Name: עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט באתר הכלאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: למדו שיטה לניתוח כמותי של עיתוי שכפול כרומוזומים באמצעות שילוב BrdU ו-FISH. השיטה מאפשרת השוואה ישירה בין כרומוזומים מסודרים מחדש ללא מסודרים באותה התא, ומספקת תובנות לגבי יציבות גנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לסרטן, CA131967.

1. התאגדות BrdU (סימון מסוף) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פלייט לכ 70% במפגש 24 שעתי 150 מ&quot;מ רקמת תרבות צלחת לפני התוספת של BrdU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת עם תקשורת מלאה טריה המכילה 20 מיקרוגרם / המ&quot;ל BrdU (סיגמא) בנקודתי זמן מתאימות לפני הקציר. אורכם של תאים בתרבית בזמן שתקשורת עם BrdU ישתנה עם סוג תא ומין, בדרך כלל שלב G2 נמשך בין 2 ל 5 שעות (איור 1). </li></ol> 2. קציר כרומוזום תרבויות תאי Monolayer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת תרבות מהצלחת ולאסוף 10 מ&quot;ל בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ&quot;ל. השלך תקשורת נותרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ&quot;ל Versine [או HBSS (סיגמא)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מ&quot;ל טריפסין 0.25% 5 בVersine (או HBSS) לצלחת. דגירה בטמפרטורת חדר עד שתאים מנותקים מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעית התא trypsinized לצינור המכיל 10 מ&quot;ל של תקשורת מצעד 2.1. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 400 למשך 10 דקות לגלולת התאים. לשאוב supernatant, והשאיר 0.5 מ&quot;ל של תקשורת בתוספת התא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ביסודיות על ידי pipetting עם פסטר פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 טיפין של תמיסת hypotonic (0.075 M KCl (סיגמא) חמם עד 37 מעלות צלזיוס): מערבב את השעית התא עם פסטר פיפטה. הוסף פתרון hypotonic מ&quot;ל 0.5 ולערבב שוב עם פסטר פיפטה. להביא נפח של פתרון hypotonic עד 5 מ&quot;ל ומערבב שוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-45 דקות, תלוי בסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 400 למשך 10 דקות. לשאוב supernatant, והשאיר 0.5 מ&quot;ל של תקשורת בתוספת התא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא הגלול ידי מצליף את הצינור בעדינות. התאים אוסמוטי הנפוחים יהיו שבירים בנקודה זו, ולכן יש להיזהר שלא לפגוע בקרומי cytoplasmic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 טיפין (החומצה אצטית קרחונית 01:03: מתנול) של Carnoy מקבעת; לערבב ידי pipetting בעדינות עם פסטר pipettדואר. הוסף מקבע ותמהיל מ&quot;ל 0.5 על ידי pipetting בעדינות עם פסטר פיפטה. הבא נפח מקבע ל5 מ&quot;ל ולערבב שוב על ידי pipetting בעדינות עם פסטר פיפטה. תאים קבועים ניתן לאחסן בחושך ב -20 ° C למשך מספר חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ולשאוב כמו בשלב 2.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלול ב מקבע טרי; לאמוד את ההיקף של הגלולה ותוספת ~ 10x הנפח מקבע של Carnoy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעית התא נפתח החכמה על שקופיות מיקרוסקופ רטובות, קרות כקרח, להחזיק את השקופית ב~ זווית 45 מעלות ומאפשר השעית התא לזרום על פני השטח של השקופית. הנח את השקף והמבול השטוח על מגבות נייר השקופית עם מקבע ומאפשר לייבוש באוויר. בדקו שקופיות לנוכחות של ממרחי mitotic באמצעות מיקרוסקופ הפוך. </li></ol> 3. טיפול RNase והתייבשות אתנול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl המקום של 10 מיקרוגרם / מיליליטר RNase (סיגמא) ב2x SSC לכל שקופית; לדגור על 37 ודהז; צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפים מחליקים 3 פעמים עם 2x SSC, 7.0 pH בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש שקופיות באמצעות סדרת EtOH (סיגמא) (70%, 90% ו 100%) בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש את השקופיות בטמפרטורת חדר. </li></ol> 4. הכנת קוקטיילים לבדיקת BAC פלוס הפקידה Probe centromere כרומוזום ספציפי (CEP) או לצבעי כרומוזום שלמים כלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכלאת סימולטני BAC / CEP, להכין שני קוקטיילי בדיקה נפרדים עבור מראש הכלאה. אנחנו גילינו שטרום הכלאה-בדיקות BAC וCEP בנפרד במסגרת תוצאות חומרות שונות ברקע פחות ועוצמת אות גדולה יותר. גם אנחנו גילינו שFosmids הבודד יכולה לשמש גם במקום של שיבוטי BAC. ניסוח הקוקטייל יתואר להלן מייצג את הכרכים עבור שקופית אחת. אם עיבוד שקופיות מרובות המשתמשות באותן בדיקות פשוט להגדיל appropr הכרכים<html> iately. * קוקטייל בדיקת DNA BAC: חיץ ההכלאה μl 11.5 (פוראמיד 50% (סיגמא) / סולפט 2x SSC / dextran (סיגמא)) 2 μl DH 2 O 2.5 BAC/Cot1 DNA μl בDH 2 O (ראה בהמשך לתיוג פרוטוקול) 15 נפח כולל μl * קוקטייל CEP בדיקה: חיץ 7 μl CEP הכלאה (65% סולפט Formamide/2x SSC / dextran) 2 μl DH 2 O דנ&quot;א 1 μl CEP/Cot1 (נרכש prelabeled עם ספקטרום Orange/Cy3/Texas אדום) 10 נפח כולל μl * לאחר denaturing והכלאה מראש (צעד 5.1) תמהיל BAC חללית עם CEP חללית במהירות של 25 קוקטיילי יחס 03:02 μl / שקופיות ותמהיל בדיקה. או </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 20 μl / שקופית של חללית צביעת כרומוזום שלמה (Cy3/Texas האדום) לתוך צינור. המשך אל denaturation וצעד מראש הכלאה. </li></ol><html> &quot;&gt; 5. שקופיות וdenaturation Probe וכלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל חללית קוקטייל (הים) ב 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. טרום להכליא על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר Cot1 DNA כדי להכליא לרצפים חוזרים ולמנוע הכלאה לאחר metaphase כרומוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות לפגל בצנצנות Coplin ב70% Formamide/2x SSC, 7.0 pH ב 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד מייבש שקופיות באמצעות EtOH סדרה (70%, 90% ו 100%) בצנצנות Coplin ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את השקופיות לייבוש באוויר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות טרום חמות עד 45 מעלות צלזיוס בשקופית חמה עבור 10 הדקות האחרונות של טרום hybridzation (שלב 5.1) הבדיקה. לערבב קוקטיילי בדיקה מראש הכלאה במידת הצורך ולהוסיף 25 ul לכל שקופית, מניח בעדינות coverslip בכל שקופית וחותם לאורך כל הקצוות עם מלט גומי. דגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified כדי למנוע אידוי. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. הכלאת הודעת שוטף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות בצנצנות Coplin 3 פעמים ב50% formamide/2x SSC, 7.0 pH ב 38-40 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כל אחד. הטמפרטורה של הכביסות שעשויה להשתנות בין בדיקות. אם יש הכלאת רקע גבוהה אתה יכול להעלות את הטמפרטורה של הכביסות. לעומת זאת, אם האות היא קלושה ואין רקע אז אתה יכול להקטין את הטמפרטורה של שטיפות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפים מחליקים פעם 1 בחיץ PN בטמפרטורת חדר עבור 3 דקות, ולהמשיך לשלב איתור BrdU. </li></ol> 7. BrdU איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות בלוק עם חיץ PNM למשך 10 דקות (200 μl / שקופיות) בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן שקופיות על ידי הפעלת יתרון על מגבת נייר. הוסף 100 μl של אנטי-BrdU FITC (50 מיקרוגרם / מיליליטר רוש או Millipore) בחיץ PNM למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות 3 פעמים בחיץ PN בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקזחיץ PN עודף על שקופיות אחד בכל פעם על ידי הפעלת יתרון על מגבת נייר. הוסף 20 DAPI μl / הרכבת פתרון antifade (Invitrogen). כסה את השקופית עם מגבת נייר ולחץ כלפי מטה על coverslip כדי לאלץ את בועות אוויר ופתרון הרכבה עודף. המשך לניתוח תמונה. </li></ol> 8. לכידת תמונות וכימותי התאגדות BrdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות שנתפסו עם מיקרוסקופ אולימפוס BX61 פלורסנט ואולימפוס מצלמת CCD, גלגל לסנן-100x אובייקטיבי, אוטומטי ותוכנת Cytovision (יישומי הדמיה). BrdU הוא נתפס באמצעות מסנן FITC; צבעי כרומוזום (טקסס אדומה, Metasystems או Cytocell), בדיקות CEP (Vysis הספקטרום אורנג&#39;) BAC של (Cy3) ונתפסו באמצעות טקסס אדומה או Cy3 מסנן; DAPI הוא נתפס עם DAPI מסנן (ראה איורים 2 ו 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרומוזומים בודדים של עניין מזוהים עם BAC / CEP או בדיקות ספציפיות לכרומוזום צבע (איורים ו2B 3B). ניצולתוכנת Cytovision, כל כרומוזום של ריבית היא &quot;לחתוך החוצה&quot; מהתפשטות metaphase כמכלול, קו נמשכת דרך לאורכו של כרומוזום מזרוע קצרה לזרועו ארוכה (תרשימים ו2C 3C). תוכנת Cytovision משמשת לכימות פרופיל עוצמת פיקסל לאורכו של כל כרומוזום. תוכנת Cytovision מחשבת את השטח שעליו את הפיקסלים ומכמתת את עוצמת פיקסלים המיוצגים על ידי אותות BrdU או DAPI על כרומוזום אחד מבודד. עוצמת פיקסל הממוצעת המיוצגת על ידי כל כרומוזום אז מוכפל בשטח שנכבש על ידי אלה פיקסלים להשיג את המספר הכולל של פיקסלים (טבלה 1 ואיור 4). בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר להדמיה של האזורים משכפלים האחרונים של כרומוזומים. בהתאם לכך, הדפוס התאגד התאגדות BrdU מאפשר זיהוי של אזורים פעילים משכפלים של כרומוזומים, והבדלים בעיתוי שכפול בין chromosזוגות Ome נתפסים כהבדלים בדפוס פסים זה (איורים 2 ו 3). לבסוף, הבדלים אלו בדפוסים מחייבים ניתן להשוות את מפות עיתוי שכפול ידוע לכל כרומוזום 6,7, המאפשר לאומדן פרש העיתוי שהכפול בין כרומוזומים הומולוגיים או זרועות כרומוזום 4. לדוגמה, 2 של כרומוזום 6 באיור 3 א מציגים את הבדל בדפוס פסים&gt; 2 שעות בהשוואה לעיתוי השכפול הנורמלי של כרומוזום 6 4. בנוסף, הליך דומה לזה שתואר כאן כבר השתמש בהצלחה ללימודי עיתוי השכפול אסינכרוני בין כרומוזומי X הפעיל ואקטיבי 8,9. את כרומוזומי X הפעיל ולא הפעיל זוהה באמצעות צבעי כרומוזום X. תמונות נרכשו באמצעות שנינויות mFISH תוכנה (Vysis) ומספר הפיקסלים שנכבשו על ידי כרומוזומי X ואת מספר הפיקסלים שנכבשו על ידי fluorescently labeled BrdU היה אז מחושב באמצעות NIH תמונה <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">(http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html).</a> </li></ol> 9. ניק תרגום של BAC DNA לניאון תיוג (Vysis) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את תערובת החללית הבאה לצננתי צינור microfuge: 70 μl (4-DNA מיקרוגרם) בDH 2 O 10 μl .2 mM dUTP-כתום או ירוק 20 μl .1 mM dTTP הצפת 20 μl 10x ניק תרגום 40 NT dNTP של μl (מינוס dTTP) אנזים תרגום הכינוי μl 40 200 נפח כולל μl דגירה @ 16 ° CO / נ עצור תגובה על ידי חימום על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צ&#39;יל על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרז את ה-DNA עם אתנול על ידי הוספה הבאה לתמהיל הבדיקה: פתרון חללי 200 μl 48 μl M 3 NaOAc 160 Cot1DNA μl (0.25 מיקרוגרם / ul) 1200 100% EtOH μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספיןn קר ב12000 XG במשך 20 דקות. למזוג את EtOH. שטוף זמן 1 עם EtOH 70%. ספין כמו קודם. למזוג את EtOH. אוויר יבש רק עד מתאדה EtOH. Resuspend ב 40 μl DH 2 O לריכוז סופי של 100 ng / μl של BAC-DNA. </li></ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li>
<li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li>
<li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+translocations+with+delayed+replication%3A+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li>
<li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li>
<li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li>
<li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+element%28s%29+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li>
<li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+inactivation+of+rDNA+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li>
<li>Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman">http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman</a> (2006).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+checkpoint+response+to+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכנת ממרחי כרומוזום היא שלב קריטי להצלחת בדיקת שכפול עיתוי שתואר כאן. הכללתו של צעד מקדים colcemid לפני טיפול hypotonic עשויה לסייע בתדירות ובהפצה של תאי mitotic. אנחנו בדרך כלל לחשוף תאים לcolcemdi עבור 1-3 שעות לפני הקציר, ולהשתמש colcemid בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. עם זאת, הכללתו של צעד מקדים colcemid רשאי לשנות את אורכו של G2 וכתוצאה מכך עשוי לשנות את התזמון לכאורה שכפול והמצב של עיבוי הכרומוזומים 3. <p class="jove_content" style=";text-align:right;d...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> הרוש Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 מיקרוגרם / μl </td></tr><tr><td> ניק תרגום קיט </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> ספקטרום אורנג&#39; dUTP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> משתנה </td><td></td></tr><tr><td> חיץ הכלאת LSI / WCP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ הכלאת CEP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> כרומוזום פאיNTS </td><td> MetaSystems הקבוצה </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> אולימפוס BX61 מיקרוסקופ פלורסנט </td><td> אולימפוס </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת תוכנת הדמית מיקרוסקופ </td><td> יישומי הדמיה </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית </td><td> אולימפוס </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> במתכוני כלאה באתר פתרוני פוראמיד 70% Formamide/2x SSC 35 מ&quot;ל פוראמיד * (סיגמא) 10 המ&quot;ל SSC 10x 5 המ&quot;ל ד 2 H 2 0 pH ל -7.0 עם HCl (סיגמא) * חשוב להשתמש פוראמיד כי אוחסן ב -20 ° C. אחסון בטמפרטורת חדר ממושך יפיק חומצה פורמית והחומציות wחולה להיות נמוך מדי. 50% Formamide/2x SSC 25 פוראמיד מ&quot;ל (סיגמה) 10 המ&quot;ל SSC 10x 15 המ&quot;ל DH 2 O pH ל -7.0 עם HCl (סיגמא) 20x SSC, 4 L 702 גרם NaCl (סיגמא) 358 גרם Na ציטראט (סיגמא) DH 2 O לנפח PN מאגר [0.1 מ &#39;NaP0 4 0.1% NP_40 (סיגמא)] הפוך פתרון 0.1 מ &#39;כל אחד פוספט נתרן (המסנן לעקר ולאחסן ב500 aliquots מ&quot;ל). 0.1 מ &#39;Nah 2 P0 4, 1 ליטר 13.8 גרם לאא 2 P0 4 (סיגמא): DH 2 O לנפח 0.1 מ &#39;Nah 2 P0 4 1 ליטר </strאונג&gt; 14.2 גרם לאא 2 P0 4 (סיגמא) DH 2 O לנפח. PN: התאם את ה-pH של 0.1 מ &#39;Na 2 HP0 4 ל-pH 8.0 עם .1 M nah 2 P0 4. סנן לעקר ולהוסיף 1 מ&quot;ל של NP-40. PNM 50 מ&quot;ל 1.25 גר &#39;אבקת חלב ללא שומן (סיגמא) 25 מ&quot;ל PN חיץ (מתכון לעיל) מערבב לדקות 15-20 עם ערבוב מתמיד. ספין 2 פעמים ב 400 XG למשך 10 דקות. השתמש supernatant, ולוודא שלא להפריע חלבוני חלב זרזו. </td></tr></tbody></table>

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

שכפול הדנ&quot;א יונקים יוזם באתרים מרובים לאורך הכרומוזומים בזמנים שונים במהלך שלב S, בעקבות תכנית שכפולה של זמן. המפרט של עיתוי שכפול הוא חשב להיות תהליך דינמי מוסדר על ידי רמזי רקמות ספציפיות והתפתחותית המגיבים לשינויי epigenetic. עם זאת, המנגנונים המסדירים היכן ומתי שכפול הדנ&quot;א יוזם יחד הכרומוזומים נשארו הבינו היטב. הומולוגי כרומוזומים בדרך כלל לשכפל סינכרוני, עם זאת יש יוצאים מן הכלל בולט לכלל זה. לדוגמה, בתאי יונקים ממין נקבה אחד משני כרומוזומי X הופך מאוחר משכפל באמצעות תהליך המכונה איון X 1. יחד עם זה עיכוב בעיתוי שכפול, מוערך 2-3 שעות, הרוב המכריע של גנים הופכים השתיק תעתיק על כרומוזום X אחד. בנוסף, מוקד דיסקרטי cis טווח, ידוע כמרכז איון X, מסדיר תהליך איון X זה, לרבות האינדוקצית דואר של עיתוי שכפול מתעכב על כרומוזום X הפעיל כולו. בנוסף, שחלופי כרומוזום מסוימים הנמצאים בתאים סרטניים ותאים שנחשפו לקרינה מייננת להציג עיכוב משמעותי בעיתוי שכפול של&gt; 3 שעות שמשפיעה על כל כרומוזום 2,3. העבודה אחרונה מהמעבדה שלנו מצביעה על שיבוש זה של דיסקרטי cis-מתנהג תוצאת לוקוסים אוטוזומלית בפנוטיפ משכפל מאוחר מאוד המשפיע על 4 כרומוזום השלמים. מחקרים &#39;הנדסי כרומוזום&#39; נוספת מצביעים על כך ששחלופי כרומוזום מסוימים המשפיעים על תוצאת כרומוזומים שונות רבה בפנוטיפ הנורמלי זה שכפול עיתוי, מצביעים על כך שכל הכרומוזומים היונקים מכילים לוקוסים בדידים cis-הפועלים ששולטים עיתוי שכפול תקין של כרומוזומים בודדים 5. כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח כמותי של עיתוי שכפול כרומוזום בשילוב עם ניאון כלאה באתר. זהשיטה מאפשרת השוואה ישירה של עיתוי שכפול בין כרומוזומים הומולוגיים באותו התא, והותאמה מ 6. בנוסף, שיטה זו מאפשרת זיהוי חד המשמעי של שחלופי כרומוזומליות הקשורים לשינויים בעיתוי שכפול המשפיעים על כל כרומוזום. לשיטה זו יש יתרונות על פני מערך מייקרו תפוקה גבוה פתח לאחרונה או רצף פרוטוקולים שלא מבחינים בין האללים הומולוגיים להציג מחדש ובבטלו מחדש-כרומוזומים. בנוסף, בגלל השיטה המתוארת כאן מעריכה תאים בודדים, זה יכול לזהות שינויים בעיתוי שכפול כרומוזום בשחלופים בכרומוזומים שנמצאים רק בחלק מהתאים באוכלוסייה.

דוגמה לניתוח תזמון השכפול לכרומוזום אנושי 6 מוצגת באיור 2. תאים המכילים מחיקה של ASAR6 הגן 4, הממוקם ב6q16.1, נחשפו לBrdU במשך 5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד לדגים עם בדיקת כרומוזום 6 צבע (Vysis) וכן שילוב BrdU. שים לב שיש הבדל משמעותי בדפוס פסי BrdU בין 6 של שניים, שעולה בקנה אחד עם עיכוב בעיתוי שכפול של&gt; 2 שעות לאחד מכרומוזום 6 של [ראו סעיף 4 לעיתוי שכפול banding דפוס של כרומוזום 6 לפני המחיקה]. בנוסף, יש הבדל משמעותי בסכום הכולל של ...

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם ניאון<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים) כדי להעריך את עיתוי שכפול של כרומוזומים יונקים. טכניקה זו מאפשרת להשוואה הישירה של הכרומוזומים עצבו מחדש, ובטל מחדש-בתוך אותו התא.

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

גישה ניסיונית זו משלבת שילוב של BRDU עם היברידיזציה פלואורסצנטית בסיבוב שני (Fluorescence in situ hybridization), על מנת לנתח כמותית את תזמון השכפול של כרומוזומים של יונקים. ראשית, יש לשלב BRDU בתאים חיים ולאחר מכן לאסוף את כרומוזומי המטפאזה.לאחר מכן, בצעו DNA fish בשילוב עם סמירה רצופית של נוגדן BRDU כדי לזהות את הכרומוזומים המשכפלים הבודדים. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופיה פוטוغرافית כדי ללכוד תמונות של אותי ה-fish וההטמעה של BRDU בדמויות מיטוטיות בודדות. באמצעות תוכנת cyto vision, חשבו את השטח ואת העוצמה של הפיקסלים המיוצגים על ידי אותות ה-BRDU או ה-DPI בכל כרומוזום מבודד.התוצאות מאפשרות לכמת ולהשוות את השילוב של BRDU בכרומוזומים משוערים בודדים ובחולוזומים שלהם. מכיוון שהשיטה המתוארת כאן מעריכה תאים בודדים, היא מסוגלת לזהות שינויים בשעתון השכפול של ארגוני מחדש כרומוסומליים המופיעים רק בחלק קטן מהתאים באוכלוסייה, בהשוואה לפרוטוקולים של רצף DNA ומערכי מיקרו-מערכים (microarray) בעלי תפוקה גבוהה שפותחו לאחרונה. שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה בין כרומוזומים הומולוגים הנמצאים באותו תא.כמו כן, יש לה יכולת לזהות באופן חד-משמעי ארגוני מחדש של כרומוזומים המשפיעים על השכפול הכרומוזומלי. תזמון של כרומוזומים שלמים המדגים את הפרוצדורה יבוצע על ידי לסלי סמית', עובדת מחקר במעבדתי. זרעו את התאים בצפיפות של כ-70% בצלחת תרבית רקמות של 150 מילימטר, והניחו באינקובטור תאים למשך 24 שעות בטמפרטורה המתאימה.נקודות לפני הקצירה. יש להחליף את המצע במצע מלא טרי המכיל 10 µg/mL BRDU. משך הזמן שבו התאים יגודלו במצע עם BRDU ישתנה בהתאם לסוג התא ולמין.בדרך כלל, שלב G2 נמשך בין שעתיים לחמש שעות. הסר את מצע התרבית מהצלחת ושמור 10 milliliters בתוך מבחנה קונית לסנטריפוגה בנפח 15 milliliters. שטוף את התאים עם 10 milliliters של sine והסר את ה-sine שנותר באמצעות שאיבה בוואקום.לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטרים של 0.25% trypsin והדגרימו בטמפרטורת החדר עד שהתאים יתנתקו מהפלטה. קצרו את התאים והעבירו את הסספנזיה ל-10 מיליליטרים של המצע השמור. שקיעו את התאים על ידי צנטריפוגה, ושאבו את כל המצע למעט 0.5 מיליליטרים.כעת יש לסבב ולערבב את התאים היטב באמצעות פיפטה; כדי לגרום לנפיחות אוסמוטית של התאים, הוסיפו שלוש טיפות של potassium chloride בריכוז 75 millimolar המחומם ל-37 °C, וערבבו את תרחיף התאים באמצעות פיפטה. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters נוספים של תמיסה היפוטונית. כעת השלימו את הנפח הכולל של התמיסה ההיפוטונית ל-5 milliliters וערבבו באמצעות פיפטה.דגרו את תרחיף התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 עד 45 דקות, בהתאם לסוג התא. דגרו את המבחנות בנטייה כדי לשמור על התאים בתרחיף. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 400 ×g למשך 10 דקות.שאבו את כל הנוזל העליון למעט 0.5 millimeters והשתמשו בפיפט ערבוב כדי להחזיר בעדינות את משקע התאים למצב של סספנסיה. התאים הנפוחים אוסמוטית יהיו שבירים בשלב זה, ולכן יש להיזהר כדי לא לפגוע בממברנות הציטופלזמיות. לאחר מכן, הוסיפו שלוש טיפות של מקבע car noise וערבבו בעדינות.לאחר הוספה של 0.5 מיליליטרים נוספים של מקבע, הגדילו את נפח המקבע לחמישה מיליליטרים והעבירו בפיפטה עד לקבלת תרחיף תאים הומוגני. ניתן לשמר תאים מקובעים אלה בחושך בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. אספו את התאים המקובעים על ידי סנטריפוגציה, שאבו את המקבע והשעיו שוב את המשקע ב-10 נפחים של מקבע תוך שמירה על המיקרוסקופ קר על קרח רטוב.הטה את השקופית בזווית של כ-45 מעלות. הוסף את תרחיף התאים בטיפות כדי לפרוס את התרחיף. הצף את השקופית במקבע ונקז את העודפים.לאחר מכן, הנח את השקופית שטוחה על נייר סופג לייבוש באוויר. העריך את הדגימות לאיתור פריסות מי dividing (mitotic spreads) באמצעות מיקרוסקופ הפוך. הוסף שתי µL של RNase A בריכוז 10 µg/mL ב-2X SSC לכל שקופית והדגרה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.בצעו שלושה שלבי שטיפה של שלוש דקות בכל אחד באמצעות 2X SSC ב-pH 7.0 בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו דהידרטציה לדגימות באמצעות סדרת אתנול בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. ייבשו כל אחת מהדגימות באוויר בטמפרטורת החדר לתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה מקוררת.הוסיפו ארבעה מיקרוגרמים של נוקלאוטיד מסומן של תבנית DNA, בופר תרגום NIC בריכוז 10 X, תערובת DNTP ואנזים תרגום NIC. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 16 °C למשך לילה, ולאחר מכן חממו בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן קיררו על קרח למשך חמש דקות.כעת, כדי להשקיע את ה-DNA באתנול, הוסיפו 48 µL של נתרן אצטט בריכוז 3 M, 160 µL של cot-1 DNA בריכוז 0.25 µg/µL ו-1.2 mL של אתנול 100%. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 80°C- למשך 10 דקות עד ללילה; השקיעו את ה-DNA באמצעות סנטריפוגה ושטפו את המשקע באתנול 70%. השביו את גשושית ה-DNA המיובשת באוויר ב-40 µL של מים מזוקקים פעמיים, כדי להגיע לריכוז סופי של 100 ng/µL של DNA מסומן עבור ההיברידיזציה הסימולטנית בשיטת BAC-SEP. הכינו שני תערובתות (cocktails) נפרדות של גשושית המכילה cot-1 DNA, כפי שפורט בכתב היד המצורף.בצעו דנטורציה לתערובות הגשים (probe cocktails) בטמפרטורה של 75 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-cot 1D NA להיקשר לרצפים חוזרים. כעת, ערבבו את גש ה-back עם גש ה-S ביחס של שלושה לשניים, כך שיתקבלו 25 µL לכל דגימה.החליקו כדי לדנטור את הדגימות. טבלו את השקופיות ב-70% form amide ו-two XSSC בטמפרטורה של 72 °C והדגירו למשך שלוש דקות. ייבשו מיד את הדגימות באמצעות סדרת אתנול בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש דקות.ייבשו כל אחת מהדגימות באוויר בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות לפני השלמת הכנת הגשושית. השריגו את השקופיות על מחמם שקופיות בטמפרטורה של 45 °C. לאחר מכן, הוסיפו 25 µL מתערובת גשושית ה-back S.הנח בעדינות זכוכית כיסוי על כל שקופית ואטם את כל הקצוות בדבק גומי עבור שלב ההיברידיזציה. הדגר את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C בתא לח. בצע שלושה שטיפות לאחר ההיברידיזציה, למשך שלוש דקות כל אחת, ב-50% IDE 2X SSC pH 7.0 בטמפרטורה של 38 עד 40 °C.הטמפרטורה האופטימלית של השטיפות תלויה בגשש. אם קיימת היברידיזציה גבוהה של רקע, יש להעלות את טמפרטורת השטיפות. לעומת זאת, אם אות הגשש חלש ואין רקע, יש להפחית את טמפרטורת השטיפות.בצעו שטיפה אחת בבופר PN בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. לצורך גילוי BRDU, הוסיפו 200 µL של בופר חסימה PNM לכל שקופית. דגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה, ונקזו את השקופיות על נייר סופג.לאחר מכן, יש להוסיף 100 µL של נוגדן anti B-R-D-U-F-E מזווג בריכוז 50 µg/mL ולהדגיר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. יש לבצע שלושה שלבי שטיפה של שלוש דקות כל אחד בבופר PN בטמפרטורת החדר. יש להסיר את עודפי בופר ה-PN מכל שקופית.לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של תמיסת קיבוע dappy Antifa. כסו את השקף בנייר סופג והפעילו לחץ על זכוכית הכיסוי כדי להוציא בועות אוויר ועודפי תמיסת קיבוע. דגמו את התמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המחובר למצלמה מסוג CCD.באמצעות עדשה של 100x, גלגל מסננים אוטומטי ותוכנת CytoVision, דגמו את ה-BRDU באמצעות מסנן FITC, ואת צבעי הכרומוזומים (chromosome paints) וגששיים לסנטרומר באמצעות מסנן Cy3 או Texas Red. השתמשו בנוסף במסנן DAPI לצביעת הגרעינים. זהו את הכרומוזומים האינדיבידואליים הרלוונטיים באמצעות גששי CEP או גששי צבע ספציפיים לכרומוזום בתוכנת ה-CytoVision.גזרו כל כרומוזום רלוונטי מתוך פריסת המטאפאזה כשלמות. העתיקו והדביקו את תמונות הכרומוזומים של ה-DPI וה-FITZY לחלון חדש. בחרו בסמל הגרף בתפריט הכלים, המאפשר יצירת גרף המייצג את השטח והעוצמה של צביעות ה-Fitz וה-dappy לאורך כל כרומוזום בנפרד.פעולה זו מבוצעת על ידי שרטוט קו לאורך הכרומוזום, מהזרוע הקצרה לזרוע הארוכה. בתפריט הכלים, בחרו בסמל הנתונים והפיקו טבלה המציגה את השטח והעוצמה המחושבים עבור ZI ו-dpi. לאחר מכן, בחרו את אותות ה-ZI וה-DPI עבור הכרומוזומים הרלוונטיים.לאחר מכן, לחצו על כפתורי העוצמה (intensity) והשטח (area) המופיעים באייקון הטבלה. התוכנה תפיק מדידה מספרית של פיקסלים לאינץ' רבוע עבור כל אות. בשלב הבא, עוצמת הפיקסלים הממוצעת של כל כרומוזום מוכפלת בשטח שתפסו פיקסלים אלו.כדי לקבל את מספר הפיקסלים הכולל עבור הוויזואליזציה של אזורי השכפול המאוחרים ביותר של הכרומוסומים, יש להעריך את תבנית הפסים של שילוב BRDU באזורים המשכפלים באופן פעיל של הכרומוסומים. לאחר מכן, חשבו את ההבדלים בתזמון השכפול בין זוגות כרומוסומים על בסיס ההבדלים בתבנית הפסים של BRDU. הכרומוסומים בתאי יונקים משכפלים בהתאם לתוכנית זמנית, כאשר שכפול מוקדם ומאוחר מתרחשים בתחילת ובסוף של S-phase בהתאמה.שלב S טיפוסי בתאי יונקים נמשך שמונה עד 10 שעות, ושלב G2 נמשך בדרך כלל שעתיים עד חמש שעות. במערכת ניסויית זו, BRDU מתווסף לפרקי זמן הולכים וגדלים כדי לסמן את החלקים האחרונים של הכרומוזומים המשתכפלים; תאים אלו מכילים מחיקה של הגן האנושי ASAR6 הממוקם ב-6q16.1. לאחר טיפול של חמש שעות ב-BRDU, נאספו תאים מיטוטיים ועובדו לבדיקת שילוב BRDU וכשלובידציה פלואורסצנטית של DNA (FISH) באמצעות פרוב צבע לכרומוזום 6; שני כרומוזומי 6 מראים שלושה סימונים פלואורסצנטיים.ההבדל המשמעותי בתבנית הפסים של BRDU עקבי עם העיכוב בזמני השכפול של למעלה משעתיים באחד מכרומוזומי 6. תוכנת CytoVision מציגה את פרופילי עוצמת האות השונים עבור DPI ו-BRDU בשני כרומוזומי 6, המעידים על שכפול אסינכרוני. בנוסף, קיים הבדל משמעותי בכמות הכוללת של שילוב BRDU בהשוואה לניתוח דומה של צביעת DPI.הכללה של גשש אחורי (back probe) המכיל את הגן האנושי AR six מדגישה את כרומוזום 6 הבודד הכולל מחיקה בזרוע הארוכה שלו בתא זה. באופן מעניין, קיימת השתלבות אינטנסיבית יותר של BRDU ותבנית פסיים מורחבת יותר של השתלבות BRDU מאשר בכרומוזום 6 שאינו ED. תפוצות מיטוטיות משבעה תאים שונים עובדו לצורך כימות הפרש תזמון השכפול בין כרומוזומי 6.רמות ה-BRDU מראות הבדל הגדול מפי שניים בערכי הפיקסלים הכוללים בין כרומוזום 6 עם מחיקה לבין כרומוזום 6 ללא ED. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו כהלכה בתוך שלושה ימים. אנו מקווים שכעת יש לכם הבנה טובה של אופן מדידת השכפול ותזמון של כרומוזומים הומולוגיים השוכנים באותו תא, וכיצד לזהות באופן חד-משמעי ארגון מחדש של כרומוזומים המתואם עם שינויים בשכפול.תזמון של כרומוזומים שלמים.

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: שומאכר, ד., וסוגארד-אנדרסן, ל. הדמיית תאים חיים פלואורסצנטיים של מחזור התאים הצמחיים המלא של החיידק החברתי המתפתח באיטיות Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיית תאים חיים למעקב אחר מקורות כרומוזומים מסומנים פלואורסצנטית במהלך חלוקת תא חיידקים. הוא לוכד את דינמיקת הפרדת הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה ופלואורסצנציה.

הדמיית טיים-לאפס של הפרדת כרומוזומים בחיידקים מסומנים פלואורסצנטית

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

פיתחנו פרוטוקול פלואורסצנטי  ספציפי לגדיל (FISH) המותאם אישית בקלות בשילוב עם אימונופלואורסצנטיות. זה מאפשר בחינה מפורטת של דינמיקת RNA עם תובנה בו-זמנית לגבי מבנה הכרומטין, הארגון הגרעיני וויסות השעתוק ברמת התא הבודד.

המהיר פלורסנט באתר הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לביצוע הכלאה של DNA פלואורסצנטי באתרו (DNA ISH) כדי לדמיין רצפים הטרוכרומטיים חוזרים ונשנים על כרומוזומים המותקנים בשקופיות. השיטה דורשת ריאגנטים מינימליים והיא רב-תכליתית לשימוש עם בדיקות קצרות או ארוכות, רקמות שונות וזיהוי עם אותות פלואורסצנטיים או שאינם מבוססי פלואורסצנטיות.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

אנו מתארים כאן מערכת המשתמשת בבלוק חלבון in vivo ספציפי לאתר, הפיך כדי לעכב ולמוטט מזלגות שכפול ב-Escherichia coli. הקמת בלוק השכפול מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז ניטרלי-ניטרלי משמשת להדמיית חומרי ביניים לשכפול.

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב<i&gt; E. coli</i&gt; באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

כתב יד זה מציג שיטה מפורטת ליצירת X-כרומוזום הזרוע המחקרים וכל ביצוע קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) לבדוק את מצבה של אחותך כרומטידה לכידות ב- prometaphase, מפה של עצרתי  דרוזופילה oocytes. פרוטוקול זה מתאים לקביעת אם הזרוע meiotic לכידות הוא שלם או קטועים ב שונים אחרים.

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

פרוטוקול זה מתאר יישום של פלואורסצנטיות מולקולה אחת בהכלאה situ (smFISH) כדי למדוד את הקינטיות vivo של סינתזה mRNA והשפלה.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

פרוטוקול זה ממחיש מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים על כרומטין.  היווצרות של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) גוף גרעיני על טלומרים עם דימריזרים כימיים הוא הודגם. צמיחה טיפה, פירוק, לוקליזציה והרכב מנוטרים עם הדמיית תאים חיים, אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).

חלבון המושרה בדמריזציה כימית מתנדם בטלומרים

פרוטוקול זה מציג טכניקה למיפוי ברזולוציה גבוהה של אתרי שכפול בכרומטין שהשתמר מבנית במקום המשתמש בשילוב של תיוג EdU-streptavidin-Nanogold טרום הטמעה וכרוממט.

הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית

למדו שיטה לניתוח כמותי של עיתוי שכפול כרומוזומים באמצעות שילוב BrdU ו-FISH. השיטה מאפשרת השוואה ישירה בין כרומוזומים מסודרים מחדש ללא מסודרים באותה התא, ומספקת תובנות לגבי יציבות גנומית.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט

גלה סרטונים נוספים