הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות שותפי אינטראקציה של grab two באמצעות שיטות שיבוט ביטוי של cDNA ותצפית על שינויים ב-Grab two המסומן בחלבון פלואורסצנטי ירוק. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ספריית cDNA מליזאטים בקטריאליים כשלב שני. ה-cDNAs מותעברים לתאי כליה עובריים של בן אדם, דבר שיוביל לביטוי של מבנה הדוחות יחד עם הגנים הנחקרים.

בשלב הבא, הפלטות שעברו טרנספקציה נסרקות במיקרוסקופ Opera כדי להדמיא שינויים במיקום של Grab2 בתאים; התוצאות המתקבלות מראות גיוס של Grab2 מתויג GFP לאנדוזומים בתהליך המתווך על ידי קולטן הגדילה האפידרמלי, בהתבסס על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות, כגון Two-hybrid, הוא שניתן לזהות שותפי אינטראקציה של Grab2 במצב פיזיולוגי הלוקח בחשבון את ההפצה התת-תאית של שותפי האינטראקציה.

אף על פי שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות העברה של אותות על ידי Grab two, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון חלבונים אחרים בעלי עניין. ספריית ה-CDNA מסופקת כקלונים בקטריאליים בודדים במלאי גליצרול.

בפורמט של 96 בארות, באמצעות פקודת re ray בתפריט ה-picker של ה-Hudson Rapid pick light, בצעו picking של קלונים בקטריאליים מלוח המקור והחדירו אותם ל-1.5 milliliters lb amp בלוח 96 בארות עמוקות (deep well plate). אטמו את לוחות הבארות העמוקות באמצעות אטם חדיר לגז והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בשייקר. למחרת, סובבו את לוחות הבארות העמוקות המכילים את הבקטריה ב-2000 RPM למשך 20 דקות.

בעזרת מתאמי פלטות בצנטריפוגת שולחנית, שאבו את המצע מהבארים תוך שמירה על משקע החיידקים שלם. לאחר מכן, הגדירו את משטח העבודה של תחנת האוטומציה Tecan Freedom Evo כפי שמוצג כאן. חלקו את התמיסות להכנת פלסמיד לתעלות אחת עד חמש והניחו פלטת בארות עמוקות על משטח העבודה.

הנח תג של ריבוי בארות עם תמיסת alucian בסמוך לפלטת הבארות העמוקות וטען טיפים למסנני הטיפים. הרכב את סבב הוואקום (vacuum manifold). פלטת קישור הפלסמיד מונחת בתוך הסבב ופלטת סינון הפלסמיד מונחת מעליו. בצע רספנסיה (Resuspend) לכדוריות בעזרת 250 µL של תמיסה אחת.

יש לערבב את תמיסת ה-Resus על ידי פיפוט מעלה ומטה. וידוא שהמשקעים הומסו לחלוטין הוא קריטי להצלחת הפרוצדורה. ניתן להשתמש במנער (shaker) אם פיפוט מעלה ומטה אינו ממיס את המשקע באופן מלא.

לאחר שהמשקעים הושחאו לחלוטין, יש לליית את החיידקים על ידי הוספת 250 µL של תמיסת lysis buffer. יש לאטום את הפלטה ולהפוך אותה כדי לאפשר ערבוב מלא. הגדירו טיימר לשתי דקות.

בשלב הבא, הוסיפו 350 µL מתמיסה שלוש, באפר הניטרול. אטמו את הפלטה והפכו אותה שלוש פעמים.

העבר את הליזטים הבקטריאליים לפלטות הסינון של הפלסמיד. הפעל ואקום למשך חמש דקות. הסר את פלטת הסינון והנח את פלטת הקישור על גבי המניפולד.

יש להפעיל ואקום למשך דקה אחת. יש להוסיף 500 µL של תמיסת שטיפה נוספת ולהפעיל ואקום למשך שתי דקות. יש להוסיף 900 µL של תמיסת שטיפה 4 ולהפעיל ואקום למשך שתי דקות.

לאחר מכן, הוסף שוב 900 microliters של תמיסת wash buffer solution four והחל vacuum למשך 15 דקות. הנח את לוחית איסוף ה-DNA בתוך ה-manifold. הוסף 100 microliters של Elucian buffer ללוחית הקישור והדגר למשך שתי דקות.

יש להפעיל ואקום למשך 10 דקות. לבסוף, יש להוציא את פלטת האיסוף ולמדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות NanoDrop 8, 000. בדרך כלל ניתן לצפות לתשואה של כ-100 nanograms per microliter בשיטה זו כדי להתחיל בהליך זה.

לאחר שהתאי hec 2 9 3 עברו טריפסינציה וספירה, השתמש במפיץ אוטומטי כדי להעביר 2×10⁴ תאים לכל באער של פלטת Perkin Elmer. דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide לצורך טרנספקציה.

השתמש במערכת לאוטומציה של טיפול בנוזלים כדי להכין בכל באער של פלטה עם 96 באערים בעלת תחתית עגולה את התערובת הבאה: 100 nanograms של GFP. קח שני plasmid DNA עם 100 nanograms של CD NA ב-25 microliters של מצע ללא סרום. לאחר מכן, הוסף 25 microliters של מצע ללא סרום המכיל 0.5 microliters transfect לכל באער, ערבב והפעל את הטיימר ל-30 דקות.

לאחר 30 דקות, העבר 50 µL מתערובת הטרנספקציה של ה-CDNA אל התאים, תוך שימוש בשיטת חלוקה עדינה. דגרי את התאים למשך לילה ב-37 °C וב-5% CO2.

כדי להתחיל ברכישת תמונות, הפעל את תוכנת ה-opera. בחר בלשונית התצורה (configuration) ובחר בעדשה פי 20 ובסוג הפלטה הנכון. ודא שהטבעת (collar) בעדשה מכוונת לערך הנכון כדי לאפשר מיקוד עם סוגי פלטות שונים.

בשלב הבא, בחרו בלשונית המיקרוסקופ. הגדירו את החשיפה הראשונה (exposure one) כ-fite 4 88 laser ואת החשיפה השנייה (exposure two) כ-UV 365 laser. הפעילו את מסנן ה-UV בשתי החשיפות ובצעו השמה של החשיפה.

חבר את אחד למצלמה אחת ולחשיפה. חבר את שני למצלמה שתיים. הגדר זמני חשיפה ל-800 milliseconds עבור חשיפה 1, ו-40 milliseconds עבור חשיפה 2.

שנית, בחרו בחשיפה, וקבעו את גובה המיקוד לאפס מיקרונים. בחרו במיקוד לאחר שההתמקדות הושלמה. חשפו את מצלמה אחת.

כווננו את גובה המיקוד כדי למטב את מישור החשיפה ולחצו על take height. שמרו את פרמטרי החשיפה וחזרו על הפעולה עבור חשיפה שתיים. בחרו בלשונית הגדרת הניסוי (experiment definition), צרו פריסה (layout) ופריסת משנה (sub layout).

גררו ושחררו את הפריסה הרלוונטית, החשיפה, תמונת הייחוס, הסטייה (skew), קובץ החיתוך והתת-פריסה. שמרו את הניסוי. בחרו בלשונית הניסוי האוטומטי ורכשו תמונות בתנאים רגילים.

Grab two ממוקם לאורך התא כולו. בעקבות גירוי של קולטן לגורם גדילה, הוא עובר translocation לממברנת הפלזמה ולאחר מכן מופנם אל תוך אנדוזומים. באיור זה, הפאנל העליון מראה תאי CO M six שעברו טרנספקציה זמנית עם GFP grab two, וכצפוי, הפלואורסצנציה מפוזרת בכל רחבי התא.

עם זאת, בתאים שעברו טרנספקציה זמנית עם GFP-grab2 ועם הקולטן על פני השטח של התא EGFR, חלבון grab2 ממוקם מחדש למבנים דמויי אנדוזום, כפי שמוצג בפאנל התחתון. לכן, בעת יישום של ספרייה רחבת גנום, ניתן לצפות שניתן יהיה לזהות חלבוני פני שטח של התא חדשים הנקשרים ל-grab2. שיטה זו אינה מוגבלת לזיהוי של חלבוני פני שטח של התא.

לדוגמה, ה-DYNAMIN two של ה-GPA, המעורב באנדוציטוזה המתווכת על ידי grab two, גורם לטרנסלוקציה של grab two. בניסוי זה, GFP grab two הוטרנספקט יחד עם DNM two לתאי HEC 2 93 T. ניודו של GFP grab two למבנים דמויי אנדוזום מודגם על ידי התאים בתוך העיגולים האדומים.

בעקבות נוהל זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון אימונופרסיפיטציה (immunoprecipitation) או בדיקות ביוכימיות, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם האינטראקציה היא ישירה או עקיפה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי השימוש בשיטת שיבוט לביטוי (expression cloning) לצורך זיהוי אינטראקציות של חלבונים בתת-התא.