Name: ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל בחי מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: למד לייצור אלקטרודות פיגי-בק רב-לועיות להפעלת תרופות באמצעות יונטופורזיס במעגלים עצביים תוך הקלטת פעילות נוירונים בחי. שיטה זו מאפשרת מניפולציה מדויקת של מיקרו-סביבת נוירונים וחקר תגובות עצביות לסוכנים פרמקולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה על ידי R01 DC 011582 (AK) וRO1 DC011555 (DJT).

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודות זכוכית משוך אלקטרודות זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך האלקטרודה חבית אחת. השתמש זכוכית חבית אחת נימים עם נימה ולמשוך קצה לקוטר של כ 1-2 מיקרומטרים, אורך גל של 10-12 מ&quot;מ, והתנגדות האלקטרודה מקבילה של כ 12 MOhm (טווח 5-20 MOhms) כפי שנמדד בתמיסת NaCl 0.9%. התנגדויות אלקטרודה נמוכות תבאנה בפעילות רקע יותר ולכן קשה יותר לבודד פעילות אחידה מתא עצב בודד. עבור משייכת אלקטרודה זו, השתמש בקו אופקי או אנכי חולץ עם או חוטי חימום או סלילי חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך האלקטרודה multibarrel. בשל קוטר הרבה יותר הגדול של זכוכית multibarrel ואת הצורך של פיזור חום אפילו סביב כל multibarrel, מושך חזק עם סליל גדול קוטר חימום, ולא חוט חימום, יש צורך. פיפטה multibarrel צריכה להיות מוכנסת במרכז חוט החימום עם no לפנות לסליל החימום. שימו לב שמלבד את pipettes 5-החבית מתוארת כאן, 3-חבית או החבית 7 pipettes חלופות מסחריות זמינות. משוך זכוכית לקצה פיפטה של ​​כ 10 מיקרומטר קוטר כולל, או פחות. טיפ יהיה שבור לקוטר הנכון בשלב הבא, כך שגודל הטיפ המדויק הוא פחות קריטי בתהליך מושך מהצורה הכללית של קצה האלקטרודה, שאמורה להיות ארוך ודק יחסית. עיין בתמונה באיור 1C לצורת קצה האלקטרודה הרצויה. צורות אלקטרודה קצרות ועבות (האיור 1B) תגרומנה לכמות משמעותית של ניזק לרקמה, כאשר התקדמו לתוך המוח, ואילו צורות אלקטרודה ארוכות מאוד ודקות (איור 1 א) תהיינה לכופף ובכך תהפוכנה את זה קשה לשבור את קצה האלקטרודה לנכונה קוטר (ראה שלב 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה טיפי אלקטרודה שנה טיפי אלקטרודות. לפני שתי אלקטרודות יכולות להיות מודבקות יחד, הם צריכים להיות שונים. הפיר של האלקטרודה היחידה צריך להיות כפוף לפני זה יכול להיות מחובר לmultibarrel לוודא הפיר המשולב של האלקטרודה המוגמרת חזירון הגב הוא דק ככל האפשר. בנוסף, קצה האלקטרודה multibarrel יש לשבור את כדי להבטיח עמידות נמוכה לiontophoresis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כופף את המוט של האלקטרודה חבית אחת של כ 20 מעלות. השתמש להבת בונזן המבער הקטנה ביותר האפשרית. מבערים טיפוסיים &quot;קטנים&quot; בונזן מחברות אספקת מעבדה הרגילות ליצור גדלי להבה, כי הם גדולים מדי עבור יישום זה. כדי לעקוף בעיה זו להשתמש במבער בונזן המסחרי הקטן ביותר ולהבטיח את מחט מזרק (~ 18 מד) לראש המבער, ולאטום את החיבור באמצעות מלט שיניים. כאשר מופעלים, הלהבה צריכה להיות קשה לראות, בערך 5 מ&quot;מ או פחות בקוטר, וכ 8 מ&quot;מ גבוה. כל תנועת האוויר בחדר תהיה לכבות אש ש, כך שזה רעיון טוב לפעול בצורבחדר סגור, או להשתמש במגן רוח. העבר את האלקטרודה חבית אחת דרך הלהבה כדי לכופף אותו בכ 20 מעלות. שואף להיות להבת המבער ממסה את הזכוכית באזור המעבר בכ 10 מילימטרים ספורים מקצה האלקטרודה. כדי למנוע התכת קצה האלקטרודה אנו מציעים שנתקיים באלקטרודה על 45 מעלות, קצה כלפי מטה, ולהזיז את האלקטרודה דרך הלהבה במהירות יחסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את קצה האלקטרודה multibarrel. כדי להבטיח בקרה חזותית תוך שבירת קצה האלקטרודה, השתמש במיקרוסקופ במטרת 10x מינימום וoculars 10x. היקף מדידה מוכנס העיני יהיה גם צורך למדוד גדלי טיפ. צרף חתיכת פרספקס למיקרוסקופ כזה שסופו של פרספקס ניתן לראות כבשליש למחצית משדה הראייה של המיקרוסקופ. במקרה שלנו, חתיכת פרספקס היא כ 70 מ&quot;מ x 25 מ&quot;מ עובי ו 5 ומחובר באמצעות בורג שיכול להיות מאובטח למנהגעשה נושא בשלב מיקרוסקופ. חשוב יש עיצוב שמאפשר לפרספקס נע באופן עצמאי של השקופית. הנח את האלקטרודה multibarrel במיטה של ​​פלסטלינה בשקופית זכוכית, ולהכניס את השקופית המכילה את האלקטרודה לתוך החזיק השקופיות של במת מיקרוסקופ. שימוש המניפולטורים XY של במת מיקרוסקופ, בעדינות להזיז את קצה האלקטרודה נגד חתיכת פרספקס, ולבחון את השבירה של הקצה דרך oculars המיקרוסקופ. תנסה נקי כדי לשבור הקצה של multibarrel לקוטר מצטבר של כ 25-35 מיקרומטרים. השלך pipettes עם קוטר טיפ שפרץ את גדול מדי, או טיפים עם הפסקות לא אחידות. אנחנו זורקים כ 30% מאלקטרודות multibarrel בשל צורות עצה לא רצויות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב אלקטרודה פיגי גב להרכיב האלקטרודה חזירון גב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות עמדה. הסרת חתיכת פרספקס משמשת בשלב 2.2 מבמת מיקרוסקופ. Secure השליםmultibarrel האלקטרודה לפלסטלינה בשקופית זכוכית, עצה מצביעה מעט כלפי מעלה. מצביע כלפי מעלה יהיה חשוב עבור צעד 3.2, ההדבקה של שתי אלקטרודות. טיפים שמצביעים בעד לגרום לדבק לברוח מהקצה, הימנעות הדבקת קצות אלקטרודות. הכנס האלקטרודה חבית אחת כפופה למחזיק האלקטרודה של micromanipulator בהתאמה האישי (איור 2). השימוש הראשון ולאחר מכן הדרכה חזותית הנחיה מיקרוסקופית, להנמיך את האלקטרודה חבית אחת על האלקטרודה multibarrel. אלקטרודה הבודדה לא צריכה להיות וריד ישירות לתוך החריץ שנוצר על ידי הסידור של 5 חביות, בקצו הבולט בקצה של קצה multibarrel כ מיקרומטרים 5-10. כאשר מורידים את החבית אחת, עוקב בקפידה אחרת הזווית שנוצרת בין שתי אלקטרודות. לתוצאה הטובה ביותר להימנע מכל זוויות שבקצוות להצביע בנפרד אחד מהשני, אלא מנסים להנמיך את האלקטרודה אחת על רב בצורה מושלמת במקביל או אפילו בקצונגיעת multibarrel הראשון, ויצר הסדר &quot;טריז&quot; קל מאוד. מאז את קצה חבית אחת הוא מאוד גמיש, הוא מתכופף כאשר האלקטרודה היחידה היא הורידה עוד קצת אחרי הקצה הגיע המשטח העליון של האלקטרודה החבית הרבה, ויוצר קצה משולב נקי שיש כמות קטנה של פעולת מעיין נבנתה ב המסייע להחזיק את העצות ביחד. עם זאת, אם הזווית בין חבית אחת ואלקטרודה multibarrel היא תלולה מדי (יותר מדי של טריז), שהקפיץ יהיה גבוה מדי ולכופף את מטה הסדר אלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירי דבק אלקטרודה יחד. דבקים בפירים של שתי אלקטרודות יחד באמצעות cyanoacrylate (דבק מגע). הנח טיפה קטנה של דבק על הצד הקטן של קיסם שטוח והרכבת האלקטרודה מגע עם טיפת הדבק. התחל במיקום המרוחק ביותר של העצות ולהעביר קיסם לאט עם טיפת דבק לאורך פירים אלקטרודה כלפי טיפי אלקטרודות. שימוש יותר מדי דבק, או החלת דבק לאoo קרוב לטיפים אלקטרודה יגרום הדבקת פתחי אלקטרודה, טיוח האלקטרודה לפחות חלקית מתפקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב משותף עם מלט שיניים. מערבבים כמות קטנה של מלט שיניים ואקריליק שיניים בצלחת פלסטיק חד פעמית קטנה או שוקל סירה, באמצעות קיסם שטוח. חכה עד מלט הופך moldable ולהחיל כמות קטנה למפרק בין שתי אלקטרודות מנת לייצב את המפרק (חומר ורוד באיור 3). אפשר כ 15 דקות לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ולאחסן אלקטרודה. להסיר בזהירות את האלקטרודה חזירון הגב סיים ראשון מבעל micromanipulator, ולאחר מכן לנתק אותה מהזכוכית השקופית, וחנות במכל dustproof. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרוני אלקטרודה מילוי הכן את האלקטרודה פתרוני מילוי. מאז iontophoresis דורש מולקולות טעונות, רוב הסוכנים צריכים להיות מומסים או בסביבת חומצית או בסיסית (בדרך כללta-pH של כ 3-4, או pH של כ 8-10, בהתאמה). מספר הכימיקלים המשמשים לעתים קרובות בiontophoresis מופיעים בטבלת 1. לסוכנים שאינם מופיעים בטבלה, לקבוע מערך PKA, בין אם זה יהיה קל יותר לשימוש במולקולה חומצית או סביבה בסיסית כדי לשמור על המולקולה טעונה, ולפזר בהתאם. לקבלת תוצאות הטובות ביותר, מערבב את כל הפתרונים טריים מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא והכן אלקטרודות מלא ולהכין אלקטרודות. רק לפני השימוש באלקטרודה, גב למלא כל חבית עם התרופה המתאימה, באמצעות סיבי פחם 28-34 מחטי מד מחוברים למזרקים עם מסנני מזרק. מלא את 4 חביות החיצוניות של התצורה 5-החבית עם תרופות של בחירה, וחבית מרכז עם 3M NaCl כחבית איזון. מלא את האלקטרודה הקלטת חבית אחת עם 3M NaCl גם כן. הוספת צבע לפתרון NaCl, כגון אדום ירוק או פנול מהיר תקל לראות קצה האלקטרודהבמהלך ההשמה של האלקטרודה על משטח המוח. הכנס את האלקטרודה לתוך מחזיק האלקטרודה של הגדרת ההקלטה ולהכניס את כל החוטים לתוך חביות הזכוכית המתאימות. השתמש בחוט כסף מבודד ממנו כ 1 הסנטימטר של בידוד הוסר בקצה. לא צריך להיות 5 חוטים לאלקטרודה multibarrel (4 חביות סמים וחבית איזון 1), בתוספת חוט המגבר שצריך להיות מוכנסים לתוך חבית האלקטרודה הקלטה האחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מודולים משאבת Iontophoresis הפעל מודולים משאבת iontophoresis ולבדוק את כל החביות. פונקצית בדיקת האלקטרודה של כל מודול משאבה תעזור לקבוע אם חבית אלקטרודה היא פונקציונלית. כדי למנוע דליפה של תרופות מהחביות כשאינן בשימוש, מתח שייר בקוטביות ההפוכה כאחראי המולקולה צריך להיות מיושם. </li></ol>

<ol><li>Curtis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+assembly+of+%22parallel%22+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A method for assembly of "parallel" micro-pipettes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).</li>
<li>Carette, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+manufacturing+multi-barrelled+micropipettes+with+projecting+recording+barrel%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).</li>
<li>Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+associated+with+iontophoretic+studies+in+the+caudate+nucleus+and+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra.</a> Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).</li>
<li>Havey, D. C., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+constructing+%22piggy-back%22+multibarrel+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).</li>
<li>Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+construction+of+parallel+multibarrel+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes.</a> Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).</li>
<li>Oliver, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+contribution.+A+simple+rapid+method+for+preparing+parallel+micropipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).</li>
<li>Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaural+intensity+difference+processing+in+auditory+midbrain+neurons%3A+effects+of+a+transient+early+inhibitory+input%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input.</a> J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).</li>
<li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+shapes+a+topographic+organization+of+response+latency+in+the+mustache+bat%27s+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).</li>
<li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+shapes+sensitivity+to+interaural+intensity+disparities+in+the+mustache+bat%27s+inferior+colliculus%3A+implications+for+encoding+sound+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location.</a> J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).</li>
<li>Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycinergic+inhibition+creates+a+form+of+auditory+spectral+integration+in+nuclei+of+the+lateral+lemniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus.</a> J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).</li>
<li>Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT1A+and+5-HT1B+receptors+differentially+modulate+rate+and+timing+of+auditory+responses+in+the+mouse+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).</li>
<li>Wenstrup, J. J., Leroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+Integration+in+the+Inferior+Colliculus%3A+Role+of+Glycinergic+Inhibition+in+Response+Facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation.</a> J. Neurosci. 21, RC124(2001).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus.</a> Hear. Res. 122, 125-141 (1998).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+glycine+have+different+effects+on+monaural+response+properties+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+GABAergic+and+glycinergic+inhibition+on+binaural+processing+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+circuits+sharpen+tuning+curves+and+modify+response+properties+in+the+mustache+bat+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).</li>
<li>Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+GABA+as+an+inhibitory+neurotransmitter+in+inferior+colliculus+neurons%3A+iontophoretic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies.</a> Brain Res. 500, 302-312 (1989).</li>
<li>Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+excitant+amino+acids+on+acoustic+responses+of+inferior+colliculus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons.</a> Hear. Res. 40, 127-136 (1989).</li>
<li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+shifts+first-spike+latencies+of+inferior+colliculus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).</li>
<li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+effects+on+frequency+tuning+of+inferior+colliculus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).</li>
<li>Hurley, L. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+differentially+modulates+responses+to+tones+and+frequency-modulated+sweeps+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).</li>
<li>Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+components+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).</li>
<li>Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+and+GABA+influence+binaural+processing+in+the+inferior+colliculus+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).</li>
<li>Moore, M. J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strychnine+blocks+binaural+inhibition+in+lateral+superior+olivary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons.</a> J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).</li>
<li>Nataraj, K., Wenstrup, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+inhibition+in+creating+complex+auditory+responses+in+the+inferior+colliculus%3A+facilitated+combination-sensitive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons.</a> J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).</li>
<li>Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+inhibition+sharpens+the+frequency+tuning+and+enhances+phase+locking+in+chicken+nucleus+magnocellularis+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons.</a> J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).</li>
<li>Burger, R., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+reveals+its+role+in+the+processing+of+multiple+sound+sources+in+the+inferior+colliculus+of+bats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats.</a> J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).</li>
<li>Burger, R. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+role+of+inhibition+in+shaping+responses+to+sinusoidally+amplitude-modulated+signals+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).</li>
<li>Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+and+glycinergic+inhibition+modulate+monaural+auditory+response+properties+in+the+avian+superior+olivary+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus.</a> J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מתארים טכניקה שמאפשרת המניפולציה של Microcircuit של נוירון הבודד in vivo, ואילו באותו הזמן המאפשר הקלטה של התגובות של נוירון במניפולציה הניסויית. מעגלים עצביים הם מניפולציה באמצעות יישום iontophoretical של אגוניסטים ואנטגוניסטים הסינפטי. היתרון העיקרי של iontophoresis על פליטת לחץ הוא iontophoresis שאינו דורש תנועה הפיסית של נוזל מהאלקטרודה לתוך רקמה עצבית, ולכן אין חשש לגרימת ניזק לרקמות בעזרת לחץ שהפעיל או נפח נוזל. המגבלה העיקרית של שיטה זו היא חוסר מידע על הריכוז המוחלט תרופה ברקמות, ונפח של רקמה נגועה. עם זאת, מאחר והכמויות של סוכנים תרופתיים נפלטו עם iontophoresis הם הרבה יותר קטנות והרבה יותר מדויקת לשליטה מאשר עם פליטת לחץ, ההתאוששות מיישום התרופה היא בדרך כלל הרבה יותר מהרד הרבה יותר מלא. Microiontophoresis בהצלחה בשימוש במספר המערכות עצביות, חושיים ואחרים, ומיושמת בהצלחה רבה באזורים במוח עם מעט או ללא עיבוד פנימי. הסיבה היא שחלק מהתרופתי עשוי לנטרל נפלטו מאתר הבקשה לנוירון השכן וגם לתפעל את מאפייני התגובה של תא העצב הסמוך. הייצור הנפרד של אלקטרודות חבית האחת ורבה מאפשר שילוב של אלקטרודות עם מאפיינים שרירותיים ולא קשורים. מושך חביות אלקטרודה יחד ובעזרת כמה להקלטה וכמה למטרות iontophoresis יפיק טיפי אלקטרודה עם תכונות דומות מאוד, כך שטיפי אלקטרודה אחת יהיו גדולים מדי להקלטת תא בודדה, או קטנה מדי ליישום תרופה. כמו כן, בעל קצה חבית האחת להרחיב מעבר לטיפים אלקטרודה multibarrel של כ 20 מיקרומטרים מקטין מאוד רעש בהקלטות,ד מבטל השפעות נוכחיות מבלבלות אפשריות מזרמי השמירה או פליטה על הירי של נוירון 3. פיגי גב multibarrel אלקטרודות ש1 תוארו לפני 30 שנים ויש לי 4-6 מיושמות בהצלחה רבה לנתח מעגלים עצביים 7-18 19-29. לכן, שיטת כשלעצמה אינה רומן או ייחודית. עם זאת, פרטים המסוימים של הכנה ושימוש באלקטרודה שונו במשך השנים, והקבוצה של הוראות המתוארות כאן הוכיחה להיות קל ומוצלחת במיוחד, ולא פורסמו בהרחבה במקומות אחר בספרות. במיוחד, הכיפוף של קצה האלקטרודה חבית האחת מאפשר הקצה הסופי של האלקטרודה קופת חיסכון, חזרה להיות דק יחסית (איור 3) ובכך, מאפשר להקלטות מגרעינים עמוקים עם ניזק מינימאלי למוח; בולט של חבית האחת האלקטרודה על האלקטרודה רבה החבית מסירה כמעט כל currenהשפעות לא, שלעתים קרובות היו מצוטטות כמו חסרון של השיטה 3. פרטים חדשים שהוצגו כאן כמו שיש קצה האלקטרודה מצביע כלפי מעלה במהלך תהליך ההדבקה ונח חבית אחת בחריץ של האלקטרודה multibarrel יבטיח שיעור הצלחה גבוהה כאשר ייצור אלקטרודות חזירון גב. הטכניקה היא קלה יחסית ובדרך כלל יכולה להיות השתלטה על ידי טירון בתוך ימים ספורים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם פריט </td><td> יצרן </td><td> הערה </td><td> חתול. # </td></tr><tr><td> בונזן מבער </td><td></td><td> זמין מ: VWR </td><td> 17928-027 </td></tr><tr><td> שני מרכיבי מלט שיניים: &quot;תרופה קר&quot; חומר שיניים </td><td> שיתוף האוראלי-ITE שיני Mfg. Co </td><td> זמין מ: מערכות בבוקר, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> שני מרכיבי מלט שיניים: מתחם נוזלי crosslinking חומר שנן </td><td> שיתוף האוראלי-ITE שיני Mfg. Co </td><td> זמין מ: מערכות בבוקר, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> דבק נוזלי </td><td> הנקל </td><td> זמין מ: Loctite Super Glue </td><td> 01-06849 </td></tr><tr><td> מייקרו-Un Iontophoresis: Neurophore BH-2 </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> זמין מ: הרווארד Apparatus </td><td> 65-0200 &amp; 65-0203 </td></tr><tr><td> חוטי כסף מבודד </td><td> AM-מערכות </td><td> זמין מ: AM-מערכות </td><td> 785500 </td></tr><tr><td> חולץ אופקי </td><td> Zeitz DMZ-יוניברסל פולר </td><td> זמין מ: אוטומציה מדעית </td><td> NA </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: מחזיקות האלקטרודה </td><td> WPI </td><td> זמין מ: WPI </td><td> M3301EH </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: שלב יניארי </td><td> 423 סדרות ניופורט </td><td> זמין מ: ניופורט </td><td> 423 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: שלב סיבוב </td><td> ניופורט RSP-2 </td><td> זמין מ:ניופורט </td><td> RSP-2 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: תרגום z </td><td> 433 סדרות ניופורט </td><td> זמין מ: ניופורט </td><td> 433 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: סוגר זווית של 90 מעלות כדי להרכיב z וציר xy </td><td> ניופורט 360-90 </td><td> זמין מ: ניופורט </td><td> 360-90 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: תרגום / יניארי x שלב </td><td> 423 סדרות ניופורט </td><td> זמין מ: ניופורט </td><td> 423 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: תרגום / יניארי y שלב </td><td> ניופורט 423 </td><td> זמין מ: הסדרה ניופורט </td><td> 423 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Leitz 11 Laborlux </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> מיקרוסקופ: אובייקטיבי </td><td> Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25 </td><td></td><td> 519760 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ: eypieces </td><td> Leitz Wetzlar, 10x/18 Periplan </td><td></td><td> 519748 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ: שלב </td><td> Leitz Wetzlar </td><td></td><td> 513544 </td></tr><tr><td> Multibarrel נימים </td><td> N / </td><td> זמין מ: מערכות בבוקר, Inc </td><td> 612000 </td></tr><tr><td> חבית Sinlge נימים (GC 150F-10) </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> זמין מ: הרווארד Apparatus </td><td> 30-0057 </td></tr><tr><td> חולץ אנכי </td><td> Narishige מודל PE-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> אלמנטים עשויים מותאמים אישית של מניפולטור מייקרו-(מסומן אור בlue באיור 1) </td><td></td></tr><tr><td> פלדה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> בסיס הטיה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> התקשרות למחזיק האלקטרודה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> הטבלה 2. יצרנים ומספרים של כל פריט הציוד ואספקה ​​המשמש בהליך. </td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור והשימוש פיגי גב multibarrel אלקטרודות ל<em&gt; בחי</em&gt; מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

בהקלטות מתא עצב בודד vivo מאפשר לחוקר לבחון את מאפייני הירי של נוירונים, לדוגמה בתגובה לגירויים חושיים. נוירונים בדרך כלל לקבל תשומות מעוררות ומעכבות מרובות הביא ו / או efferent המשתלבים אחד עם השני, ואת מאפייני התגובה נמדדו האולטימטיביים של נוירון מונעים על ידי את האינטגרציות העצביות של תשומות אלה. ללמוד עיבוד מידע במערכות עצביות, יש צורך להבין את הכניסות השונות לתא עצב או במערכת עצבית, ואת המאפיינים הספציפיים של תשומות אלה. שיטה חזקה וטכני יחסית פשוטה כדי להעריך את התפקיד הפונקציונלי של תשומות מסוימות שנוירון נתון שקבל היא דינמי והפיך לדכא או לבטל תשומות אלה, ולמדוד את השינויים בתפוקה של תא העצב הנגרמים על ידי מניפולציה זו. ניתן להשיג זאת על ידי שינוי הסביבה המיידית של תא העצב עם חזירון גב multibarrel אלקטרונ פרמקולוגיתשירי הלל. אלקטרודות אלו כוללות אלקטרודה אחת חבית הקלטה והאלקטרודה תרופת multibarrel שיכול לשאת עד 4 אגוניסטים סינפטיים שונים או יריבים. הסוכנים התרופתיים ניתן ליישם iontophoretically בזמנים רצויים במהלך הניסוי, המאפשרים אספקה ​​הזמן בשליטה ושינוי תצורה הפיך של תשומות הסינפטי. כמניפולציה כזו, תרופתית של microenvironment מייצגת שיטה חזקה ואין כמותו כדי לבחון השערות באופן ספציפי על תפקוד מעגלים עצבי. כאן אנו מתארים כיצד אלקטרודות חזירון גב מיוצרות, וכיצד משתמש בם בעת בניסויי vivo. מערכת חזירון הגב מאפשרת חוקר לשלב האלקטרודה אחת חבית הקלטה של ​​כל נכס שרירותי (התנגדות, גודל טיפ, וכו &#39;צורה) עם אלקטרודה תרופת multibarrel. זה יתרון גדול על פני אלקטרודות רבות סטנדרטיות, שבו כל החביות פחות או יותר צורות ומאפיינים דומים. Multibarrel דוארlectrodes הוצגו לראשונה לפני יותר מ 40 שנים 1-3, ועבר מספר השיפורים בעיצוב 2,3 עד סוג חזירון הגב הוצג בשנת 1980 4,5. כאן אנו מציגים סדרה של שיפורים חשובים בייצור המעבדה של אלקטרודות חזירון גב המאפשרים חדיר עמוק במוח שלם בהכנות בעלי חי vivo עקב פיר אלקטרודה דקה יחסית שגורם לניזק מינימאלי. יתר על כן אלקטרודות אלו מאופיינות הקלטות רעש נמוכות, ויש לי חביות סמי התנגדות נמוכות לiontophoresis יעיל מאוד של הסוכנים התרופתיים הרצויים.

בניסוי זה, hydrochloride סטריכנין אנטגוניסטית גליצין יושם iontophoretically. חסימת עיכוב glycinergic בדרך כלל עולה ירי בנוירונים. איור 4 מראה נתונים לדוגמה מתא עצב שמיעתי שתגובות לגירויים קוליים סינוסי של אינטנסיביות גוברת נמסרה לאוזניים של בעלי החיים נרשמו. סוג זה של ניסוי שמכונה תפקוד של הנוירון הפרשות בשיעור לעומת העצמה. נשמע קולות הביאו לשיעורים גבוהים יותר ספייק (עקום שחור). הנוכחי iontophoresis הראשונה השתמש במהלך ניסוי זה היה 15 NA. לאחר הנוכחי היה מופעל והשינויים בתפקוד עוצמת השיעור התייצבו ברמה החדשה שלהם (עקומת כחול כהה), הפליטה הנוכחית הוגדל בהדרגה עד 30, 45, ו 60 NA (כתום, ירוקים, ועקומות אור כחול, בהתאמה). בכל מקרה, את התגובות של הנוירון על אותו טווח עוצמות קול נרשמו לאחר השינויים בdischaפונקציות שיעור בעצמת rge בתגובה לזרם הפליטה החדש התייצבו. הפליטה הנוכחית להשתמש בדוגמה זו המתאימה ביותר הייתה 45 Na Na עד 60 כי הרמות אלה של נוכחיים כבר לא לשנות את התגובות של נוירונים אחרים. תוצאה זו מרמזת כי בגיל 45 Na הנוכחי, כל הקולטנים של גליצין שנוירון כבר נחסם על ידי הידרוכלוריד סטריכנין. כל עלייה נוספת של הפליטה סטריכנין הנוכחי ומשחרר עוד יותר לא הביאה לשינוי נוסף בתפקודו של תא עצב פריקת שיעור ברמה. לאחר סיום הפרוטוקול, הפליטה הנוכחית היה כבוי. ההתאוששות של תגובות עצביות חוזרים לנקודת ההתחלה הושגה לאחר כ 25 דקות (קו אדום). זה עלול לקחת, תלוי בסוג וכמות הסם נפלט, בין כמה שניות וכמה עשרות דקות. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תרופה </td><td> התרכזות </td><td> ה-pH של תמיסה </td><td> ממס </td><td> חברה </td><td> חתול. # </td><td> שייר אופייני נוכחי </td><td> זרמי פליטה אופייניים </td></tr><tr><td> GABA </td><td> 500 מ&quot;מ </td><td> 3.5-4.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> -2129 </td><td> Na -15 </td><td> 5 Na Na ל100 </td></tr><tr><td> גליצין </td><td> 100 מ&quot;מימ </td><td> 3.5-4.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> G-7126 </td><td> Na -15 </td><td> 5 Na Na ל100 </td></tr><tr><td> Methiodide Bicuculline </td><td> 10 mM </td><td> 3.0 </td><td> 0.165 M NaCl בDH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> B-6889 </td><td> Na -15 </td><td> 5 Na Na ל60 </td></tr><tr><td> hydrochloride סטריכנין </td><td> 10 mM </td><td> 3.0 </td><td> 0.165 M NaCl בDH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> S-8753 </td><td> Na -15 </td><td> 5 Na Na ל80 </td></tr><tr><td> חומצת L-גלוטמית </td><td> 500 מ&quot;מ </td><td> 8.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> G-1251 </td><td> 30 Na </td><td> -10 Na Na ל-150 </td></tr><tr><td> חומצה אספרטית L- </td><td> 500 מ&quot;מ </td><td> 8.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> -8949 </td><td> 30 Na </td><td> -10 Na Na ל-150 </td></tr><tr><td> חומצת Kainic </td><td> 1 mM </td><td> 9.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> K-0250 </td><td> 30 Na </td><td> -10nA ל -100 Na </td></tr></tbody></table> לוח 1. תרופות נפוצות, עם חומציות להמסה וריכוז. הטבלה מפרטת את אגוניסטים הנפוצים ביותר הסינפטי ואת היריבים בשימוש עם iontophoresis. סביבת ה-pH רשום חשבונות לצורך לקטב t<html> סוכני hese, ואת חשבונות הריכוז הציעו לשונות ביעילות בין תרופות שונות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" /> איור 1. שלוש multibarrel pipettes עם אורכי עצה שונים: A. קצה האלקטרודה 5-חבית זה כבר משך ארוך ודק מדי. שים לב שהקצה הוא כפוף ורך מאוד. סוג זה של קצה הוא קשה מאוד לשבור לקוטר הרצוי. ב &#39;: קצה אלקטרודה זו הוא קצר ועבה מדי. כשהתקדם לתוך אזורי מוח עמוקים יותר, אלקטרודה זו תגרום ניזק מוחי מיותר בשל העובדה שהופכת את האלקטרודה עבה יחסית רק כמה מילימטרים אחרי הקצה. C: דוגמה לאלקטרודה עם טיפ משך בצורה נכונה. בעת היותו ארוך ודק, הקצה עדיין יציב ויכול להישבר בקלות לקצה הקוטר הרצוי. gure 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. ציור של הרכבת מניפולטור אלקטרודה. הרכבת מניפולטור משמשת יחד עם מיקרוסקופ כדי להרכיב את האלקטרודות חזירון הגב. פריטים המסומנים באפור מוצרים זמינים מסחרי ורשומים בטבלה 2. פריטים המסומנים בכחול המנהג היו במכונה בחנות המכונות של המוסד שלנו. הם 1) 1/4 סנטימטר אינץ פלדת צלחת בגודל 43x26 עם חורים לבמת ניופורט 423 קדחה לתוכו בהתאם לדפוס החור מסופק על ידי ניופורט, 2) בשלב הטיה המאפשר הטיה של ההרכבה בזוויות שרירותיות; 3) מחבר שעולה על בעל אלקטרודה לבמת translational העליונה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" /> איור 3. תמונה של מדגם האלקטרודה חזירון גב. האלקטרודה 5-חבית מוגמרת התאספה יחד עם הקלטת אל יחיד חביתectrode. שים לב ארוך פיר של כ 7mm מאפשר להקלטות מוחיות עמוקות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" /> איור 4. טיטרציה של זרמי פליטה. הגרף מראה פונקציות שיעור בעצימות שנרשמו מתא עצב שמיעת יחידה תוך אוזניו של בעלי חי המגורה עם גוונים של עוצמות שונות. נשמע קולות נטו לעורר שיעורי ירי גבוהים יותר. לפני יישום תרופה, פונקצית שיעור בעצימות של נוירון הראתה שיעורי ספייק הנמוכים ביותר (עקום שחור). זרמי פליטת הדרגה גבוהות יותר נחסמו בהדרגה יותר קולטניים גליצין בנוירון, וכתוצאה מכך שיעורי ירי שעלה בהדרגה. הפליטה האופטימלית הנוכחית בנוירון זה הייתה 45-60 NA. עם זרמי פליטה אלה, חסימה מוחלטת של כל קולטניים גליצין של נוירון הושגה. לאחר השלים פרוטוקול הניסוי, iontophoresis הופסק ונוירון הורשלהתאושש. החלמה מלאה הושגה כאשר פונקצית התאוששות שיעור בעצימות מתאימה פונקצית ההתאוששות מראש תרופה הראשונית. לשכפל, באישור האגודה הפיזיולוגית האמריקנית, מקלוג et al, 1995.

Iontophoresis של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך תאי<em&gt; In vivo</em&gt; הקלטות הן דרך רבה עצמה כדי לתפעל microenvironment של תא עצב. מניפולציות אלו בקלות ניתן לעשות זאת באמצעות קופת חיסכון, גב multibarrel אלקטרודות. כאן אנו מתארים כיצד לייצר אותם ולהשתמש בם במהלך הקלטות קוליות.

ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל<em&gt; בחי</em&gt; מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות

הקלטות in vivo מנוירונים בודדים מאפשרות לחוק לבחון את תכונות הפריקה של נוירונים, למשל בתגובה לגירויים חושיים. ...

נוהל זה נועד ליישום יוני-אפורטי של חומרים פרמקולוגיים למעגלים מיקרוסקופיים במוח, תוך הקלטה סימולטנית של פעילות עצבית. ראשית, משוךת אלקטרודת זכוכית בעלת חלול אחת להקלטה של תא בודד וכפף את הקצה שלה. כמו כן, משוך אלקטרודת זכוכית רב-חלולית ושבור את קצהה לקוטר הרצוי.המשיכו להרכבת שתי האלקטרודות. בסופו של דבר, האלקטרודה המיוצרת משמשת להקלטות חוץ-תאיות in vivo, שבהן ניתן להחדיר סוכנים פרמקולוגיים לפי הצורך כדי להשפיע על מיקרו-מעגלים עצביים. שלום, שמי ד"ר Achim Klu, והמעבדה שלנו תראה לכם היום כיצד לייצר אלקטרודות רב-חביתיות מסוג piggyback.ניתן להשתמש באלקטרודות אלו כדי להעביר באמצעות אינופור (ionophore) אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים אל המיקרו-סביבה של נוירון, ובכך להפעיל מניפולציה על מעגלים עצביים של נוירון in vivo. שלום, אני ד"ר An Zillow. אני פוסט-דוקטורנט במעבדתו של ד"ר Ah him Crow, והיום אדגים את ההליך. עבור אלקטרודה בעלת חבית אחת, השתמשו בקפילרה מזכוכית בעלת חבית אחת עם פילמנט, ומשכו את הקצה עד לקבלת קוטר של כ-1 עד 2 µm ואורך מוט של 10 עד 12 mm.יש לאמת את ההתנגדות של האלקטרודות שנמשכו מדי פעם על ידי מילואן בנתרן כלורי בריכוז three molar ובדיקתן באמצעות מד Ω סטנדרטי ב-0.9%saline. לאחר מילוי האלקטרודה בתמיסת מלח, התמיסה מתייבשת במהירות, מה שהופך את האלקטרודה לבלתי שמישה. לכן, יש לבצע בדיקה זו בלבד.בצעו משיכה למספר אלקטרודות שלא ישמשו לייצור ה-piggyback. כדי ליצור אלקטרודה רב-חולית מלאה, משכו את הזכוכית עד לקבלת קצה פיפטה בקוטר כולל של כ-10 micrometers או פחות. אלקטרודה בעלת קצה שנמשך כראוי היא קריטית להצלחת התהליך.בנוסף להיותה ארוכה ודקה, הקצה חייב להישאר קשיח על מנת שניתן יהיה לשבור אותו בקלות לקוטר הקצה הרצוי. שבירת הקצה לקוטר הנכון תתבצע בשלב הבא. לכן, גודל הקצה המדויק הוא פחות קריטי במהלך תהליך האיחוד (pooling) מאשר הצורה הכללית של קצה האלקטרודה, שצריכה להיות ארוכה ודקה יחסית.כעת, החזיקו את האלקטרודה בעלת החלולเดียว בזווית של כ-45 מעלות, כאשר הקצה פונה כלפי מטה, והעבירו אותה דרך הלהבה במהירות יחסית. שאפו שהלהבה תמיס את הזכוכית באזור המעבר, במרחק של כ-10 מילימטרים מקצה האלקטרודה, כדי לכופף אותה בזווית של כ-20 מעלות. הניחו את האלקטרודה בעלת החלולים המרובים על מצע של חימר לפיסול על גבי תבנית זכוכית, ולאחר מכן הכניסו אותה לבמות המיקרוסקופ.מחזיק שקופיות באמצעות מניפולטורי ה-XY של במה המיקרוסקופ, הזרקו בעדינות את קצה האלקטרודה כנגד פיסת הפלקסיגלס. עקבו אחר שבירת הקצה דרך העיניות של המיקרוסקופ. הגדרת הרכבת האלקטרודה מוצגת כאן.האלקטרודה רב-חביתית מוחזקת על גבי סלייד זכוכית על שולחן המיקרוסקופ. האלקטרודה בעלת החבית הבודדת מוחזקת על ידי מניפולטור ידני רב-צירי המאפשר למשתמש להוריד את הפ pipette בעלת החבית הבודדת על הפ pipette רב-החביתית בדיוק רב. יש להוריד את האלקטרודה בעלת החבית הבודדת ישירות לתוך החריץ של האלקטרודה רב-החביתית שנוצר על ידי סידור חמש החביות, כך שהקצה שלה בולט מעבר לקצה של האלקטרודה רב-החביתית בכ-5 עד 10 micrometers.הדביקו את מוטות שתי האלקטרודות זו לזו באמצעות ציאנואקרילט. התחילו במיקום המרוחק ביותר מהקצוות והניעו לאט קיסם עם טיפת דבק לאורך מוטות האלקטרודות לכיוון קצותיהן. מריחת דבק קרוב מדי לקצות האלקטרודות תסתימה אותן ותהפוך את האלקטרודה לבלתי תפקודית, לפחות באופן חלקי.ערבבו כמות קטנה של צמנט דנטלי. המתינו כ-15 דקות לייבוש. לאחר מכן, הסירו בזהירות את אלקטרודת ה-piggyback המושלמת.ראשית, נתק מהמחזיק של המיקרו-מניפולטור, ולאחר מכן נתק מהלביה הזכוכיתית. ממש לפני השימוש באלקטרודה, הכן למילוי חוזר (backfill) של כל חבית בתרופה המתאימה לה. מלא את ארבע החביות החיצוניות של תצורת חמש החביות בארבע התרופות הנבחרות, ואת החבית המרכזית בתמיסת sodium chloride בריכוז 3M כחבית איזון.לאחר מכן, מלאו את אלקטרודת ההקלטה בעלת החלול הבודד בנתרן כלורי בריכוז three molar. כעת הפעילו את מודולי משאבת האיון-פרזיס ובחנו את כל החלולים. פונקציית בדיקת האלקטרודה של כל מודול משאבה תסייע לקבוע אם חלול האלקטרודה תקין עבור הקלטות מעומק המוח.אלקטרודה חומש-חביתית גמורה, שהורכבה יחד עם אלקטרודת רישום חד-חביתית, בעלת מוט ארוך של כ-7 מילימטרים. אגוניסטים ואנטגוניסטים סינפטיים שונים משמשים בדרך כלל לאיונטופורזה לצורך חסימת עיכוב גליצין באמצעות תרופות כגון אנטגוניסטים לקולטן הגליצין. Trick nine hydrochloride מגביר בדרך כלל את הפעילות החשמלית בנוירונים.נתוני דגימה אלו מודדים פונקציה של קצב פריקה של נוירונים שמיעתיים לעומת עוצמה, ומראים תגובות לגירויי קול סינוסואידליים בעוצמה עולה שהועברו לאוזני בעל החיים. צלילים חזקים יותר הובילו לקצבי ספייקים גבוהים יותר לפני יישום strict nine. פונקציית קצב-העוצמה של הנוירונים מראה קצבי ספייקים נמוכים.החלת זרם יונטופורזה ראשוני של 15 nano amps מעוררת עלייה קלה בזרם הפליטה. זרמי פליטה גבוהים יותר באופן הדרגתי חוסמים יותר ויותר קולטני גליצין בנוירון, מה שמוביל לקצבי פריקה גבוהים יותר באופן הדרגתי. בזרם של 45 nano amps, נראה כי כל קולטני הגליצין של אותו נוירון נחסמים על ידי strychnine hydrochloride.כל עלייה נוספת בזרם הפליטה ושחרור כמות גדולה יותר של התרופה לא הובילו לשינוי נוסף. פונקציית רמת קצב הפריקה של הנוירונים לאחר סיום האיונטופורזה, התאוששות מלאה של התגובות העצביות חזרה לרמת הבסיס מתרחשת לאחר כ-25 דקות. תהליך התאוששות זה תלוי בסוג ובכמות התרופה שנפלטה.חשוב לזכור כי התרופה תפעפף לסביבת אתר ההקלטה ועשויה לחסום רצפטורים גם בנוירונים סמוכים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לשלב אלקטרודת הקלטה עם אלקטרודת תרופות רב-חביתית כדי להשיג הקלטות עמוקות מהמוח ברמת רעש נמוכה, יחד עם הזרקה מבוקרת בזמן של עד ארבעה סוכנים פרמקולוגיים.

manufacturing-using-piggy-back-multibarrel-electrodes-for-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הטכניקה מתוארת עבור השתלה...

אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג

הבנת המצעים העצביים של ההתנהגות דורשת רישום של אנסמבל מעגלי המוח. בגלל יכולת המעקב הגנטית שלו, העכבר מציע מודל לדיסקציה של מעגלים וחיקוי מחלות. כאן מתוארת שיטה לתכנון וייצור בדיקות ממוזערות המתאימה למיקוד מבנה המוח העמוק בעכבר.

עיצוב וייצור של Ultralight משקל, בדיקות Multi-אלקטרודה מתכוונן לקלטות אלקטרו בעכברים

אנו מדגימים את הייצור, הכיול והתכונות של שני סוגים של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות ליונים (דו-חבית וקונצנטרית) למדידת ריכוזי יונים ברקמת המוח. אלה משמשים לאחר מכן בהכנת פרוסת ההיפוקמפוס של העכבר כדי להראות שפעילות מעוררת משנה הן את ריכוזי האשלגן החוץ-תאי והן את ריכוזי הנתרן.

Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

אנו מציגים שיטות לבניית אלקטרודות לרישום בו זמנית של פעילות עצבית חוץ-תאית ולשחרור חומרים נוירואקטיביים מרובים בקרבת אתרי ההקלטה בעכברים ערים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של קלטים סינפטיים מקומיים משוערים לנוירון המעניין.

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

מחקר זה בוחן את השימוש הרומן מבוססי אנזים microelectrode טכנולוגיית מערך (מאה) כדי לעקוב אחר ויוו עצבי פעילות מטילי יסודי. ההשערה הייתה ש-dysregulation גלוטמט הזה תורם המנגנון של הרדמה neurotoxicity. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להסתגל MEA הטכנולוגיה כדי לחקור את המנגנון של הרדמה-induced neurotoxicity.

עיבוד של טכנולוגיית מערך Microelectrode לחקר הרדמה-induced Neurotoxicity במוח חזרזיר שלם

רשת האלקטרוניקה הגששים להשתלב בצורה חלקה ולספק רמה יציבה, לטווח ארוך, חד-נוירון הקלטה בתוך המוח. פרוטוקול זה משתמש רשת האלקטרוניקה לניסויים ויוו , מעורבים הזיוף של רשת האלקטרוניקה, loading מחטים הזרקת stereotaxic, ממשק קלט/פלט, הקלטה ניסויים, היסטולוגיה של רקמות המכיל רשת הגששים.

מזרק-להזרקה רשת אלקטרוניקה עבור יציב אלקטרופיזיולוגיה מכרסמים כרונית

הצגנו כי תחריט של הננו-ארכיטקטורה לתוך התקנים מיקרו-אלקטרודה תאיים עשוי להפחית את התגובה הדלקתית ויש לו את הפוטנציאל לשפר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. השיטות המתוארות כאן מתווה גישה לחרוט ננו-ארכיטקטורות לפני השטח של מיקרואלקטרודות שאינן תפקודי ופונקציונלי בודד.

ליתוגרפיה של קרן יון ממוקדת לחרוט ננו-ארכיטקטורות למיקרואלקטרודות

פרוטוקול זה מתאר הליך לבניית מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן להקלטות אלקטרופיזיולוגיות כרוניות וחריפות ב- vivo בעכבר(שרירים)וחמוס(Mustela putorius furo) מאזורי מוח מרובים. כל שלב, לאחר רכישת סיבי פחמן גולמיים להשתלת מערך microelectrode, מתואר בפירוט, בדגש על בניית מערך microelectrode.

הקמה ויישום של מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן להקלטות כרוניות וחריפות ב-Vivo

כאן, אנו מציגים שיטה להערכת ביצועים ובטיחות ארוכת טווח של מערכי אלקטרודות תת-דוראליות רכות במודל מיני-חזיר, המתארת שיטות וכלי ניתוח, דימות תהודה מגנטית לאחר הניתוח, אלקטרופיזיולוגיה של קליפת המוח השמיעתית, תכונות אלקטרוכימיות של השתל ואימונוכימיה לאחר המוות.

השתלת מערך אלקטרוקורטיקוגרפיה רכה תת-דוראלית (ECoG) ורישום קליפת המוח לטווח ארוך במיני-חזירים

מטרתנו הייתה לספק מדריך מעודכן וקל למעקב על ייצור ובדיקה של אלקטרודות אלקטרומיוגרפיה אפימיסיאליות. לשם כך, אנו מספקים הוראות למיקור חומרים והדרכה מפורטת של תהליך הייצור והבדיקה.

פיתוח אלקטרודת אלקטרומיוגרפיה אפימיסיאלית בעלות נמוכה: זרימת עבודה פשוטה לייצור ובדיקה

למד לייצור אלקטרודות פיגי-בק רב-לועיות להפעלת תרופות באמצעות יונטופורזיס במעגלים עצביים תוך הקלטת פעילות נוירונים בחי. שיטה זו מאפשרת מניפולציה מדויקת של מיקרו-סביבת נוירונים וחקר תגובות עצביות לסוכנים פרמקולוגיים.

ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל

גלה סרטונים נוספים