ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל בחי מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות
18 בינואר 2013
Iontophoresis של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך תאי In vivo הקלטות הן דרך רבה עצמה כדי לתפעל microenvironment של תא עצב. מניפולציות אלו בקלות ניתן לעשות זאת באמצעות קופת חיסכון, גב multibarrel אלקטרודות. כאן אנו מתארים כיצד לייצר אותם ולהשתמש בם במהלך הקלטות קוליות.
נוהל זה נועד להגשה יונית-אפורטית של סוכנים פרמקולוגיים למעגלים מיקרוסקופיים במוח, תוך כדי הקלטה סימולטנית של פעילות עצבית. ראשית, משכו אלקטרודת זכוכית בעלת קנה יחיד להקלטה של תא בודד וכופפו את הקצה. כמו כן, משכו אלקטרודת זכוכית רב-קני ושברו את קצהה לקוטר הרצוי.
המשיכו להרכיב את שתי האלקטרודות. בסופו של דבר, האלקטרודה שהוכנה משמשת להקלטות חוץ-תאיות in vivo, שבהן ניתן להחדיר סוכנים פרמקולוגיים לפי הצורך כדי להשפיע על מעגלים עצביים מיקרוסקופיים. שלום, שמי ד"ר Achim Klu, והמעבדה שלנו תראה לכם היום כיצד לייצר אלקטרודות רב-חורי מסוג piggyback.
ניתן להשתמש באלקטרודות אלו כדי להחדיר באמצעות יוניפור (ionophore) אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים אל המיקרו-סביבה של נוירון, ובכך להשפיע על מעגלים עצביים של נוירון in vivo. שלום, אני ד"ר An Zillow. אני פוסט-דוקטורנט במעבדה של ד"ר Ah him Crow, והיום אדגים את הפרוצדורה. עבור אלקטרודה בעלת חלולית אחת, השתמשו בנימי זכוכית בעל חלולית אחת עם פילמנט, ומתוחו את הקצה עד לקוטר של כ-1 עד 2 µm ואורך גוף של 10 עד 12 mm.
יש לאמת את התנגדות האלקטרודה שנשלפה באופן ספורדי על ידי מילוי שלה בנתרן כלורי בריכוז שלושה מולר ובדיקה באמצעות מד Ω סטנדרטי בתמיסת מלח בריכוז 0.9%. לאחר מילוי האלקטרודה בתמיסת המלח, התמיסה מתייבשת במהירות, מה שהופך את האלקטרודה לבלתי שמישה. לכן, יש לבצע בדיקה זו בלבד.
בצעו משיכה למספרת אלקטרודות שלא ישמשו להכנת ה-piggyback. כדי ליצור אלקטרודה רב-חלליתית מלאה, משכו את הזכוכית עד לקבלת קצה פיפטה בעובי כולל של כ-10 micrometers או פחות. אלקטרודה עם קצה שנמשך כראוי היא קריטית להצלחת הפעולה.
בנוסף לכך שהקצה צריך להיות ארוך ודק, עליו להישאר יציב ולהישבר בקלות לקוטר הקצה הרצוי. בשלב הבא יישבר הקצה לקוטר הנכון, ולכן גודל הקצה המדויק פחות קריטי במהלך תהליך האיסוף (pooling) מאשר הצורה הכללית של קצה האלקטרודה, שצריכה להיות ארוכה ודקה יחסית.
כעת, החזיקו את אלקטרודת החור הבודד בזווית של כ-45 מעלות, כאשר הקצה פונה כלפי מטה, והעבירו אותה במהירות יחסית דרך הלהבה. שאפו שהלהבה תמיס את הזכוכית באזור המעבר, במרחק של כ-10 מילימטרים מקצה האלקטרודה, כדי לכופף אותה בזווית של כ-20 מעלות. הניחו את אלקטרודת הרב-חור על מצע של חימר פיסולי על גבי למסחית זכוכית, ולאחר מכן הכניסו אותה לבמות המיקרוסקופ.
מחזיק שקופיות באמצעות מניפולטורי ה-XY של במת המיקרוסקופ, הזיזו בעדינות את קצה האלקטרודה כנגד חתיכת הפלקסיגלאס. צפו בשבירת הקצה דרך העדשות של המיקרוסקופ. הגדרת הרכבת האלקטרודה מוצגת כאן.
האלקטרודה רב-חביבית מוחזקת על גבי זכוכית על שולחן המיקרוסקופ. בעוד שהאלקטרודה החד-חביבית מוחזקת על ידי מניפולטור ידני רב-צירי המאפשר למשתמש להוריד את הפיפטה החד-חביבית על גבי הפיפטה רב-חביביתה בדיוק רב. הורידו את האלקטרודה החד-חביבית ישירות לתוך החריץ של האלקטרודה רב-חביביתה שנוצר על ידי סידור חמשת החביבים, כך שהקצה שלה יבלוט מעבר לקצה של האלקטרודה רב-חביביתה בכ-5 עד 10 micrometers.
הדביקו את מוטות שתי האלקטרודות זו לזו באמצעות ציאנואקרילט. התחילו במיקום המרוחק ביותר מהקצוות והזיזו לאט קיסם עם טיפת דבק לאורך מוטות האלקטרודות לכיוון קצוות האלקטרודות. מריחת דבק קרוב מדי לקצוות האלקטרודות תגרום לחסימתם ותהפוך את האלקטרודה לבלתי פונקציונלית, לפחות באופן חלקי.
ערבבו כמות קטנה של סמנט דנטלי. המתינו כ-15 דקות לייבוש. לאחר מכן, הסירו בזהירות את אלקטרודת ה-piggyback המוכנה.
ראשית מהמחזיק של המיקרו-מניפולטור, ולאחר מכן נתק מהמסלול הזכוכית. רגע לפני השימוש באלקטרודה, הכן למילוי חוזר של כל חבית בתרופה המתאימה לה. מלא את ארבע החביות החיצוניות בתצורת חמש החביות בארבע התרופות הנבחרות, ואת החבית המרכזית בנתרן כלוריד בריכוז 3 M כחבית מאזנת.
לאחר מכן, מלאו את אלקטרודת ההקלטה בעלת החבית הבודדת בנתרן כלורי בריכוז שלושה מולאר. כעת הפעילו את מודולי משאבת האיון-פורזיס ובדקו את כל החביות. פונקציית בדיקת האלקטרודה של כל מודול משאבה תסייע לקבוע אם חבית האלקטרודה תקינה עבור הקלטות מעמקי המוח.
אלקטרודה בעלת חמישה חביים מוגמרת, המורכבת יחד עם אלקטרודת רישום בעלת חביי אחד, בעלת מוט ארוך של כ-7 מילימטרים. מספר אגוניסטים ואנטגוניסטים סינפטיים נמצאים בשימוש נפוץ באיונטופורזה לחסימת עיכוב גליצין באמצעות תרופות כגון אנטגוניסטים לקולטני הגליצין. Trick nine hydrochloride מעלה בדרך כלל את קצב הפעירה בנוירונים.
נתוני מדגם אלו מודדים פונקציה של קצב פריקה של נוירונים שמיעתיים לעומת עוצמה, ומראים תגובות לגירויי קול סינוסואידליים בעוצמה עולה שהועברו לאוזני בעל החיים. צלילים חזקים יותר הובילו לקצבי ספייקים גבוהים יותר לפני יישום nine קפדני. פונקציית קצב העוצמה של הנוירונים מראה קצבי ספייקים נמוכים.
הפעלת זרם איונטופורזה ראשוני של 15 nano amps מעוררת עלייה קלה בזרם הפליטה. זרמי פליטה גבוהים יותר באופן הדרגתי חוסמים מספר גדל יותר של רצפטורים לגליצין בנוירון, מה שמוביל לקצבי פריקה גבוהים יותר באופן הדרגתי. בזרם של 45 nano amps, נראה כי כל רצפטורי הגליצין של אותו נוירון נחסמים על ידי strict nine hydrochloride.
כל הגברה נוספת של זרם ההזרקה ושחרור כמות גדולה יותר של nine לא הובילו לשינוי נוסף. פונקציית רמת קצב הפריקה של הנוירונים לאחר סיום האיונטופורזה, התאוששות מלאה של התגובות העצביות חזרה לקו הבסיס מתרחשת לאחר כ-25 דקות. תהליך התאוששות זה תלוי בסוג ובכמות התרופה שהוזרקה.
חשוב לזכור כי התרופה תפעפף אל הסביבה של אתר ההקלטה ועשויה גם לחסום רצפטורים בנוירונים שכנים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי השילוב של אלקטרודת הקלטה עם אלקטרודת תרופות רב-חביתית (multi barrel) כדי להשיג הקלטות מעמיקים של המוח עם רעש נמוך, לצד הזרקה מבוקרת בזמן של עד ארבעה חומרים פרמקולוגיים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את תהליך הייצור והשימוש באלקטרודות רב-חוליות מסוג piggy-back עבור יונטופורזה של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך הקלטות in vivo. אלקטרודות אלו מאפשרות מניפולציה של המיקרו-סביבה של נוירון תוך כדי הקלטת פעילות עצבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- מניפולציה של מעגלים עצביים
רקע
- יונטופורזה (Iontophoresis) היא טכניקה המשמשת להחדרת חומרים פרמקולוגיים למעגלים מיקרו-מוחיים ספציפיים.
- הקלטות חוץ-תאיות in vivo הן חיוניות לחקר פעילות עצבית.
- שילוב של יישום תרופות עם הקלטות עצביות משפר את הדיוק הניסויי.
- אלקטרודות רב-חביתיות (Multibarrel electrodes) מאפשרות הולכת תרופות והקלטה בו-זמנית.
מטרת המחקר
- להדגמת תהליך הייצור של אלקטרודות רב-חוריות מסוג piggy-back.
- להדגמת היישום של אלקטרודות אלו בהקלטות עצביות שמיעתיות.
- למתן תובנות לגבי מניפולציה של מעגלים עצביים in vivo.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מתיחת אלקטרודות זכוכית בעלות חלול אחד או מספר חלולים לממדים ספציפיים.
- הרכבת האלקטרודות בדיוק גבוה באמצעות מיקרוסקופ.
- מילוי חוזר של החלוליות בחומרים פרמקולוגיים לצורך יונטופורזה.
- בדיקת התקינות התפקודית של האלקטרודות לפני השימוש.
תוצאות עיקריות
- האלקטרודות שהורכבו העבירו בהצלחה סוכנים פרמקולוגיים לצורך מניפולציה של הפעילות העצבית.
- יישום של אנטגוניסטים לקולטני גליצין העלה את קצבי הפריקה העצבית.
- התאוששות של התגובות העצביות התרחשה לאחר סיום האיונטופורזה.
- הנתונים הדגימו את יעילות הטכניקה בהקלטות של נוירונים שמיעתיים.
מסקנות
- אלקטרודות רב-חוריות מסוג Piggy-back יעילות להגשה משולבת של תרופות ולהקלטה עצבית.
- שיטה זו מאפשרת מניפולציה מדויקת של מעגלים עצביים in vivo.
- הטכניקה יכולה לשפר את ההבנה של הדינמיקה העצבית בתגובה לחומרים פרמקולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת מניפולציה מדויקת והפיכה של קלטים סינפטיים in vivo, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות (target validation) באמצעות בידוד של מסלולים עצביים ספציפיים. היא מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לחקירה פרמקולוגית של תפקוד המעגל תחת בקרה של זמן. גישה זו מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים (mechanistic de-risking) בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור בין מטרות מולקולריות לבין תפוקות פיזיולוגיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי תת-סוגים ספציפיים של רצפטורים באמצעות חסימה או הפעלה סלקטיבית של קלטים סינפטיים.
- ערך תפעולי: מספקת בקרה הפיכה ותלויית-מינון על מערכות מוליכים עצביים להערכת המעורבות של המטרה.
- ערך ניבוי: תומכת בביטחון במטרה על ידי הדגמת ההשלכות התפקודיות של מודולציה של רצפטורים על פריקה עצבית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות בזמן אמת של פעילות נוירונלית בתגובה לסוכנים פרמקולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר מינון יונטופורי סטנדרטי וניתן לשחזור לאורך מפגשים ניסויים.
- מוכנות הבדיקה: מקל על סריקת אגוניסטים ואנטגוניסטים עם בקרה זמנית מדויקת למחקרי מנגנוני פעולה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים של מטרות in vitro לבין תגובות פיזיולוגיות in vivo במעגלים עצביים שלמים.
- מערכת רלוונטית למחלה: תומכת בהערכת השפעות תרופתיות במודלים רלוונטיים מבחינה התנהגותית, כגון מסלולי עיבוד שמיעתי.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהירה האם השפעות התנהגותיות שנצפו נובעות ממודולציה ישירה של המטרה לעומת פיצוי ברמת הרשת.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי מתן אפשרות לתיקוף פונקציונלי של מטרות לפני אופטימיזציה של המוליכים, במיוחד בתוכניות המתמקדות במדעי העצבים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהבהרת מסלולים על ידי בידוד תרומות של קלטים אפרנטיים ספציפיים לפלט עצבי.
- סריקה: מספק תוצאות אלקטרופיזיולוגיות כמותיות המאפשרות להסיק על סלקטיביות ועוצמה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק קשרי זרם-מינון יונטופוריים המתואמים עם תפוסת רצפטורים והשפעה פונקציונלית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציה מולקולרית לשינויים באותות עצביים הרלוונטיים לנקודות קצה של עיבוד חושי.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב האלקטרודות מאפשר שימוש חוזר באזורי מוח שונים ובמועמדים לתרופות שונים עם מינימום של תיקוף מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לחקירה סיבתית של קלטים סינפטיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הקלטות יציבות עם רעש נמוך בשילוב עם הולחה מדויקת של תרופות לקבלת תוצאות הדירות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אישור מעורבות המטרה ברמת המעגל העצבי לפני מחקרים הדורשים משאבים רבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות בהתבסס על השפעות עצביות תפקודיות in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, במשיכת אלקטרודות ובטכניקות של יונטופורזה.
- תלוי במיקרוסקופיה מדויקת ובמניפולטורים לצורך יישור אלקטרודות ברמה של סוב-מיקרון.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי מילוי חוזר (backfilling) וייבוש כדי למנוע סתימה של הקצה.
- כולל כיול של זרמי הפליטה להשגת רמות החסימה הרצויות של הרצפטורים.
- מוגבל על ידי השפעות דיפוזיה של התרופה העלולות להשפיע על נוירונים שכנים, דבר הדורש פרשנות זהירה.
