עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט

גישה ניסיונית זו משלבת שילוב של BRDU עם היברידיזציה פלואורסצנטית בסיבוב שני (Fluorescence in situ hybridization), על מנת לנתח כמותית את תזמון השכפול של כרומוזומים של יונקים. ראשית, יש לשלב BRDU בתאים חיים ולאחר מכן לאסוף את כרומוזומי המטפאזה.

לאחר מכן, בצעו DNA fish בשילוב עם סמירה רצופית של נוגדן BRDU כדי לזהות את הכרומוזומים המשכפלים הבודדים. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופיה פוטוغرافית כדי ללכוד תמונות של אותי ה-fish וההטמעה של BRDU בדמויות מיטוטיות בודדות. באמצעות תוכנת cyto vision, חשבו את השטח ואת העוצמה של הפיקסלים המיוצגים על ידי אותות ה-BRDU או ה-DPI בכל כרומוזום מבודד.

התוצאות מאפשרות לכמת ולהשוות את השילוב של BRDU בכרומוזומים משוערים בודדים ובחולוזומים שלהם. מכיוון שהשיטה המתוארת כאן מעריכה תאים בודדים, היא מסוגלת לזהות שינויים בשעתון השכפול של ארגוני מחדש כרומוסומליים המופיעים רק בחלק קטן מהתאים באוכלוסייה, בהשוואה לפרוטוקולים של רצף DNA ומערכי מיקרו-מערכים (microarray) בעלי תפוקה גבוהה שפותחו לאחרונה. שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה בין כרומוזומים הומולוגים הנמצאים באותו תא.

כמו כן, יש לה יכולת לזהות באופן חד-משמעי ארגוני מחדש של כרומוזומים המשפיעים על השכפול הכרומוזומלי. תזמון של כרומוזומים שלמים המדגים את הפרוצדורה יבוצע על ידי לסלי סמית', עובדת מחקר במעבדתי. זרעו את התאים בצפיפות של כ-70% בצלחת תרבית רקמות של 150 מילימטר, והניחו באינקובטור תאים למשך 24 שעות בטמפרטורה המתאימה.

נקודות לפני הקצירה. יש להחליף את המצע במצע מלא טרי המכיל 10 µg/mL BRDU. משך הזמן שבו התאים יגודלו במצע עם BRDU ישתנה בהתאם לסוג התא ולמין.

בדרך כלל, שלב G2 נמשך בין שעתיים לחמש שעות. הסר את מצע התרבית מהצלחת ושמור 10 milliliters בתוך מבחנה קונית לסנטריפוגה בנפח 15 milliliters. שטוף את התאים עם 10 milliliters של sine והסר את ה-sine שנותר באמצעות שאיבה בוואקום.

לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטרים של 0.25% trypsin והדגרימו בטמפרטורת החדר עד שהתאים יתנתקו מהפלטה. קצרו את התאים והעבירו את הסספנזיה ל-10 מיליליטרים של המצע השמור. שקיעו את התאים על ידי צנטריפוגה, ושאבו את כל המצע למעט 0.5 מיליליטרים.

כעת יש לסבב ולערבב את התאים היטב באמצעות פיפטה; כדי לגרום לנפיחות אוסמוטית של התאים, הוסיפו שלוש טיפות של potassium chloride בריכוז 75 millimolar המחומם ל-37 °C, וערבבו את תרחיף התאים באמצעות פיפטה. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters נוספים של תמיסה היפוטונית. כעת השלימו את הנפח הכולל של התמיסה ההיפוטונית ל-5 milliliters וערבבו באמצעות פיפטה.

דגרו את תרחיף התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 עד 45 דקות, בהתאם לסוג התא. דגרו את המבחנות בנטייה כדי לשמור על התאים בתרחיף. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 400 ×g למשך 10 דקות.

שאבו את כל הנוזל העליון למעט 0.5 millimeters והשתמשו בפיפט ערבוב כדי להחזיר בעדינות את משקע התאים למצב של סספנסיה. התאים הנפוחים אוסמוטית יהיו שבירים בשלב זה, ולכן יש להיזהר כדי לא לפגוע בממברנות הציטופלזמיות. לאחר מכן, הוסיפו שלוש טיפות של מקבע car noise וערבבו בעדינות.

לאחר הוספה של 0.5 מיליליטרים נוספים של מקבע, הגדילו את נפח המקבע לחמישה מיליליטרים והעבירו בפיפטה עד לקבלת תרחיף תאים הומוגני. ניתן לשמר תאים מקובעים אלה בחושך בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. אספו את התאים המקובעים על ידי סנטריפוגציה, שאבו את המקבע והשעיו שוב את המשקע ב-10 נפחים של מקבע תוך שמירה על המיקרוסקופ קר על קרח רטוב.

הטה את השקופית בזווית של כ-45 מעלות. הוסף את תרחיף התאים בטיפות כדי לפרוס את התרחיף. הצף את השקופית במקבע ונקז את העודפים.

לאחר מכן, הנח את השקופית שטוחה על נייר סופג לייבוש באוויר. העריך את הדגימות לאיתור פריסות מי dividing (mitotic spreads) באמצעות מיקרוסקופ הפוך. הוסף שתי µL של RNase A בריכוז 10 µg/mL ב-2X SSC לכל שקופית והדגרה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.

בצעו שלושה שלבי שטיפה של שלוש דקות בכל אחד באמצעות 2X SSC ב-pH 7.0 בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו דהידרטציה לדגימות באמצעות סדרת אתנול בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. ייבשו כל אחת מהדגימות באוויר בטמפרטורת החדר לתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה מקוררת.

הוסיפו ארבעה מיקרוגרמים של נוקלאוטיד מסומן של תבנית DNA, בופר תרגום NIC בריכוז 10 X, תערובת DNTP ואנזים תרגום NIC. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 16 °C למשך לילה, ולאחר מכן חממו בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן קיררו על קרח למשך חמש דקות.

כעת, כדי להשקיע את ה-DNA באתנול, הוסיפו 48 µL של נתרן אצטט בריכוז 3 M, 160 µL של cot-1 DNA בריכוז 0.25 µg/µL ו-1.2 mL של אתנול 100%. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 80°C- למשך 10 דקות עד ללילה; השקיעו את ה-DNA באמצעות סנטריפוגה ושטפו את המשקע באתנול 70%. השביו את גשושית ה-DNA המיובשת באוויר ב-40 µL של מים מזוקקים פעמיים, כדי להגיע לריכוז סופי של 100 ng/µL של DNA מסומן עבור ההיברידיזציה הסימולטנית בשיטת BAC-SEP. הכינו שני תערובתות (cocktails) נפרדות של גשושית המכילה cot-1 DNA, כפי שפורט בכתב היד המצורף.

בצעו דנטורציה לתערובות הגשים (probe cocktails) בטמפרטורה של 75 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-cot 1D NA להיקשר לרצפים חוזרים. כעת, ערבבו את גש ה-back עם גש ה-S ביחס של שלושה לשניים, כך שיתקבלו 25 µL לכל דגימה.

החליקו כדי לדנטור את הדגימות. טבלו את השקופיות ב-70% form amide ו-two XSSC בטמפרטורה של 72 °C והדגירו למשך שלוש דקות. ייבשו מיד את הדגימות באמצעות סדרת אתנול בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש דקות.

ייבשו כל אחת מהדגימות באוויר בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות לפני השלמת הכנת הגשושית. השריגו את השקופיות על מחמם שקופיות בטמפרטורה של 45 °C. לאחר מכן, הוסיפו 25 µL מתערובת גשושית ה-back S.

הנח בעדינות זכוכית כיסוי על כל שקופית ואטם את כל הקצוות בדבק גומי עבור שלב ההיברידיזציה. הדגר את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C בתא לח. בצע שלושה שטיפות לאחר ההיברידיזציה, למשך שלוש דקות כל אחת, ב-50% IDE 2X SSC pH 7.0 בטמפרטורה של 38 עד 40 °C.

הטמפרטורה האופטימלית של השטיפות תלויה בגשש. אם קיימת היברידיזציה גבוהה של רקע, יש להעלות את טמפרטורת השטיפות. לעומת זאת, אם אות הגשש חלש ואין רקע, יש להפחית את טמפרטורת השטיפות.

בצעו שטיפה אחת בבופר PN בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. לצורך גילוי BRDU, הוסיפו 200 µL של בופר חסימה PNM לכל שקופית. דגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה, ונקזו את השקופיות על נייר סופג.

לאחר מכן, יש להוסיף 100 µL של נוגדן anti B-R-D-U-F-E מזווג בריכוז 50 µg/mL ולהדגיר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. יש לבצע שלושה שלבי שטיפה של שלוש דקות כל אחד בבופר PN בטמפרטורת החדר. יש להסיר את עודפי בופר ה-PN מכל שקופית.

לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של תמיסת קיבוע dappy Antifa. כסו את השקף בנייר סופג והפעילו לחץ על זכוכית הכיסוי כדי להוציא בועות אוויר ועודפי תמיסת קיבוע. דגמו את התמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המחובר למצלמה מסוג CCD.

באמצעות עדשה של 100x, גלגל מסננים אוטומטי ותוכנת CytoVision, דגמו את ה-BRDU באמצעות מסנן FITC, ואת צבעי הכרומוזומים (chromosome paints) וגששיים לסנטרומר באמצעות מסנן Cy3 או Texas Red. השתמשו בנוסף במסנן DAPI לצביעת הגרעינים. זהו את הכרומוזומים האינדיבידואליים הרלוונטיים באמצעות גששי CEP או גששי צבע ספציפיים לכרומוזום בתוכנת ה-CytoVision.

גזרו כל כרומוזום רלוונטי מתוך פריסת המטאפאזה כשלמות. העתיקו והדביקו את תמונות הכרומוזומים של ה-DPI וה-FITZY לחלון חדש. בחרו בסמל הגרף בתפריט הכלים, המאפשר יצירת גרף המייצג את השטח והעוצמה של צביעות ה-Fitz וה-dappy לאורך כל כרומוזום בנפרד.

פעולה זו מבוצעת על ידי שרטוט קו לאורך הכרומוזום, מהזרוע הקצרה לזרוע הארוכה. בתפריט הכלים, בחרו בסמל הנתונים והפיקו טבלה המציגה את השטח והעוצמה המחושבים עבור ZI ו-dpi. לאחר מכן, בחרו את אותות ה-ZI וה-DPI עבור הכרומוזומים הרלוונטיים.

לאחר מכן, לחצו על כפתורי העוצמה (intensity) והשטח (area) המופיעים באייקון הטבלה. התוכנה תפיק מדידה מספרית של פיקסלים לאינץ' רבוע עבור כל אות. בשלב הבא, עוצמת הפיקסלים הממוצעת של כל כרומוזום מוכפלת בשטח שתפסו פיקסלים אלו.

כדי לקבל את מספר הפיקסלים הכולל עבור הוויזואליזציה של אזורי השכפול המאוחרים ביותר של הכרומוסומים, יש להעריך את תבנית הפסים של שילוב BRDU באזורים המשכפלים באופן פעיל של הכרומוסומים. לאחר מכן, חשבו את ההבדלים בתזמון השכפול בין זוגות כרומוסומים על בסיס ההבדלים בתבנית הפסים של BRDU. הכרומוסומים בתאי יונקים משכפלים בהתאם לתוכנית זמנית, כאשר שכפול מוקדם ומאוחר מתרחשים בתחילת ובסוף של S-phase בהתאמה.

שלב S טיפוסי בתאי יונקים נמשך שמונה עד 10 שעות, ושלב G2 נמשך בדרך כלל שעתיים עד חמש שעות. במערכת ניסויית זו, BRDU מתווסף לפרקי זמן הולכים וגדלים כדי לסמן את החלקים האחרונים של הכרומוזומים המשתכפלים; תאים אלו מכילים מחיקה של הגן האנושי ASAR6 הממוקם ב-6q16.1. לאחר טיפול של חמש שעות ב-BRDU, נאספו תאים מיטוטיים ועובדו לבדיקת שילוב BRDU וכשלובידציה פלואורסצנטית של DNA (FISH) באמצעות פרוב צבע לכרומוזום 6; שני כרומוזומי 6 מראים שלושה סימונים פלואורסצנטיים.

ההבדל המשמעותי בתבנית הפסים של BRDU עקבי עם העיכוב בזמני השכפול של למעלה משעתיים באחד מכרומוזומי 6. תוכנת CytoVision מציגה את פרופילי עוצמת האות השונים עבור DPI ו-BRDU בשני כרומוזומי 6, המעידים על שכפול אסינכרוני. בנוסף, קיים הבדל משמעותי בכמות הכוללת של שילוב BRDU בהשוואה לניתוח דומה של צביעת DPI.

הכללה של גשש אחורי (back probe) המכיל את הגן האנושי AR six מדגישה את כרומוזום 6 הבודד הכולל מחיקה בזרוע הארוכה שלו בתא זה. באופן מעניין, קיימת השתלבות אינטנסיבית יותר של BRDU ותבנית פסיים מורחבת יותר של השתלבות BRDU מאשר בכרומוזום 6 שאינו ED. תפוצות מיטוטיות משבעה תאים שונים עובדו לצורך כימות הפרש תזמון השכפול בין כרומוזומי 6.

רמות ה-BRDU מראות הבדל הגדול מפי שניים בערכי הפיקסלים הכוללים בין כרומוזום 6 עם מחיקה לבין כרומוזום 6 ללא ED. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו כהלכה בתוך שלושה ימים. אנו מקווים שכעת יש לכם הבנה טובה של אופן מדידת השכפול ותזמון של כרומוזומים הומולוגיים השוכנים באותו תא, וכיצד לזהות באופן חד-משמעי ארגון מחדש של כרומוזומים המתואם עם שינויים בשכפול.

תזמון של כרומוזומים שלמים.