הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות שותפי אינטראקציה של Grab two על ידי שיבוט ביטוי CD NA ותצפית על שינויים בחלבון פלואורסצנטי ירוק המתויג Grab two. זה מושג על ידי הכנת ספריית CD NA מליזטים חיידקיים כשלב שני. ה-CDNAs עוברים טרנספטציה בתאי כליה עובריים אנושיים, מה שיביא לביטוי של מבנה המדווח יחד עם הגנים המעניינים.

לאחר מכן, הלוחות המועברים מנותחים במיקרוסקופ האופרה על מנת לדמיין שינויים בתפיסת שני לוקליזציה ברחבי התאים, מתקבלות תוצאות המראות גיוס מתווך של קולטן גורם גדילה אפידרמלי של GFP מתויג. תפוס שניים לאנדוזומים על סמך מיקרוסקופ פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות כמו שתי ההיברידיות הללו הוא שניתן לזהות שותפי אינטראקציה של לתפוס שניים במצב פיזיולוגי שלוקח בחשבון את ההתפלגות התת-תאית של שותפי האינטראקציה.

ובכן, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות העברת אותות על ידי Grab two. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון חלבונים אחרים מעניינים. ספריית ה-CDNA מסופקת שיבוטי חיידקים בודדים במלאי הגליצרול.

בפורמט של 96 בארות באמצעות פקודת הקרן מחדש בתפריט הבורר של נורית הבחירה של הדסון ראפיד. בחר שיבוטי חיידקים מלוח המקור וחסן למגבר של 1.5 מיליליטר פאונד בצלחת באר עמוקה של 96. אטום מאוחר את לוחות הבאר העמוקים עם אטם חדיר גז ודגירה למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס בשייקר למחרת, סובב את לוחות הבאר העמוקים המכילים את החיידקים A 2000 סל"ד למשך 20 דקות.

באמצעות מתאמי צלחות בצנטריפוגה שולחנית, שאב מדיה מהבארות והשאיר את גלולת החיידקים שלמה. לאחר מכן, הגדר את הסיפון של תחנת העבודה Tecan Freedom Evo Automation כפי שמוצג כאן. מחלקים פתרונות להכנת פלסמיד לשקתות אחת עד חמש ומניחים צלחת באר עמוקה על הסיפון.

הנח שוקת מרובת בארות עם תמיסה אלוסית בסמוך לקצות העומס של צלחת הבאר העמוקה לתוך מדפי הקצה. הרכיבו את סעפת הוואקום. לוחית קשירת הפלסמיד ממוקמת בתוך הסעפת וצלחת מסנן הפלסמיד מונחת על גבי כדורי ההשעיה של סעפת Resus עם 250 מיקרוליטר של תמיסה אחת.

מאגר המתלים של Resus על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הקפדה על תליית הכדורים לחלוטין היא קריטית להצלחת הליך זה. ניתן להשתמש בשייקר אם ליטוף למעלה ולמטה אינו משהה את הכדור לחלוטין.

לאחר שהכדורים מושעים לחלוטין שוכבים החיידקים על ידי הוספת 250 מיקרוליטר של תמיסה למאגר הליזה. אוטמים את הצלחת והופכים כדי לאפשר ערבוב מלא. הגדר טיימר לשתי דקות.

לאחר מכן, הוסף 350 מיקרוליטר של תמיסה שלוש. מאגר הנטרול. אוטמים את הצלחת והופכים שלוש פעמים קווים.

העבירו את הליזטים החיידקיים ללוחות מסנן הפלסמיד. מרחו ואקום למשך חמש דקות. הסר את לוחית המסנן והנח את לוחית הכריכה על גבי הסעפת.

מרחו ואקום למשך דקה אחת. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה נוסף והחל ואקום למשך שתי דקות. הוסף 900 מיקרוליטר של תמיסת חיץ כביסה ארבע והחל ואקום למשך שתי דקות.

לאחר מכן, הוסף שוב 900 מיקרוליטר של תמיסת חיץ כביסה ארבע והחל ואקום למשך 15 דקות. הנח את לוחית איסוף ה- DNA בתוך הסעפת. מוסיפים 100 מיקרוליטר של מאגר אלוסיאני לצלחת הכריכה ודוגרים במשך שתי דקות.

מרחו ואקום למשך 10 דקות. לבסוף, הסר את לוחית האיסוף ומדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות NanoDrop 8, 000. בדרך כלל ניתן לצפות לתפוקה של כ-100 ננוגרם למיקרוליטר בשיטה זו כדי להתחיל בהליך זה.

לאחר hec 2 9 3 תאים עוברים טריפסים, מבודדים ונספרים. השתמש במתקן אוטומטי כדי להוציא פעמיים 10 לארבעת התאים לכל באר של פרקין אלמר. צפה בתאי דגירה של צלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לטרנספקציה.

השתמש במטפל הנוזלים האוטומטי כדי להכין את התערובת הבאה בכל באר של תחתית עגולה 96, צלחת באר 100 ננוגרם של GFP. תפוס שני DNA פלסמיד עם 100 ננוגרם של CD NA ב -25 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום המכילה 0.5 מיקרוליטר transfect לכל תערובת באר והפעל את הטיימר למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, העבירו 50 מיקרוליטר ב-CDNA transfect בתערובת לתאים. בשיטת חלוקה עדינה. דגירה על תאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

כדי להתחיל ברכישת תמונות, הפעל את תוכנת האופרה. בחר בכרטיסיית התצורה ובחר את המטרה פי 20 ואת סוג הצלחת הנכון. ודא שהצווארון מוגדר לערך הנכון במטרה כדי לאפשר התמקדות בסוגי צלחות שונים.

לאחר מכן, בחר בכרטיסיית המיקרוסקופ. הגדר חשיפה אחת כלייזר fite 4 88 וחשיפה שתיים כלייזר UV 365. הפעל את מסנן ה-UV בשתי החשיפות והקצה חשיפה.

אחד למצלמה אחת וחשיפה. שניים למצלמה שתיים. הגדר את זמני החשיפה ל-800 אלפיות השנייה לחשיפה, אחת ו-40 אלפיות השנייה לחשיפה.

שתיים, בחר חשיפה, אחד הגדר את גובה המיקוד לאפס מיקרון. בחר מיקוד לאחר המיקוד. חשוף את המצלמה הראשונה.

התאם את גובה המיקוד כדי לייעל את מישור החשיפה ולחץ על גובה צילום. שמור פרמטרי חשיפה, חזור על הפעולה לחשיפה. שתיים, בחר בכרטיסיית הגדרת ניסוי, צור פריסה ופריסת משנה.

גרור ושחרר את הפריסה, החשיפה, תמונת ההתייחסות, ההטיה, קובץ החיתוך ופריסת המשנה הרלוונטיים. שמור את הניסוי. בחר לשונית ניסוי אוטומטית וקבל תמונות בתנאים רגילים.

Grab two ממוקם בכל התא. עם גירוי של קולטן גורם גדילה, הוא עובר לקרום הפלזמה ולאחר מכן מופנם לאנדוזומים. באיור זה, הפאנל העליון מראה CO M שישה תאים שעברו טרנספטציה חולפת עם GFP תופס שניים, וכצפוי, הקרינה מופצת בכל התא.

עם זאת, בתאים שעברו טרנספטציה חולפת עם GFP תפוס שניים בתוספת קולטן פני התא IT EGFR לתפוס שני רילוקיישן למבנים דמויי אנדוזום כפי שמוצג בפאנל התחתון. לפיכך, בעת יישום ספרייה רחבה של הגנום, ניתן לצפות שניתן לזהות שני חלבונים חדשים על פני התא. שיטה זו אינה מוגבלת לזיהוי חלבונים על פני התא.

לדוגמה, ה-DYNAMIN 2 של ה-GPA, המעורב באנדוציטוזיס מתווך של אחיזה שתיים, גורם לטרנסלוקציה של אחיזה שתיים. בניסוי זה, GFP grab two הועבר עם DNM 2 לתאי HEC 2 93 T. המעבר של GFP לתפוס שניים למבנים דמויי אנדוזום מודגם על ידי התאים בתוך העיגולים האדומים.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו משקעים חיסוניים או בדיקות ביוכימיות כדי לענות על שאלות נוספות כגון האם האינטראקציה ישירה או עקיפה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשיבוט ביטוי על מנת לזהות אינטראקציות חלבון תת-תאיות.