנדורף microfuge. הסר את supernatant ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של אריתרומיצין, חוסר ייצור מתחם היה ממוען על ידי הכללת GroES / EL chaperonin (באמצעות pGro7במיוחד כדי לענות חוסר הפעילות של אנזימים לאחר הביטוי) וההכללה של עותקים של גנים נוספים (לגנים אלה חשודים בביטוי / פעילות חלש). אסטרטגיות דומות עשויות להיות נחוצות במאמצים אחרים Heterologous טבעיים מוצר ייצור. </li></ol> 3. ניתוח מוצר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר ולכמת אריתרומיצין היווצרות, להזריק supernatant התרבות על LC-MS מערכת (6 איור). אריתרומיצין הזמין מסחרי שמש לייצור ולאשר כסטנדרט בכימות. במקרים ללא סטנדרטים מסחריים זמינים, ניתוח LC-MS ידרוש אפיון כימי נוסף על ידי NMR וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה ייצור בין 3 מושבות / תרבויות מBAP1 טרנספורמציה. בחר את המפיק הגבוה ביותר ולהכין מלאי גליצרול ממקור המושבה. צעד זה יכול להיעשות במקביל לתרבויות הייצור של סעיף פרוטוקול2 באמצעות חלק קטן מהתרבויות להכין מניות גליצרול. אחסן את מניית גליצרול ב° C מקפיא -80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש אשרו מניות תא, הגבוהות ביותר לייצור, מתחיל תרבות ייצור נפרדת ולחלץ את supernatant הסופי עם נפח 2x אתיל יצטט. השתמש במערכת אידוי ואקום לייבוש התמצית וresuspend במתנול μl 100. להעביר את התמצית לדיסק מסנן סטרילי (~ קוטר 1/4 אינץ&#39;) ולאפשר את הדיסק לייבוש. בנפרד, התרבות ב &#39; subtillis בנוזל LB בן הלילה. הוסף 20 μl של B. subtilis תרבות עד 20 מ&quot;ל של נוזל אגר LB ב 45 ° C. הצלחת אגר ולאפשר לביסוס. הכנס את הדיסק של המסנן בצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס (איור 7). לחלופין, ניתן להוסיף תמצית לתרבויות נוזליות בתוך צלחת 96 היטב כדי לכמת את הפעילות באמצעות קורא צלחת (איור 7). </li></ol>

<ol><li>Adrio, J. L., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+improvement+of+processes+yielding+microbial+products%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic improvement of processes yielding microbial products.</a> FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).</li>
<li>Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+an+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea+for+stable+expression+of+the+Vitreoscilla+haemoglobin+gene+%28vhb%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb).</a> Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modulation+of+the+overexpression+of+tailoring+genes+eryK+and+eryG+leading+to+the+improvement+of+erythromycin+A+purity+and+production+in+Saccharopolyspora+erythraea+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).</li>
<li>McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Ilotycin%2C%22+a+new+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiot+%26+Chemother%22%5BJournal%5D)">"Ilotycin," a new antibiotic.</a> Antibiot & Chemother. 2, 281-284 (1952).</li>
<li>Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+erythromycin+production+in+a+genetically+engineered+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea.</a> Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).</li>
<li>Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+uptake+rate+optimization+with+nitrogen+regulation+for+erythromycin+production+and+scale-up+from+50+L+to+372+m3+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale.</a> Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).</li>
<li>Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+options+for+the+heterologous+production+of+complex+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">Methods and options for the heterologous production of complex natural products.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).</li>
<li>Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusually+large+multifunctional+polypeptide+in+the+erythromycin-producing+polyketide+synthase+of+Saccharopolyspora+erythraea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.</a> Nature. 348, 176-178 (1990).</li>
<li>Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+of+genes+required+for+complex+polyketide+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis.</a> Science. 252, 675-679 (1991).</li>
<li>Salah-Bey, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+for+the+elucidation+of+deoxysugar+biosynthesis+in+the+erythromycin+producer+Saccharopolyspora+erythraea%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea.</a> Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).</li>
<li>Summers, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+and+mutagenesis+of+genes+from+the+erythromycin+biosynthetic+gene+cluster+of+Saccharopolyspora+erythraea+that+are+involved+in+L-mycarose+and+D-desosamine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production.</a> Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).</li>
<li>Corre, C., Challis, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+natural+product+biosynthetic+chemistry+discovered+by+genome+mining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).</li>
<li>McAlpine, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+understanding+and+use+of+the+genomic+base+of+microbial+secondary+metabolite+biosynthesis+for+the+discovery+of+new+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Prod%22%5BJournal%5D)">Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products.</a> J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).</li>
<li>Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+basis+for+natural+product+biosynthetic+diversity+in+the+actinomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).</li>
<li>Oliynyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+erythromycin-producing+bacterium+Saccharopolyspora+erythraea+NRRL23338%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338.</a> Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).</li>
<li>Wilkinson, B., Micklefield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+and+engineering+natural-product+biosynthetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).</li>
<li>Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+and+exploiting+intermodular+communication+in+polyketide+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases.</a> Science. 284, 482-485 (1999).</li>
<li>Quadri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Sfp%2C+a+Bacillus+subtilis+phosphopantetheinyl+transferase+for+peptidyl+carrier+protein+domains+in+peptide+synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases.</a> Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).</li>
<li>Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+complex+polyketides+in+a+metabolically+engineered+strain+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli.</a> Science. 291, 1790-1792 (2001).</li>
<li>Lee, H. Y., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay-guided+evolution+of+glycosylated+macrolide+antibiotics+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli.</a> PLoS Biol. 5, e45(2007).</li>
<li>Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+potent+antibacterial+polyketide+erythromycin+C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).</li>
<li>Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+engineered+Escherichia+coli+for+efficient+production+of+glycosylated+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products.</a> Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).</li>
<li>Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+E.+coli+erythromycin+a+production+through+the+application+of+metabolic+and+bioprocess+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering.</a> Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).</li>
<li>Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+biosynthesis+of+erythromycin+A+and+designed+analogs+using+E.+coli+as+a+heterologous+host%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host.</a> Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).</li>
<li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKieser%2C+T+%22Practical+Streptomyces+Genetics%22">Practical Streptomyces Genetics</a>. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

צעדים קריטיים ביוסינתזה Heterologous הם נתקלו בכל אחת משלוש הנקודות פרוצדורליים בתהליך: 1) העברה גנטית; 2) כינון מחדש biosynthetic; ו3) ניתוח מוצרים. בעיה בכל שלב תהיה לשבש את המטרה הסופית של הקמת ביוסינתזה Heterologous. אולי היבט המאתגר ביותר של התהליך הוא הקמת ביוסינתזה משוחזרת, מאז זה נדרש לחלוטין כדי לאפשר ניתוח מוצלח. עם זאת, כינון מחדש תלוי בעיצוב והעברה מדוקדקים של החומר האחראי לביוסינתזה סופו של דבר הגנטי. כמו כן, הוקם, שיטות אנליטיות רגישות (כמו LC-MS) יכולות לזהות רמות כ...

אריתרומיצין הוא אנטיביוטיקת polyketide מיוצרת על ידי חיידק האדמה Saccharopolyspora erythraea גראם החיובי, והפקה נוכחית כבר השתפרה באופן הדרגתי ל/ ~ 10 ליטר גרם במשך עשרות שנים של mutagenesis המסורתי ופרוטוקולי סינון ולאחרונה באמצעות תוכניות ייעול תהליך 1-6. אסטרטגיות mutagenesis והקרנה שכיחות בפיתוח מוצרים טבעי לאנטיביוטיקה כתוצאה מקשיים בculturing ו / או גנטי מניפולצית מארחי ייצור מקומיים ובגלל הפעילות אנטיביוטית הזמינה או פנוטיפים צמיחה משופרים כדי לסייע בחירה. במקרה של אריתרומיצין, ש &#39; erythraea מוגבל על ידי פרופיל צמיחה איטי וחוסר טכניקות מניפולציה גנטיות ישירות יותר (יחסית לאורגניזמים כמו E. coli), ובכך, פוגע שיפורים מהירים בייצור וביוסינתזה של נגזרים חדשים. לאחר שזיהה את בעיות ייצור ונעול diversificatiעל אפשרויות עם תרכובות כמו אריתרומיצין, קהילת המחקר החלה לרדוף את הרעיון של ביוסינתזה Heterologous (איור 1) 7. מאמצים אלה עלו בקנה אחד עם מידע רצף זמין לאריתרומיצין אשכול גנים 8-11. יודגש כי מספר אשכולות רצף מורכב טבעיים מוצר גן התרחב מאוד 12-16, מתן התמריץ להמשך המאמצים ביוסינתזה Heterologous לגשת פוטנציאל מרפא מקודד. כדי לעשות זאת, כינון מחדש Heterologous דורש שמארח החדש לענות על הצרכים של מסלול biosynthetic הספציפי. א coli מספק נוחות טכנית, סט רחב של טכניקות המשתרע-ביולוגיה מולקולריות, ואסטרטגיות הנדסיות מטבוליים ותהליך לפיתוח מוצר. עם זאת, בהשוואה למארחי ייצור מקומיים, E. חיידק אינו תערוכה על אותה הרמה של ייצור מוצר טבעי מורכב. לכן היה ידוע אם E. חיידק יכול לשמש כאפשרות מעשית עבור Heterologous ביוסינתזה מוצר טבעית מורכבת. עם זאת, הנחה הייתה כי ה coli יהיה אורגניזם מארח אידיאלי אם אפשר להשיג ביוסינתזה Heterologous. עם מטרה זו במוחו, מאמצים ראשוניים החלו לייצר aglycone polyketide 6-deoxyerythronolide B (6dEB) דרך ה coli. עם זאת, א &#39;יליד חילוף חומרים של חיידק לא יכול לספק רמות ניכרות של propionyl-CoA ומבשרים (2S)-methylmalonyl-CoA דרוש כדי לתמוך ביוסינתזה 6dEB לא יכול המארח החדש לאחר translationally לשנות synthase B deoxyerythronolide (ארן) אנזימים. כדי לתקן את הבעיות הללו, מסלול מטבולים המורכבים מילידים ואנזימי Heterologous נבנה לתוך ה coli כאלה שפרופיונאט האכיל exogenously הוסב intracellularly לpropionyl-CoA ולאחר מכן (2S)-methylmalonyl-CoA; בהנדסה כדי להשלים מסלול זה, גן SFP הונח לתוך הכרומוזום דואר של E. coli BL21 (DE3) לייצר זן חדש נקרא BAP1. אנזים SFP הוא מסוגל transferase phosphopantetheinyl של הצמדת cofactor 4&#39;-phosphopantetheine לאנזימי דבס 17,18. השלושה גני דבס (כל אחד ~ 10 ק&quot;ג) היו מניחים בשני וקטורי ביטוי בנפרד לבחירה המכילים מקדמי T7 מושרים. לאחר התאמת מפתח של טמפרטורה לאחר האינדוקציה (עד 22 מעלות צלזיוס), גני דבס התבטאו מתואם בתוך BAP1 במדינה מסוגלת לייצר 19 6dEB פעילה. המרדף של אריתרומיצין מלא ביוסינתזה אז החל להשתמש באשכול מקביל גן מMicromonospora megalomicea או מסלול היברידי מורכבים מגנים מס erythraea, ש &#39; fradiae, וס venezuelae שהפיק ביניים אריתרומיצין C ו 6-deoxyerythromycin D, בהתאמה 20-22. לאחרונה, הקבוצה שלנו האריכה מאמצים אלה על ידי ייצור erythromycin (צורה קלינית הרלוונטית ביותר של אריתרומיצין) דרך ה coli. בניגוד לעבודה קודמת, האסטרטגיה שלנו מתואם הביעה 20 ס המקורי גני erythraea דרוש לביוסינתזה polyketide, ביוסינתזה deoxysugar מצורף, חייטות נוספות, והתנגדות עצמית (איור 2). בסך הכל, 26 גנים (יליד וHeterologous) הונדסו כדי לאפשר א coli כדי לייצר אריתרומיצין בשעת 4 מ&quot;ג / ליטר 23,24. תוצאה זו הוקמה ייצור מלא של מוצר טבעי polyketide מורכב באמצעות ה coli, ומשמש כבסיס למינוף אפשרות הייצור החדש הזה, או לפתוח בחדשים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> מכונת ה-PCR </td><td> אפנדורף </td><td> Mastercycler אישי </td><td></td></tr><tr><td> sulfoxide דימתיל (DMSO) </td><td> דיג </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> דיג </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> פרופיונאט נתרן </td><td> סיגמא </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinose </td><td> סיגמא </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> אכר קירור </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Microfuge </td><td> Eppendorf </td><td> צנטריפוגה 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> TAKARA </td><td> סט פלסמיד Chaperone (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, pCDF-Duet-1 </td><td> כימיקלי EMD </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> אפלייד Biosystems </td><td> 3200 ש-מלכודת </td><td></td></tr><tr><td> תצטט אתיל </td><td> סיגמא </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td> סיגמא </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה אבק </td><td> אפנדורף </td><td> מרוכז 5301 </td><td></td></tr><tr><td> מאייד רוטרי </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

היגיון, שלבים ניסיוניים, והפוטנציאל של יוסינתזה מוצרים הטבעי heterologous מציע אריתרומיצין האנטיביוטי הקומפלקס הופק באמצעות<em&gt; א coli</em

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

הייצור של מוצרים טבעיים Heterologous מורכבים הוא גישה שנועדה לתת מענה מגבלות נוכחיות ואפשרויות עתידיות. התכונה זו שימושית במיוחד עבור תרכובות אלה אשר מחזיקים ערך טיפולי, אך לא יכול להיות מיוצרים במידה מספקת או ירוויח מצורה משופרת של ייצור. הפרוצדורות הכרוכות נחלקות לשלושה מרכיבים: 1) העברה גנטית; 2) כינון מחדש Heterologous; ו3) ניתוח מוצרים. כל רכיב ניסיוני הוא תחת אופטימיזציה מתמדת כדי לעמוד באתגרים ולחזות את ההזדמנויות הקשורות לגישה המתפתחת הזה. ביוסינתזה Heterologous מתחילה בזיהוי של רצף גנטי האחראי למוצר טבעי בעל ערך. העברת רצף זה למארח Heterologous הוא מסובך בשל מורכבות מסלול biosynthetic והאחראיות ליצירת מוצר. אריתרומיצין האנטיביוטיקה הוא דוגמה טובה. עשרים גנים (ההיקף&gt; 50 KB) נדרש לביוסינתזה סופו של דבר. בנוסף, שלושה מהגנים הללו מקודדים megasynthases אנזימים, רב הדומיין של כל אחד ~ 300 KDA בגודל. חומר גנטי זה חייב להיות מתוכנן והועבר לE. coli לביוסינתזה משוחזרת. השימוש בבידוד PCR, בניית אופרון, פלסמידים רבים cystronic, והפיכת אלקטרו שיתואר בהעברת אריתרומיצין מקבץ גנטי לE. coli. ברגע שהועבר, א &#39; תא חיידק חייב לתמוך ביוסינתזה סופו של דבר. תהליך זה גם מאתגר בהתחשב בהבדלים המשמעותיים בין ה coli ומארחים המקוריים ביותר האחראים להיווצרות מוצר טבעית מורכבת. התא חייב לספק מצעים דרושים כדי לתמוך ביוסינתזה ומתואם להביע מקבץ הגנטי הועבר לייצר אנזימים פעילים. במקרה של אריתרומיצין, א &#39; תא חיידק נאלץ להיות מהונדס כדי לספק את שני מבשרים (יחסי הציבורopionyl-CoA ו( 2S)-methylmalonyl-CoA) דרוש לסינתזה. בנוסף, שינויים גנטיים ברצף, מספר העותק פלסמיד, chaperonin שיתוף ביטוי, שינוי אנזימטי לאחר translational וטמפרטורת תהליך היו נדרשו גם כדי לאפשר אריתרומיצין הסופי היווצרות. לבסוף, הפקה מוצלחת חייבת להיות מוערכת. לאריתרומיצין מקרה, אנחנו נציג שתי שיטות. הראשון הוא כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה (LC-MS) כדי לאשר ולכמת ייצור. הפעילות הביולוגית של אריתרומיצין גם תאושר על ידי שימוש במבדק שבפעילות האנטיביוטיקה נבדקה נגד subtilis Bacillus. מבחני ההערכה קובע אריתרומיצין ביוסינתזה מE. coli ולהכין את הבמה למאמצים הנדסיים עתידיים לשיפור או לגוון וייצור לייצור תרכובות טבעיות מורכבות חדשות באמצעות הגישה הזאת.

התוצאה הרצויה של גישה זו היא הייצור של מוצר טבעי לחלוטין מיו ה coli Heterologous מארח. זה מיוצג על ידי מיטב תוצאות LC-MS משמשות כדי לאשר ולכמת ייצור (איור 6) ומבדק אנטיבקטריאלי להשתמש כדי לאשר פעילות סופית (איור 7). במערך הכולל של ביוסינתזה Heterologous, תוצאה זו מגדירה הצלחה. השיג פעם, מאמצי מחקר ואז פונים לאופטימיזציה (שניהם על המאזניים הסלולריים ותהליך) והנדסה מולקולרית. המטרות הסופיות כוללות תהליכי ייצור חסכוניים למתחם והשליטה המקוריי...

ביוסינתזה Heterologous של אריתרומיצין דרך<em&gt; א coli</em&gt; כולל את השלבים הבאים: 1) הניסיוניים העברה גנטית, 2); וכינון מחדש Heterologous 3) הניתוח של מוצר. כל צעד שיוסבר בהקשר של המוטיבציה, פוטנציאל, ואתגרים בייצור מוצרים טבעיים טיפוליים באמצעות<em&gt; א coli</em&gt; כמארח פונדקאי.

היגיון, שלבים ניסיוניים, והפוטנציאל של יוסינתזה מוצרים הטבעי Heterologous מציע אריתרומיצין האנטיביוטי הקומפלקס הופק באמצעות<em&gt; א coli</em

ייצור הטרולוגי של תוצרי טבע מורכבים הוא גישה שנועדה לתת מענה למגבלות נוכחיות ולאפשרויות עתידיות. זוהי...

ביוסינתזת הטרו-לוגית היא שיטה הכוללת שחזור של נתיב ביוסינתטי מאורגניזם אחד אל תוך אורגניזם מאחסן אחר, באמצעות ביטוי מתואם של גנים. בניסוי זה, הנתיב הביוסינתטי עבור erythromycin A מועבר למערכת מאחסנת של e coli, במטרה סופית לייצר כמויות גדולות של אנטיביוטיקה זו. ראשית, צביר הגנים האחראי על יצירת erythromycin מבודל מהמאחסן הבקטריאלי המקורי.החומר הגנטי הזר מעוצב מחדש בפורמט של אופרון (operon) לצורך ביטוי מתואם של המסלול האנזימטי המלא ב-e coli. בעוד זן ה-e coli הנושא את מסלול האריתרומיצין ההטרולוגי משתכפל בתרבית, מיוצר תרכוב האריתרומיצין הסופי. ניתן לבחון את הפעילות האנטיביוטית של התרכוב באמצעות בדיקה פונקציונלית של bacillus solus, בניגוד לייצור של תוצרים טבעיים מורכבים באמצעות האורגניזמים המקוריים שלהם.ביוסינתזה הטרולוגית באמצעות e coli מציעה הזדמנות להגברת מהירות התהליך ופוטנציאל הנדסי. רעיון זה החל לפני כ-10 עד 15 שנים, אך רק לאחרונה, עם פריצות דרך טכניות שונות ושיפורים בטכנולוגיה שלנו, הצלחנו לראות סיפורי הצלחה ממשיים בייצור מורכב של תוצרי טבע באמצעות e coli. ראשית, תכננו והזמינו פריימרים ל-PCR כדי להגביר את כל הגנים הקשורים לצביר בתוך הכרומוזום. עבור תגובת השרשרת של הפולימראז, השתמשו ב-DNA גנומי שהוכן טרי כתבנית.אם הגנים המטרה מכילים תכולת GC גבוהה, בדומה לצביר erythromycin A ב-S eryri, יש להוסיף 4 µL של DMSO לתגובה של 50 µL. יש לאשש את זהות תוצרי ה-PCR באמצעות ריצוף. לאחר מכן, יש לשבט את תוצרי הגנים של ה-PCR למערכת ביטוי של e coli. בעוד ש-cin שימשה כמערכת ביטוי, השתמשנו ב-pattern eight כווקטור ביטוי עבור גנים מסוימים, כיוון שהכללת רצף מוביל טרמינלי הובילה לביטוי יתר של החלבון.בשלב הבא, יש לאשר את הביטוי של תכשיר חלבון תפקודי. באמצעות ניתוח של דף R-T-P-C-R-S-D-S או בדיקות פנוטיפיות נוחות, בנו כעת אופרונים המבוססים על גנים שבוטאו בהצלחה מתוך פלסמיד ביטוי בודד. במידת האפשר, תכננו שילובים של אנזימי הגבלה קוהסיביים תואמים כדי להמיר גנים באופן סדרתי ל-tos.במהלך תהליך הבנייה הפתוחה (open constructions), עלינו לוודא שהאנזים להגבלה שבו השתמשנו אינו חותך את הרצף האינדיבידואלי. במקרה כזה, עלינו לשקול סינתזה של הגן. המשך באיחוד של 20 גני erythromycin A לתוך פלסמידי ביטוי, בהתחשב בגורמים המפורטים בכתב היד הנלווה.כעת יש להעביר את זן ה-e coli BAP1 את הפלסמידים הביוסינתטיים שתוכננו, באופן רצופי או בשילוב, ולזרוע את התאים על מצע LB מוצק המכיל שילוב של אנטיביוטיקות כדי לבחור את התאים השומרים על הפלסמידים. השימוש בשישה סלקציות אנטיביוטיות שונות עבור טרנספורמציות של E. coli הוא חריג ביותר, אך הדבר נובע מכך שנדרשים שישה פלסמידים עבור הסינתזה המלאה של erythromycin A ב-coli. חלק זה קובע את תנאי התרבית לפעילות מתואמת של נתיב ה-erythromycin A המלא.הגן BP one תוכנן כדי לספק את הסובסטרט הדרוש ל-cin, ביו-סינתזה, ולביצוע מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונלית של IDE mega synthesis. בחר מושבות נפרדות של BAP one שעברו טרנספורמציה לאחרונה והזריק שלוש תרביות של 1.5 milliliter במצע alb המכיל את האנטיביוטיקה הנדרשת לבחירת הפלסמיד, 100 micromolar IPTG, שני milligrams per milliliter של arabinose להשראת ביטוי הגן ו-20 millimolar sodium propionate.כדי לתמוך ביצירת חומרי מוצא ביוסינתטיים תוך-תאיים, יש לגדל את התאים בטמפרטורה של 22 °C ובמהירות של 250 RPM למשך 24 עד 48 שעות. יש לדגום את התרבית באופן מחווט לצורך ניתוח יציבות הפלסמיד במהלך הצמיחה. יש להבהיר את התרביות באמצעות סנטריפוגציה במהירות של 10,000 RPM.הסר את הנוזל העליון ואחסן את המשקע בטמפרטורה של 4 °C לצורך אנליזה. כדי לאשר ולכמת את היווצרות ה-erythromycin A, הזרק את הנוזל העליון של התרבית למערכת lc MS. הרץ בנוסף דגימות סטנדרט של erythromycin A הזמינות מסחרית עבור מקרים שבהם אין סטנדרטים זמינים מסחרית.התרכובת תדרוש אפיון כימי נוסף באמצעות NMR ומספקטורמטריית מסה ברזולוציה גבוהה. השוו את התפוקה בין שלוש ההכנות וזהו את היצרן בעל התפוקה הגבוהה ביותר. הכינו מלאי גליצרין ממקור המושבה ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס את המלאי המייצר את הכמות הגבוהה ביותר של erythromycin.התחילו תרבית ייצור נפרדת של e coli, וחלצו את העליון הסופי באמצעות שני נפחים של ethyl acetate. לאחר מכן, ייבשו את החילוץ ב-speed vac והשביו את המשקע ב-100 µL של methanol. לאחר מכן, העבירו את החילוץ לדיסקית סינון סטרילית ויבשו באוויר באופן נפרד.מדגש את תרבית B subtles במודיום LB נוזלי למשך לילה, מוסיפים 20 µL מתרבית B subtles ל-20 mL של אגר LB נוזלי בטמפרטורה של 45 °C ומכינים פלטה. כעת, מניחים את דיסק הסינון של erythromycin A על גבי ה-B solus המוצק המכיל אגר ומדגירים בטמפרטורה של 37 °C. בדוגמה זו, מקבץ הגנים של erythromycin מ-S urethra מועבר ל-e coli, לאחר מכן מופק erythromycin A מהמארח ההטרולוגי e coli.המוצר הביואקטיבי מנותח בכרומוזום S ETH three A הטבעי. מקבץ הגנים של האריתרומיצין מאורגן ב-55 KB של DNA כולל לאחר ביטוי; מסלול ביוסינתטי מורכב, הדורש חומרי מוצא תוך-תאיים ואנזימי עיצוב וביוסינתזה של poly heide, מייצר erythromycin A עבור העברת הגנים. גנים בודדים מבודלים תחילה באמצעות PCR.לאחר מכן, הגנים הדרושים להיווצרות erythromycin A עובדו בשתי דרכים: ראשית, הם שוכפלו באופן פרטני לתוך וקטורי ביטוי כדי לאשר את ייצור החלבון ואת פעילותו באמצעות SDS page ובדיקות פנוטיפיות, ושנית, הם אוחדו כאופרונים לצורך העברה עתידית של המסלול השלם ל-e coli. גנים מסוימים דרשו ביטוי עם רצף מוביל ב-five prime הנובע מווקטור הביטוי PET 28, בעוד שאחרים לא דרשו זאת. את הביטוי של הגנים הבודדים ניתחו תחילה באמצעות SDS page. תוצאה זו מציגה הערכה פנוטיפית של הגן ERME לעמידות ל-erythromycin A; erythromycin A בתוך המצע המוצק משמש לבדיקת זני e coli הנושאים פלסמידים עם או ללא הגן ERME לעמידות ל-erythromycin A.ניכר כי ביטוי של ERME מציל את צמיחת התאים. לאחר מכן, מסלול erythromycin A המלא מוכנס ל-e coli, כולל פלסמיד עבור ה-chaperone grow EL, ופלסמיד המכיל עותק נוסף של URI K. נעשה שימוש ב-electro transformation כדי להחדיר את הפלסמידים ל-e coli. לבסוף, נבחן יציבות הפלסמידים עבור הזן הסופי.תוצאות LCMS מאשרות ומכמתות את ייצור האריתרומיצין. פונקציונליות חשובה מאושרת באמצעות בדיקות ביולוגיות אנטי-בקטריאליות היוצרות אזורי עיכוב בזני חיידקי B subtilis, או מגבילות את צמיחת תרבית B subtilis בדילולות סדרתיות של אריתרומיצין A. עם הדגמה וידאו זו של הביוסיס ההטרוגנית המורכבת של תוצרים טבעיים, יש לכם כעת את היכולת לתכנן, ליישם ולנתח את השלבים הניסיוניים הבודדים הנדרשים ליצירת תוצר טבעי הטרולוגי מלא. על ידי יישום הנדסה מטבולית בתאי e coli לאופטימיזציה של מקדימים שונים ושל המסלול שהוכנס, תוכלו למקסם את הייצור של, נניח, אריתרומיצין, עליו דיברנו היום, או כל תרכובת אחרת שעשויה להיות בעלת ערך רפואי או קשה לייצור.

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

פרוטוקול של חמישה ימים זה מתאר את כל השלבים, ציוד ותוכנה נוספת דרושה ליצירה והפעלת מערכת ביטוי תא ללא TX-TL מאפס חיידקי Escherichia אנדוגני יעילים מבוססים. עם חומרים כימיים, הפרוטוקול לוקח 8 שעות או פחות להגדרת תגובה, לאסוף, ולעבד נתונים.

פרוטוקולים ליישום חיידקי Escherichia בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט של (א) זיהוי של מוצר טבעי עם פעילות אנטיביוטית, (B) הטיהור של המתחם, (ג) את הדגם הראשון של ביוסינתזה שלה, (ד) הגנום רצף / -mining ואת ( E) אימות של אשכול גני biosynthetic.

ממוצר טבעי כדי המצרר שלו biosynthetic ג'ין: הפגנה שימוש Polyketomycin מ Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

מחקר זה מתאר שיטות עבור T7 בתיווך ביטוי משותף של גנים מרובים מ פלסמיד בודד ב Escherichia coli באמצעות מערכת pMGX פלסמיד.

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

כאן אנו מציגים קל להשתמש בפרוטוקולים להפקת וטיהור diterpenoid מטבוליטים דרך הביטוי קומבינטורית של אנזימים ביולוגיים ב Es chia coli או טבק benthamiana, ואחריו מוצר כרומאטוגרפי טיהור. מטבוליטים המתקבלים מתאימים למחקרים שונים כולל אפיון מבנה מולקולרי, מחקרים פונקציונלים וביואקטיביים.

גישה ניתנת להתאמה אישית לייצור אנזימטי וטיהור המוצרים הטבעיים של Diterpenoid

פרוטוקול הכרייה ההמוני-מונחה הגנום מבוסס ומתואר כאן. הוא מבוסס על מידע רצף הגנום ו-LC-MS/MS ניתוח ומטרתו להקל על זיהוי של מולקולות מחיידקים מורכבים ותמציות צמחים.

המסה ספקטרומטר מודרמטריה מונחה הגנום ככלי לחשוף מוצרים טבעיים הרומן

פרוטוקול זה מפרט שיטה משופרת לסינתזה של תשואות גבוהות של חלבונים רקומביננטיים ממערכת תרגום שעתוק ללא תאים (TX-TL) של סטרפטומיצ'ס ונצואלה .

ערכת כלים לתרגום תמלול סטרפטומיצ'ס בתפוקה גבוהה לביולוגיה סינתטית ויישומי מוצרים טבעיים

היכולת של בקטריופאג' להעביר דנ"א בין תאי חיידקים הופכת אותם לכלים יעילים למניפולציה גנטית של החיידקים המארחים שלהם. מוצגת כאן מתודולוגיה לגרום, לשקם ולהשתמש ב-φBB-1, בקטריופאג' של בורליה בורגדורפרי, כדי להמיר דנ"א הטרולוגי בין זנים שונים של ספירוצ'טה של מחלת ליים.

מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של מחלת ליים ספירוכטה בורליה בורגדורפרי

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור והערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית והציטוטוקסיות של הפפטיד הקטיוני Mel4 ושל הפפטיד המדמה RK758. על ידי שילוב סינתזה כימית, ביטוי רקומביננטי ובדיקות פונקציונליות סטנדרטיות, הוא מספק תהליך עבודה יעיל לייצור ובדיקה של פפטידים וחיקוי מולקולות קטנות.

ייצור ובדיקות של פפטידים אנטימיקרוביאליים והחיקויים שלהם

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

למד את שיטת הביוסינתזה ההטרולוגית של אריתרומיצין A ב-E. coli. חקור את העברת הגנים, שחזור המסלול הביוסינתטי ובדיקת הפעילות האנטיביוטית נגד Bacillus subtilis.

היגיון, שלבים ניסיוניים, והפוטנציאל של יוסינתזה מוצרים הטבעי Heterologous מציע אריתרומיצין האנטיביוטי הקומפלקס הופק באמצעות א coli (וידאו) | JoVE Journal

היגיון, שלבים ניסיוניים, והפוטנציאל של יוסינתזה מוצרים הטבעי Heterologous מציע אריתרומיצין האנטיביוטי הקומפלקס הופק באמצעות

גלה סרטונים נוספים