Name: הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: למדו לזהות שותפי אינטראקציה של Grb2 בתאי יונקים באמצעות שיבוט ביטוי cDNA ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה בעלת תוכן גבוה. השיטה מאפשרת הדמיה ישירה של שינויים בהתמקמות תת-תאית של GFP-Grb2 בתגובה לחלבונים שותפים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר הרפואי וערכת מארי קירי הבינלאומי Reintegration גרנט (לJKV).

1. בחירת שיבוטי cDNA Expression <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספריית cDNA מסופקת כשיבוטי חיידקים בודדים במניות גליצרול בפורמט 96 היטב. באמצעות פקודת Rearray בתפריט של בורר Norgen CP7200, לאסוף שיבוטי חיידקים מצלחת המקור ולחסן לLB 1.5 מ&quot;ל / מגבר ב96-deepwell (1 מ&quot;ל היטב) צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את צלחות deepwell עם חותם גז חדיר ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס במטרף. </li></ol> 2. הכנת ספריית הביטוי cDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את צלחות deepwell המכילות את החיידקים ב2000 סל&quot;ד במשך 20 דקות באמצעות מתאמי צלחת בצנטריפוגה בראש הטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת מהבארות, ומשאיר את גלולת החיידקים ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הסיפון של תחנת עבודת אוטומצית המעבדה כפי שמוצג באיור 2. פתרונות להכנת פלסמיד מופצים לשקתות 1-5 וצלחת deepwell ממוקמת על הסיפון. שוקת multiwell עם פתרון elutionממוקם בסמוך לצלחת deepwell. טיפים נטענים לתוך מדפי טיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את סעפת הוואקום. הצלחת המחייבת פלסמיד ממוקמת בתוך הסעפת וצלחת מסנן פלסמיד ממוקמת בחלק העליון של הסעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כדורים עם פתרון 250 μl 1 (חיץ Resuspension) על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse את החיידקים על ידי תוספת של 250 פתרוני μl 2 (חיץ תמוגה). הצלחת היא חתומה ומתהפכת כדי לאפשר ערבוב מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת טיימר 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון μl 350 3 (חיץ Neutralisation). לאטום את הצלחת ולהפוך 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysates החיידקים לצלחות סינון פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ואקום למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסנן הצלחת ומניח את הצלחת על גבי הכריכה של הסעפת. החל ואקום לדקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של שטיפה נוספת (AW) חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ואקום עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 900 ​​μl של פתרון חיץ לשטוף 4. החל ואקום עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על זהטפ 2.14. החל ואקום ל15 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צלחת אוסף דנ&quot;א בתוך הסעפת. הוסף 100 μl של חיץ elution לצלחת המחייבת ודגירה במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת צלחת איסוף וריכוז הדנ&quot;א מידת שימוש Nanodrop 8000. בדרך כלל תשואה של ~ 100 ng / μl ניתן לצפות בשיטה זו. </li></ol> 3. זריעת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEK293 תאים trypsinized ונספרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 10 4 תאי x הם חלקו לכל אחד גם מViewplate PerkinElmer באמצעות ThermoFisher 96-multidrop היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מודגרת לילה על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2. </li></ol> 4. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של דנ&quot;א 100 ng-GFP Grb2 פלסמיד עם 100 ננוגרם של cDNA ב25 בינוני μl סרום נטול כל גם בתחתית צלחת 96-גם עגולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 25 תקשורת סרום נטול μl המכילה Transfectin μl 0.5 לטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב ולהתחיל טיימר fo30 דקות r. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 50 μl תמהיל cDNA / Transfectin לתאים באמצעות שיטה מחלק עדינה. לחלופין, תערובת transfection ניתן לוותר אל תוך צלחות ולאחר מכן תאים נוספים בחלק העליון (transfection ההפוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאי לילה על 37 מעלות צלזיוס וCO 2% 5. </li></ol> 5. יבוא תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תוכנת אופרה. תמונת מסך של הגדרת הניסוי מוצגת באיור 3. בחר בכרטיסיית &quot;ההגדרות&quot; ובחר 20x אובייקטיבי וסוג הצלחת הנכונה. ודא &quot;צווארון&quot; מוגדר הערך הנכון במטרה לאפשר להתמקדות בסוגים שונים צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;מיקרוסקופ&quot;. הגדר חשיפת 1 כFITC (488 ליזר) וחשיפה 2 כUV (365 ליזר). הפעל פילטר UV על שתי החשיפות ולהקצות חשיפה 1 עד 1 מצלמה וחשיפה 2 למצלמה 2. הגדרת זמני חשיפה עד 800 אלפיות שניים לחשיפת 1 ו 40 אלפיות לחשיפה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;מיקרוסקופ&quot;. הגדרת דוארxposure 1 כFITC (488 ליזר) וחשיפה 2 כUV (365 ליזר). הפעל פילטר UV על שתי החשיפות ולהקצות חשיפה 1 עד 1 מצלמה וחשיפה 2 למצלמה 2. הגדרת זמני חשיפה עד 800 אלפיות שניים לחשיפת 1 ו 40 אלפיות לחשיפה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חשיפה 1. קבע את המוקד לגובה 0 מיקרומטר. בחר &quot;פוקוס&quot;. ברגע ממוקד, תחשוף מצלמה 1. התאם את גובה המוקד כדי לייעל את מטוס החשיפה ולחץ על &quot;גובה לקחת&quot;. לשנות את זמני החשיפה וכוח הליזר לתת עוצמת פיקסל מקסימלי של ~ 3000. שמור את פרמטרי חשיפה. חזור לחשיפה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;הגדרת ניסוי&quot;. ליצור את הפריסה וsublayout. גרור ושחררת את הפריסה, חשיפה, הפניה לתמונה, קובץ skewcrop הרלוונטי וsublayout. שמור ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;אוטומטית ניסוי&quot; ולרכוש תמונות. </li></ol> 6. ניתוח תמונה (מבוסס על גרסת 1.46h ImageJ.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת PerkinElmer הקניינית. קבצים להגמיש לפורמט תמונה שתייג. Tif קובץ באמצעותתסריט Flex2Volocity Acapella. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא תמונות בImageJ כרצף תמונות, וכתוצאה מהערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את הערימה לערוץ 2 hyperstack ידי בחירת התמונה / Hyperstack / סטאק לפריט תפריט Hyperstack. מספר הפרוסות חייב להיות מוגדר למחצית הערימה המיובאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את ערוץ ה-GFP באמצעות תמונה / פקודה כפולה: סמן את תיבת סימון hyperstack הכפולה ולציין ערוצים: 1-1. להלן ישתמש במחסנית הכפולה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תהליכים / ניגודיות שפר עם פיקסלים רוויים 0.01%, באמצעות היסטוגרמה מחסנית ולהמיר 8 ביט עם Image/Type/8-bit. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר פילוח 15 פיקסל רדיוס מקומי מסתגל באמצעות אלגוריתם Bernsen עם סף ניגוד (פרמטר 1) ש &#39;= 30. סמן את תיבת סימון האובייקטים הלבנים על רקע שחורה בתפריט הסף המקומי / האוטומטית של תמונה / התאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת איכות פילוח: ליצור שכבת קו מתאר אובייקט מפולחת על תמונות המקוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Featuמחדש חילוץ על ידי ניתוח חלקיקים: אזור מדידה, אומר ועצמה כוללת של כל אברון. שמירת קבצי תוצאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ תוצאת התכונות במחקר וליצור היסטוגרמה. </li></ol> 7. נציג תוצאות בתנאים נורמלים Grb2 הוא מקומי בכל רחבי התא. לאחר הגירוי של הקולטן לגורם צמיחה זה translocates לממברנת הפלזמה וגם הופכים להפנים לתוך endosomes כפי שמוצג באיור 4. הביטוי של הקולטן פני תא מסוגל Grb2 המחייב הוא מספיק כדי לגרום לטרנסלוקציה זו. בניסוי הקרנה טיפוסי, לא חל שינוי בלוקליזציה GFP-Grb2 הוא ציין. עם זאת, כאשר חלבון מתבטא שGrb2 מתגייסים לאתר משנה הסלולר, יש שינוי בלוקליזציה שיכולה להיות בקלות דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לדוגמה, ביטוי של תוצאות EGFR בrelocalization של ה-GFP-Grb2 למבני endosome דמויים (איור4). לפיכך, בעת החלת ספרייה הגנום, ניתן לצפות שחלבונים בתא שטח Grb2 מחייב רומן יכולים להיות מזוהים. שיטה זו אינה מוגבלת לזיהוי של חלבונים בתא שטח. לדוגמה, Dynamin2 גורם לשינוי בלוקליזציה משנה הסלולר של ה-GFP-Grb2 הצגת הגיוס endosome דמוי (איור 5). Dynamin2 נקשר לתחום של Grb2 SH3 C-מסוף ומעורב באנדוציטוזה של 9,10 המורכב זו. לפיכך, גישה זו מאפשרת זיהוי של קומפלקסים מחייבים חלבון כלליים ואינו מוגבל לזיהוי של שותפים לאינטראקצית תחום SH2. סוגים שונים של כמה טרנסלוקציה ניתן לצפות כגון לוקליזציה לממברנת הפלזמה, לendosomes, מבנים אחרים cytoplasmic שלפוחי או לגרעין. לכן, מומלץ כי כל התמונות גם נבדקות על ידי עין. עם זאת, כאשר מיון קבוצות גדולות של cDNAs אוטומטיאלגוריתם ניתוח תמונה הוא יותר מעשי. במקרה זה, בשילוב של אלגוריתמים רצוי, כגון זיהוי מקום לזהות זיהוי endosomes, ציטופלסמה / גרעין לזהות אלגוריתמים מורפולוגיים הלוך גרעיניים וכלליים כדי לזהות שינויי צורה סלולריות. השימוש בשיטות זיהוי שונים פנוטיפי אלה נדון בפירוט רב יותר במקום אחר 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> איור 1. תכנית כוללת של הניסוי. פרטי ניסוי זרימת עבודה גבוהת הקרנת תוכן מלאה החל מההגברה והכנת ספריית cDNA, transfection של וקטורי cDNA תוספת בונת כתב, רכישת תמונה וניתוח תמונה באמצעות תוכנת IMAGEJ הפתוח ללא תשלום. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> Figure 2. תצורה של סיפון טקאן. (1) בצד השמאלי, חמש 100 מיליליטר שקתות צריכות להיות מלאה עם חוצצים 1 (40 מ&quot;ל), 2 (40 מ&quot;ל), 3 (50 מ&quot;ל), AW (60 מ&quot;ל) וA4 (100 מ&quot;ל). A4 השוקת יהיה צורך מחדש מולא פעם אחת במהלך ההליך. (2) סעפת הוואקום ממוקמת בעמדה 14 בדוגמה זו. (3) צלחת deepwell עם כדורי חיידקים נמצאת בעמדה 30, ליד שוקת חיץ elution עם חיץ 25 מ&quot;ל elution. (4) טיפים חד פעמים לראש הערוץ 8-צריכים להיות טעונים במדפי טיפ על צד השמאל ועצות לראש רב צריכים להיות מלא בעמדה 40. מטפל נוזל FreedomEvo טקאן המשמש בניסוי זה מצויד עם 500 מזרקי μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> דמות3. אוטומצית רכישה של תמונה על אופרת LX. א) בחר בכרטיסיית התצורה (1). הפעל את קווי הליזר הדרושים לניסוי (2). בחר את המצלמות לרכישת תמונה (3). בחר את סוג הצלחת והעדשה אובייקטיבית לניסוי (4). B) בחר בכרטיסיית מיקרוסקופ (1). הגדר את מקור האור וזמן חשיפה לחשיפת 1 (2,3). להתמקד באחד וגם לקחת גובה (4). ג) בחר בכרטיסיית הגדרת הניסוי (1). גרור ושחררת חשיפה, skewcrop, קבצי sublayout (2) התייחסות, ופריסה. גרור ושחררת את קובץ הניסוי (3). ד) בחר ניסוי אוטומטי (1). גרור ושחררת קובץ ניסוי (2). להקצות ברקוד המתאים (3). התחל רכישת תמונה על ידי לחיצה על הכפתור התחל (4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strong&gt; איור 4. טרנסלוקציה GFP-Grb2 ידי ביטוי cDNA. מיקומם GFP-Grb2 מלוקליזציה cytoplasmic שלטת למבני endosome דמויים על ביטוי יתר של קולטן גורם גדילת הטרנסממברני ולאחר מכן מפנה לendosomes. בצד השמאל, תמונות מיקרוסקופיה של M6 תאי COS מוצגות שtransfected זמנית עם GFP-Grb2 (למעלה) או GFP-Grb2 תוספת EGFR (למטה). שיתוף ביטוי לתוצאות EGFR בהעתקה של ה-GFP-Grb2 למבני endosome דמויים. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> איור 5. דוגמה לטרנסלוקציה cDNA המושרה של GFP-Grb2. GTPase Dynamin2, העוסק באנדוציטוזה Grb2 בתיווך, מיקומם GFP-Grb2 למבני endosome דמויים (מוקף בעיגול). בניסוי זה, GFP-Grb2 היה שיתוף transfected עם DNM2 לתוך תאי HEK293T. תאים הוכתמו Hoechst 33342 אחרי 24 שעות ותמונות נרכשו על אופra LX. תחום אחד מבט של הערוץ הירוק (GFP) ו UV (כחול; Hoechst 33342) מוצג.

<ol><li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li>
<li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr%2FAbl+and+epidermal+growth+factor+receptor%3A+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li>
<li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li>
<li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feynman+trajectories%3A+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li>
<li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li>
<li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22in+Live+Cells.+ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li>
<li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li>
<li>Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789%2C+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li>
<li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Ash%2FGrb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li>
<li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li>
<li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+expression+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיבוט ביטוי הוא כלי רב עצמה שהיה בשימוש בעבר כדי לזהות מרכיבים תאיים רומן כגון קולטנים וירוסים ואנטיגנים תאי דם 12. כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקל על זיהוי של קולטנים רומן משוער אותות transduction אשר נקלטים על Grb2. יש כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת פלסמיד אוטומטית זה בהחלט חיוני שיש resuspension המלא של גלולת החיידקים. לפעמים, יש צורך לכלול צעד קפדני רועד או יותר ערבוב עם pipettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם התוספת של פתרון 2 ו 3, להשלים ערבוב חיוני ומצאנו כי באופן ידני היפוך הצלחת האטומה היא יעילה יותר מאשר השימוש בייקר אוטומטי. Pipetting יש להימנע בשלב זה כי הדבר יוביל להטיה של ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל צעדי הוואקום, יש לוודא שהנוזל סחוט לגמרימהצלחת. תשואות נמוכות אחרת הם צפויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על elution, שזה די נפוץ שeluate טיפי טופס שבתחתית של הצלחת המחייבת פלסמיד. טיפין אלו צריכות להיות שנאספו בצלחת elution, ולכן מומלצים שהצלחת המחייבת פלסמיד הוא הרימה בזהירות וכל טיפין שיורית בתחתית מועברות בזהירות לצלחת eluate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך transfection, עת ההיווצרות מורכבת היא קריטית. אנחנו בדרך כלל לדבוק 20-30 דקות. זמן ארוך יותר של עד 1 h הוא בסדר ללא ירידה בתשואה, ואילו זמנים קצרים אינם מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופיה, הבחירה של גדלה היא חשובה. במערכת LX האופרה משמשת כאן, ברזולוציה של 20x מספיק כדי לקבל תמונות באיכות גבוהה. אם תמונות ברזולוציה גבוהה יותר נדרשות, המטרה יכולה להיות שונה, אבל כדי לקבל מספרים סטטיסטיים משמעותיים של תאים, מספר גבוה יותר של תחומים וזמני רכישה גבוהות יותר נדרשים. באופן כללי, אנו שואפיםכדי לקבל לפחות 100 תאים צפו בי לטוב. </li></ol> Assay טרנסלוקציה Grb2 כבר בשימוש על ידי קבוצות אחרות כדי לזהות מעכבי מולקולה קטנות של הפעלת EGFR קינאז 6. במקרה זה, EGFR מופעל במיוחד עם ליגנד גורם לגיוס Grb2 קרום הפלזמה. שיבוש של אינטראקציה זו ואז ניתן לחקור באמצעות תרכובות מולקולה קטנות. בדומה לכך, ניתן בחזונו כי מסכי siRNA יכולים להיות מועסקים על מנת לזהות גני אנדוגניים מעורבים ב- EGFR Grb2 איתות או קולטנים אחרים Grb2 מחייבים לגורם גדילה, כגון c-KIT או הקולטן אריתרופויאטין. לפיכך, יש יישומים פוטנציאליים רבים לטכניקה זו. גישה אנלוגית יכולה להיות מיושמת על מערכות כתב GFP-tagged למולקולות אחרות כגון מתאם הא&quot;ס, Gab או מס הכנסה. אחד יתרונות עיקריים של שימוש assay המבוסס התא הזה בתאי יונקים הם שהיא מאפשרת זיהוי של rel פיסיולוגיאינטראקציות evant. הבדיקה היא readout להיווצרות חלבון מורכבת, אבל חשוב יותר, האינטראקציות הרלוונטיות מנוטרות באתר הנכון משנה הסלולר. בהקשר זה, בטכניקה זו מתגברת על ממצאים מן שיטות אחרות אינטראקציה בין חלבונים כגון ושתיים היברידי שמרים או במבחני חוץ גופייה. יצוין כי, כי אינטראקציות עקיפות גם עלולות לגרום לגיוס Grb2. בדומה לכך, למעלה בקרת השעתוק של שותפים מחייבים עשויה להיגרם על ידי ביטוי cDNA. כדי להבחין בין האפשרויות הללו, יש צורך לבצע את המבחנים השניים המתאימים כדי להבחין בין השפעות מחייבות ישירות ועקיפות. לסיכום, assay טרנסלוקציה מולקולת GFP-המתאם מבטיח פוטנציאל גבוה להקרנת הגנום ויישומי גילוי סמים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> ספריית cDNA </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + מגבר </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חותמות גז חדיר </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin 96 ערכת פלסמיד </td><td> Macherey-נגל </td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> בדיקות מולקולריות </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> הדסון </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> החופש Evo </td><td> טקאן </td><td></td><td> עם סעפת ואקום </td></tr><tr><td> 384 Multidrop </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> האופרה LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

מעבר אותות על ידי קולטנים של גורמי גדילה חיונית לתאים כדי לשמור על שגשוג והתמיינות ודורש פיקוח הדוק. מעבר אותות הוא שיזם מחייב של יגנד חיצוני לקולט הטרנסממברני והפעלה של מפלי איתות במורד זרם. רגולטור מפתח של mitogenic איתות הוא Grb2, חלבון מודולרית המורכבים מתחום הפנימי SH2 (הומולוגית Src 2) ומשני צדים SH3 תחומים שאין בה פעילות אנזים. Grb2 קשור constitutively עם בן GTPase-Of-Sevenless (SOS) דרך SH3 התחום של N-המסוף. SH2 תחום Grb2 נקשר לקולטנים של גורמי גדילה בשאריות טירוזין phosphorylated כך צימוד ההפעלה קולטנית למפל איתות קינאז SOS-ראס-MAP. בנוסף, תפקידים אחרים לGrb2 כרגולטור חיובי או שלילי של איתות ואנדוציטוזה קולט כבר תארו. ההרכב המודולרי של Grb2 מציע כי ניתן לעגן למגוון של קולטנים וtransducדואר מאותת יחד שפע של מסלולים שונים 1-3. מתואר כאן היא בדיקה מיקרוסקופית פשוטה שמנטרת גיוס Grb2 לממברנת הפלזמה. זה מותאם מבדיקה שמודדת את השינויים בלוקליזציה משנה הסלולר של חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP)-המתויג Grb2 בתגובה לגירוי 4-6. קולטני קרום פלזמה אשר נקלטות Grb2 כגון Factor קולטן הופעל הצמיחה אפידרמיס (EGFR) לגייס GFP-Grb2 לממברנת על ביטוי cDNA ולאחר מכן לעבור לתאי endosomal בתא. על מנת לזהות בקומפלקסי חלבוני vivo של Grb2, טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבצע מסך הגנום גבוה תוכן המבוסס על שינויים בלוקליזציה משנה הסלולר Grb2. הכנת שיבוטי cDNA ביטוי, transfection ורכישת תמונה מתוארת בפירוט בהמשך. בהשוואה לשיטות אחרות הגנומי המשמשות לזיהוי שותפי אינטראקצית חלבון, כמו שמרים והשניים הי&quot;דbrid, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של קומפלקסי חלבונים בתאי יונקים באתר המשנה הסלולר של אינטראקציה על ידי בדיקה מיקרוסקופית מבוססת פשוט. מכאן שתי תכונות איכותיות, כגון דפוסים של לוקליזציה ניתן להעריך, כמו גם את הכח כמותית של האינטראקציה.

שיטת הקרנה גבוהה תוכן לצורך זיהוי של רומן איתות קולטנים הטרנסממברני מוסמכים מתוארת. שיטה זו היא נוחה לאוטומציה בקנה מידה גדולה ומאפשרת תחזיות לגבי<em&gt; In vivo</em&gt; חלבון מחייב ולוקליזציה משנה הסלולר של קומפלקסי חלבונים בתאי יונקים.

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

העברת אותות על ידי קולטני גורמי גדילה חיונית כדי שתאים ישמרו על שגשוג ובידול, והיא דורשת בקרה הדוקה. העברת אותות...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות שותפי אינטראקציה של grab two באמצעות שיטות שיבוט ביטוי של cDNA ותצפית על שינויים ב-Grab two המסומן בחלבון פלואורסצנטי ירוק. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ספריית cDNA מליזאטים בקטריאליים כשלב שני. ה-cDNAs מותעברים לתאי כליה עובריים של בן אדם, דבר שיוביל לביטוי של מבנה הדוחות יחד עם הגנים הנחקרים.בשלב הבא, הפלטות שעברו טרנספקציה נסרקות במיקרוסקופ Opera כדי להדמיא שינויים במיקום של Grab2 בתאים; התוצאות המתקבלות מראות גיוס של Grab2 מתויג GFP לאנדוזומים בתהליך המתווך על ידי קולטן הגדילה האפידרמלי, בהתבסס על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות, כגון Two-hybrid, הוא שניתן לזהות שותפי אינטראקציה של Grab2 במצב פיזיולוגי הלוקח בחשבון את ההפצה התת-תאית של שותפי האינטראקציה.אף על פי שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות העברה של אותות על ידי Grab two, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון חלבונים אחרים בעלי עניין. ספריית ה-CDNA מסופקת כקלונים בקטריאליים בודדים במלאי גליצרול.בפורמט של 96 בארות, באמצעות פקודת re ray בתפריט ה-picker של ה-Hudson Rapid pick light, בצעו picking של קלונים בקטריאליים מלוח המקור והחדירו אותם ל-1.5 milliliters lb amp בלוח 96 בארות עמוקות (deep well plate). אטמו את לוחות הבארות העמוקות באמצעות אטם חדיר לגז והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בשייקר. למחרת, סובבו את לוחות הבארות העמוקות המכילים את הבקטריה ב-2000 RPM למשך 20 דקות.בעזרת מתאמי פלטות בצנטריפוגת שולחנית, שאבו את המצע מהבארים תוך שמירה על משקע החיידקים שלם. לאחר מכן, הגדירו את משטח העבודה של תחנת האוטומציה Tecan Freedom Evo כפי שמוצג כאן. חלקו את התמיסות להכנת פלסמיד לתעלות אחת עד חמש והניחו פלטת בארות עמוקות על משטח העבודה.הנח תג של ריבוי בארות עם תמיסת alucian בסמוך לפלטת הבארות העמוקות וטען טיפים למסנני הטיפים. הרכב את סבב הוואקום (vacuum manifold). פלטת קישור הפלסמיד מונחת בתוך הסבב ופלטת סינון הפלסמיד מונחת מעליו. בצע רספנסיה (Resuspend) לכדוריות בעזרת 250 µL של תמיסה אחת.יש לערבב את תמיסת ה-Resus על ידי פיפוט מעלה ומטה. וידוא שהמשקעים הומסו לחלוטין הוא קריטי להצלחת הפרוצדורה. ניתן להשתמש במנער (shaker) אם פיפוט מעלה ומטה אינו ממיס את המשקע באופן מלא.לאחר שהמשקעים הושחאו לחלוטין, יש לליית את החיידקים על ידי הוספת 250 µL של תמיסת lysis buffer. יש לאטום את הפלטה ולהפוך אותה כדי לאפשר ערבוב מלא. הגדירו טיימר לשתי דקות.בשלב הבא, הוסיפו 350 µL מתמיסה שלוש, באפר הניטרול. אטמו את הפלטה והפכו אותה שלוש פעמים.העבר את הליזטים הבקטריאליים לפלטות הסינון של הפלסמיד. הפעל ואקום למשך חמש דקות. הסר את פלטת הסינון והנח את פלטת הקישור על גבי המניפולד.יש להפעיל ואקום למשך דקה אחת. יש להוסיף 500 µL של תמיסת שטיפה נוספת ולהפעיל ואקום למשך שתי דקות. יש להוסיף 900 µL של תמיסת שטיפה 4 ולהפעיל ואקום למשך שתי דקות.לאחר מכן, הוסף שוב 900 microliters של תמיסת wash buffer solution four והחל vacuum למשך 15 דקות. הנח את לוחית איסוף ה-DNA בתוך ה-manifold. הוסף 100 microliters של Elucian buffer ללוחית הקישור והדגר למשך שתי דקות.יש להפעיל ואקום למשך 10 דקות. לבסוף, יש להוציא את פלטת האיסוף ולמדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות NanoDrop 8, 000. בדרך כלל ניתן לצפות לתשואה של כ-100 nanograms per microliter בשיטה זו כדי להתחיל בהליך זה.לאחר שהתאי hec 2 9 3 עברו טריפסינציה וספירה, השתמש במפיץ אוטומטי כדי להעביר 2×10⁴ תאים לכל באער של פלטת Perkin Elmer. דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide לצורך טרנספקציה.השתמש במערכת לאוטומציה של טיפול בנוזלים כדי להכין בכל באער של פלטה עם 96 באערים בעלת תחתית עגולה את התערובת הבאה: 100 nanograms של GFP. קח שני plasmid DNA עם 100 nanograms של CD NA ב-25 microliters של מצע ללא סרום. לאחר מכן, הוסף 25 microliters של מצע ללא סרום המכיל 0.5 microliters transfect לכל באער, ערבב והפעל את הטיימר ל-30 דקות.לאחר 30 דקות, העבר 50 µL מתערובת הטרנספקציה של ה-CDNA אל התאים, תוך שימוש בשיטת חלוקה עדינה. דגרי את התאים למשך לילה ב-37 °C וב-5% CO2.כדי להתחיל ברכישת תמונות, הפעל את תוכנת ה-opera. בחר בלשונית התצורה (configuration) ובחר בעדשה פי 20 ובסוג הפלטה הנכון. ודא שהטבעת (collar) בעדשה מכוונת לערך הנכון כדי לאפשר מיקוד עם סוגי פלטות שונים.בשלב הבא, בחרו בלשונית המיקרוסקופ. הגדירו את החשיפה הראשונה (exposure one) כ-fite 4 88 laser ואת החשיפה השנייה (exposure two) כ-UV 365 laser. הפעילו את מסנן ה-UV בשתי החשיפות ובצעו השמה של החשיפה.חבר את אחד למצלמה אחת ולחשיפה. חבר את שני למצלמה שתיים. הגדר זמני חשיפה ל-800 milliseconds עבור חשיפה 1, ו-40 milliseconds עבור חשיפה 2.שנית, בחרו בחשיפה, וקבעו את גובה המיקוד לאפס מיקרונים. בחרו במיקוד לאחר שההתמקדות הושלמה. חשפו את מצלמה אחת.כווננו את גובה המיקוד כדי למטב את מישור החשיפה ולחצו על take height. שמרו את פרמטרי החשיפה וחזרו על הפעולה עבור חשיפה שתיים. בחרו בלשונית הגדרת הניסוי (experiment definition), צרו פריסה (layout) ופריסת משנה (sub layout).גררו ושחררו את הפריסה הרלוונטית, החשיפה, תמונת הייחוס, הסטייה (skew), קובץ החיתוך והתת-פריסה. שמרו את הניסוי. בחרו בלשונית הניסוי האוטומטי ורכשו תמונות בתנאים רגילים.Grab two ממוקם לאורך התא כולו. בעקבות גירוי של קולטן לגורם גדילה, הוא עובר translocation לממברנת הפלזמה ולאחר מכן מופנם אל תוך אנדוזומים. באיור זה, הפאנל העליון מראה תאי CO M six שעברו טרנספקציה זמנית עם GFP grab two, וכצפוי, הפלואורסצנציה מפוזרת בכל רחבי התא.עם זאת, בתאים שעברו טרנספקציה זמנית עם GFP-grab2 ועם הקולטן על פני השטח של התא EGFR, חלבון grab2 ממוקם מחדש למבנים דמויי אנדוזום, כפי שמוצג בפאנל התחתון. לכן, בעת יישום של ספרייה רחבת גנום, ניתן לצפות שניתן יהיה לזהות חלבוני פני שטח של התא חדשים הנקשרים ל-grab2. שיטה זו אינה מוגבלת לזיהוי של חלבוני פני שטח של התא.לדוגמה, ה-DYNAMIN two של ה-GPA, המעורב באנדוציטוזה המתווכת על ידי grab two, גורם לטרנסלוקציה של grab two. בניסוי זה, GFP grab two הוטרנספקט יחד עם DNM two לתאי HEC 2 93 T. ניודו של GFP grab two למבנים דמויי אנדוזום מודגם על ידי התאים בתוך העיגולים האדומים.בעקבות נוהל זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון אימונופרסיפיטציה (immunoprecipitation) או בדיקות ביוכימיות, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם האינטראקציה היא ישירה או עקיפה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי השימוש בשיטת שיבוט לביטוי (expression cloning) לצורך זיהוי אינטראקציות של חלבונים בתת-התא.

a-high-content-imaging-workflow-to-study-grb2-signaling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה כדי לקבוע את התגובה chemotactic של לויקוציטים אל ligands ספציפיים לזהות אינטראקציות בין משטח קולטני התא וחלבונים cytosolic באמצעות טכניקות הדמיה תא חי.

בזמן אמת הדמיה של leukotriene B 4 Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

אנו מתארים שיטת הדמיה לחיות תאים המספקת תובנה דינמיקת חלבון במהלך תהליך תא T ההפעלה. אנו מדגימים את השימוש בשילוב של הפצת assay תא T, מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה להניב תוצאות כמותיות לעקוב איתות היווצרות מורכבת לאורך כל הפעלת תא T.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מוצגים הוא עבודה אינפורמטיקה גמישה המאפשרת ניתוח מבוסס תמונת ריבוב של תאים שכותרתו fluorescently. העבודה מכמתת סמנים גרעיניים וcytoplasmic ומחשבה טרנסלוקציה סמן בין תאים אלה. נהלים מסופקים ההפרעות של תאים באמצעות siRNA ומתודולוגיה אמינה לגילוי סמן על ידי immunofluorescence העקיף בפורמטי 96-היטב.

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

אינטראקציות חלבון-חלבון מוצגות בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטרית על ידי שילוב של השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) עם מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-אקטיבי (PALM). מתואר כאן השימוש ב-BiFC-PALM להדמיית אינטראקציות Ras-Raf בתאי U2OS להמחשת אשכולות ודיפוזיה בקנה מידה ננומטרי של קומפלקסים בודדים של Ras-Raf.

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

כאן אנו מציגים פרוטוקול תאים התמונה להביע קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין-tagged חלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה ביוזמת טיפול אנגיוטנסין II. טכניקה זו כוללת lysosomes תיוג עם סמן פלואורסצנטי שני, ולאחר מכן ניצול תוכנה לנתח את שיתוף הלוקליזציה של הקולטן ליזוזום בשלושה ממדים לאורך זמן.

הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

למדו לזהות שותפי אינטראקציה של Grb2 בתאי יונקים באמצעות שיבוט ביטוי cDNA ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה בעלת תוכן גבוה. השיטה מאפשרת הדמיה ישירה של שינויים בהתמקמות תת-תאית של GFP-Grb2 בתגובה לחלבונים שותפים.

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

גלה סרטונים נוספים